崔國倩，項艷，曲曉洋，相萍萍，朱粉霞，謝亞萍

(南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點實驗室，江蘇 南京 210028)

格雷夫斯病(Graves diseases，GD)，亦稱彌漫性毒性甲狀腺腫，是一種體內(nèi)甲狀腺激素分泌增多的自身免疫性代謝疾病[1]，以彌漫性甲狀腺腫和分泌功能亢進為主要特征，為甲狀腺功能亢進癥(簡稱甲亢)最常見的類型，約占甲亢的85%[2]。近年來，該病呈患病率逐年增多和起病年輕化的趨勢[3-5]，還與許多潛在的致命疾病如心臟衰竭、心肌梗死、中風等密切相關，甚至會增加自殺及全因死亡風險[6-8]。

中醫(yī)根據(jù)GD的臨床癥狀，可將其歸屬于“癭氣”和“癭病”的范疇。關于GD的發(fā)病病機，雖各方醫(yī)家持有不同觀點，但多認為肝郁及陰虛為其主要病因[9]。臨床表現(xiàn)主要以臟腑氣血功能失調(diào)、肝氣郁結、經(jīng)脈氣機阻遏，內(nèi)郁日久而生痰化火、耗損陰津，最終痰氣郁結交互阻于頸項而發(fā)癭瘤[2]。

GD的臨床治療主要包括抗甲狀腺藥物(Antithyroid drugs，ATDs)、放射性治療和手術治療，但普遍存在緩解率低、復發(fā)率高、長期療效不理想、并發(fā)癥多等問題[10]。為此，尋求更有效的治療方法和藥物迫在眉睫。

瀉火消癭方是江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院應用多年的臨床協(xié)定經(jīng)驗方，其組成為龍膽、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母及穿山龍[11]，是在龍膽瀉肝湯的基礎上化裁凝練而成，具有清肝瀉火、滋陰寧心的功效。在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方有助于GD患者甲狀腺功能迅速恢復，提高疾病恢復率，減少ATDs的應用[12]，但其治療GD的藥效物質基礎和具體機制并不清楚，有待進一步闡明。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，通過網(wǎng)絡藥理學篩選、預測和查找瀉火消癭方的活性化學成分和作用靶點，構建“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡、靶點蛋白相互作用(PPI)、靶點功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡，進而用分子對接進行驗證，揭示瀉火消癭方治療GD的藥效物質基礎和作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)(圖1)。

圖1 研究思路

1 材料與方法

1.1 瀉火消癭方中化學成分的收集

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com)和CNKI數(shù)據(jù)庫(https://www.cnki.net/)，收集瀉火消癭方中龍膽草、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母、穿山龍7味藥材的化學成分。以口服吸收利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%，藥物相似性(Drug likeness，DL)≥0.18作為參數(shù)進行篩選，獲取瀉火消癭方的化學成分數(shù)據(jù)集。進而通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得每個化合物的2D結構集；再使用Chem3D 19.0將其轉化成mol2文件。利用Discovery Studio(DS)2016軟件對瀉火消癭方中化學成分的3D結構進行預處理，從而生成瀉火消癭方中化學成分的3D結構數(shù)據(jù)庫。

1.2 瀉火消癭方化學成分治療GD的潛在作用靶點篩選

基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(www.swisstargetprediction.ch/)，以Probability值>0.5為參數(shù)篩選靶點，同時結合DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn)提供的靶點信息，反向預測瀉火消癭方中化學成分所作用的潛在靶點。將各個數(shù)據(jù)庫的預測結果取并集，并刪除重復結果，最終獲得瀉火消癭方中化學成分的作用靶點集。

以“Graves diseases”為關鍵詞，在TTD(http://bidd.nus.edu.sg/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中搜索獲得GD疾病相關靶點集。

將以上篩選出的瀉火消癭方化學成分作用靶點集，與尋獲的GD相關疾病靶點集取交集，即獲得瀉火消癭方化學成分治療GD的潛在作用靶點集。通過UniProt數(shù)據(jù)庫將交集靶點規(guī)范為人源(Homo Sapiens)的標準基因，作為靶點標準化名稱。

1.3 “藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡、PPI網(wǎng)絡的構建

標識以上靶點集對應屬性，導入Cytoscape3.6.1構建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡。再將瀉火消癭方中化學成分的靶點蛋白導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種選擇“Homo Sapiens”，構建PPI網(wǎng)絡。

1.4 靶點通路注釋分析

為進一步分析瀉火消癭方化學成分治療GD的潛在作用靶點集的基因功能以及在信號通路中的作用，將其官方簡稱上傳到Matescape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)，設定閾值P<0.01，同時Background選擇“Homo Spanies”，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉化操作，分別進行蛋白的GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并對富集分析結果進行可視化處理[13]。

1.5 關鍵靶點分子對接驗證

利用DS 2016軟件構建關鍵靶點的分子對接模型，進而與瀉火消癭方中篩選出的主要活性化合物，進行分子對接，分析對接結果。并與GD陽性藥分子比較，驗證網(wǎng)絡分析結果的可靠性。首先在PDB數(shù)據(jù)庫下載瀉火消癭方活性化學成分治療GD關鍵靶點的蛋白晶體結構，選擇人源受體、解析度小于2.5 ?并具有配體的蛋白復合物，以保證對接的精度。采用DS 2016中CleanProtein工具對蛋白進行預處理，根據(jù)PDB晶體原配體的空間位置定義活性口袋，Conformation method參數(shù)設置為“Best”，Docking preferences參數(shù)設置為“High quality”，其余參數(shù)為默認。將原配體抽出后重新對接到蛋白的活性口袋中，根據(jù)對接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差(RMSD)大小判斷對接程序參數(shù)設置的合理性以及對該晶體復合物的實用性，一般認為當RMSD≤2 ?時說明分子對接模型能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結合模式，對接結果有較高的可靠性[14]。再將瀉火消癭方中潛在活性成分及抗GD陽性藥分子導入DS 2016中進行分子對接，計算對接打分值(-CDOCKER ENERGY)。

當-CDOCKER ENERGY值高于原配體時，可認為成分與靶點具有較高的結合活性，以此作為標準對分子對接結果進行評價，并與陽性藥分子的-CDOCKER ENERGY值對比。

2 結果

2.1 化合物及靶蛋白篩選結果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到多個化合物(符合條件OB≥20%，DL≥0.18)，其中龍膽含有17個成分，夏枯草含有16個成分，黃芩含有36個成分，百合含有9個成分，知母含有15個成分以及穿山龍含有4個成分成分。對于生地黃，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫不能檢索到其化合物，我們通過查閱文獻，得到生地黃中的化學成分[15-17]，進而在TCMSP網(wǎng)站中查看其OB值和DL值，最終有7個化學成分符合條件，因此，選擇這7個化合物作為生地黃的主要成分。知母中的芒果苷和知母皂苷BⅡ是2020年版《中國藥典》中規(guī)定的指標性成分，但是在TCMSP網(wǎng)站中未檢索到芒果苷的OB值和DL值，檢索到知母皂苷BⅡ的OB值和DL值分別為3.11和0.04，因其比較重要，亦將其添加上[18]。去掉7個重復成分(齊墩果酸、異葒草素、β-谷甾醇、山柰酚、西托糖苷、植物甾醇和豆甾醇葡萄糖苷)。因此，共確定瀉火消癭方化學成分92個。

收集到的化學成分較多，因此對其進行一個分類分析。圖2的圓環(huán)圖表明，瀉火消癭方中化學成分主要集中在黃酮類，其次分別是萜類、甾體和生物堿等。

圖2 瀉火消癭方中化學成分的主要結構類型

2.2 瀉火消癭方化學成分治療GD潛在作用靶點篩選結果

在DrugBank、PharmMapper及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫上傳92個化學成分結構信息，獲取其作用靶點，將3個數(shù)據(jù)庫獲得的人源靶點進行匯總并去除重復靶點，最終獲得與瀉火消癭方化學成分相關的人源靶點1 154個。

以“Graves diseases”為關鍵詞，利用TTD、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫對靶點進行檢索，去重以后共獲得GD相關靶點1 467個。

將瀉火消癭方中化學成分作用的1 154個潛在作用靶點映射到1 467個GD靶點集中，最終獲得瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點為227個(圖3)。其中君藥龍膽化學成分共占154個靶點，臣藥夏枯草和黃芩分別占121、160個靶點，佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個靶點。

圖3 瀉火消癭方反向找靶及治療GD潛在作用靶點研究

2.3 構建“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡圖

借用Cytoscape構建網(wǎng)絡圖，可以直觀顯示7味中藥成分和靶點的關系及其重要性。如圖4所示，圖中共有326個節(jié)點，2 924條網(wǎng)絡。度值(Degree)是指連接該節(jié)點的邊的數(shù)量，連接該點的邊越多，度值越大，說明與該點相關的網(wǎng)絡越復雜[13]。在軟件中設置節(jié)點大小與顏色反映Degree的變化，節(jié)點越大、顏色越深，則Degree越大，從而構建瀉火消癭方對GD的潛在治療靶點網(wǎng)絡。

從圖4可看出，成分中Degree最大的是植物甾醇(E1，Degree=132)，其次是西托糖苷(D1，Degree=120)、β-谷甾醇(B1，Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(F1，Degree=80)、山柰酚(C1，Degree=72)、齊墩果酸(A1，Degree=68)和異葒草素(A2，Degree=65)，均為重復成分。以Degree為依據(jù)進行靶點排序，前15位靶點分別為CA2、CA1、ESR2、MET、EGFR、SRC、FLT3、PTGS2、ESR1、ABCB1、IGF1R、MMP9、MMP3、PIK3CG、NOX4。

圖4 瀉火消癭方“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡圖

2.4 構建PPI網(wǎng)絡

將篩選出的227個靶點導入STRING平臺構建PPI表。利用Cytoscape進行PPI網(wǎng)絡分析，同時利用Cytoscape模塊分析功能進行聚類分析，從而得到最佳模塊。如圖5所示，將最佳功能模塊分為模塊一(MCODE-1)、模塊二(MCODE-2)、模塊三(MCODE-3)、模塊四(MCODE-4)、模塊五(MCODE-5)、模塊六(MCODE-6)。

圖5 瀉火消癭方干預GD的PPI網(wǎng)絡圖

網(wǎng)絡中PPI靶點有227個，2 935條邊代表了蛋白之間相互作用關系。通過10種計算方法(MCC、Degree、MNC、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress)，選出各方法計算出的前50位靶點，并取其交集，分別是EGFR、SRC、JUN、HSP90AA1、TP53、HSPA1A、MAPK3、GRB2、STAT3、ESR1、MAPK14、PIK3R1、CTNNB1、HPSAS、HDAC1、PARP1、HDAC2、CCND1，推測以上18個靶點可能是瀉火消癭方治療GD的關鍵靶點。

2.5 模塊化分析

再將獲得的227個瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點導入到Metascape數(shù)據(jù)庫，應用分子復合物檢測(MCODE)算法來識別PPI網(wǎng)絡，按照P值將PPI網(wǎng)絡劃分得到最佳功能模塊，具體結果如圖6。

圖6 PPI模塊分析

其中MCODE-1為圖7中的紅色節(jié)點，主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)；MCODE-2為圖7中的藍色節(jié)點，主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；MCODE-3為圖7中綠色節(jié)點，主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)；MCODE-4為圖7中紫色節(jié)點，主要參與甲型流感(Influenza A)；MCODE-5為圖7中橙色節(jié)點，主要參與胰島素抵抗(Insulin resistance)、mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)；MCODE-6為圖7中黃色節(jié)點，主要參與TNF信號通路(TNF signaling pathway)。

圖7 PPI網(wǎng)絡

2.6 靶蛋白生物分析結果

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對瀉火消癭方與GD交集靶點進行KEGG富集分析和GO富集分析，獲得靶基因參與的通路和生物過程。結果顯示，通過對成分靶蛋白進行生物分析,共得到KEGG通路192條(P<0.05)，根據(jù)通路P值，結合生物學信息，選取P值相對較小且靶點富集的20條生物學過程。

以KEGG數(shù)據(jù)庫中富集得到的通路信息繪制KEGG通路氣泡圖，結果見圖8。發(fā)現(xiàn)癌癥通路(Pathways in cancer)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)、利什曼病(Leishmaniasis)、人T細胞白血病病毒1感染(Human T-cell leukemia virus 1 infection)等生物學過程，在瀉火消癭方治療GD中發(fā)揮重要作用。

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

將KEGG富集結果與瀉火消癭方“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡圖進行結合，構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，結果如圖9所示，其中粉紫色正方形代表信號通路，大小代表-logP值。

圖9 瀉火消癭方成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖

GO功能富集分析得到GO條目2 385個(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目1 988個，細胞組成(CC)條目255個，分子功能(MF)條目142個，選取P值相對較小且靶點富集的20條BP條目繪制GO條目柱狀圖，如圖10所示。BP富集到的條目主要為細胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對外部刺激反應的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對有機環(huán)狀化合物的細胞應答(Cellular response to organic cyclic compound)、MAPK級聯(lián)反應的調(diào)控(Regulation of MAPK cascade)、對氮化合物的細胞應答(Cellular response to nitrogen compound)、白細胞與細胞黏附(Leukocyte cell-cell adhesion)、循環(huán)系統(tǒng)進程(Circulatory system process)等；CC主要富集到膜筏(Membrane raft)、膜面(Side of membrane)、細胞的頂端部分(Apical part of cell)、受體復合體(Receptor complex)、囊泡腔(Vesicle lumen)、溶泡(Lytic vacuole)、黑素體(Melanosome)等；MF主要富集到激酶結合(Kinase binding)、蛋白激酶活性(Protein kinase activity)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、趨化因子結合(Chemokine binding)、蛋白質結構域特異性結合(Protein domain specific binding)、蛋白質酪氨酸激酶活性(Protein tyrosine kinase activity)、脂質結合(Lipid binding)等。

圖10 GO分析結果

2.7 關聯(lián)性分析

將Metascape數(shù)據(jù)庫與DisGeNET數(shù)據(jù)庫進行連接，采用文本挖掘技術對疾病、復雜疾病和環(huán)境性疾病進行了相關性分析?；蚪M中的所有基因均已用作富集背景，收集P<0.01，最小計數(shù)為3和富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計數(shù)與偶然預期的計數(shù)之間的比率)的術語，并根據(jù)其成員相似度將其分組。

結果如圖11所示，從圖中可看出上述篩出的瀉火消癭方的227個靶點與GD具有緊密的關聯(lián)性，GD排在首位，之后依次為腹主動脈瘤(Aortic aneurysm，abdominal)、心肌缺血(Myocardial ischemia)、實驗性糖尿病(Diabetes mellitus，experimental)、肺部疾病(Lung diseases)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy)等。此可證明篩出的227個靶點與其他疾病靶點具有重合靶點，可推測GD與其他疾病具有并發(fā)關系。GD病癥常伴有心血管功能紊亂、呼吸功能異常、肝功能損害等表現(xiàn)，特殊情況主要包括Graves眼病、甲亢性心臟病以及周期性麻痹等[2]，以上現(xiàn)象均可證明GD與計算出的各個疾病具有緊密關聯(lián)。

圖11 瀉火消癭方與疾病的關聯(lián)分析

進一步從發(fā)育、分化等方面探索227個靶點與各個細胞、組織的關聯(lián)性，從圖12中可發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方與HEPG2、HUVEC、DRG、心肌細胞等特異性細胞和肺、脾臟、骨髓、腎臟、肝臟等特異性組織，均具有緊密聯(lián)系。這與上文闡述的GD病變涉及五臟形成對應，證明了瀉火消癭方對GD的治療作用。

圖12 瀉火消癭方與細胞、組織的關聯(lián)分析

2.8 分子對接結果

為驗證本研究網(wǎng)絡分析結果的準確性，以“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡的Degree為依據(jù)進行化學成分排序，選取前29位化學成分；將瀉火消癭方“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡圖篩選出的關鍵靶點與瀉火消癭方干預GD的PPI網(wǎng)絡圖計算出的關鍵靶點相結合，對這些靶點進行搜索，最終有14個關鍵靶點的配體與受體可用，所以選取這14個靶點作為分子對接的關鍵靶點，分別為SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2及MET；將化學成分與關鍵靶點建立分子對接模型，將原配體從活性口袋中抽離并重新對接，計算對接后的RMSD及-CDOCKER ENERGY值。

結果顯示,SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2、MET分子對接模型RMSD值分別為0.775 9、0.568 4、0.562 4、0.856 8、0.776 2、0.512 0、0.641 0、1.210 2、0.624 4、0.660 4、0.524 6、0.727 8、0.669 1、1.070 5 ?，均小于2 ?，認為能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結合模式，對接結果具有較高可靠性，靶點具體信息見表1，靶點對接模型見圖13。

表1 靶點信息

圖13 靶點對接模型

將上述14個靶點與29個潛在活性成分及3個治療GD的陽性藥成分甲亢平(Y1)、丙硫氧嘧啶(Y2)、甲硫咪唑(Y3)，進行對接，對接結果如表2所示。各靶點與陽性藥分子對接結果顯示，瀉火消癭方中部分潛在活性成分與靶點-CDOCKER ENERGY值大于Y1、Y2、Y3與靶點結合的-CDOCKER ENERGY值，表明瀉火消癭方的活性化學成分作用強于陽性藥。結合上述結果，瀉火消癭方中的成分與潛在關鍵靶點具有較好的結合活性，提示瀉火消癭方中藥材可能通過作用于潛在關鍵靶點產(chǎn)生抗GD的作用。

表2 對接結果

3 討論

3.1 瀉火消癭方治療GD潛在有效成分、關鍵靶點及可能作用機制

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻調(diào)研，基于已定化合物的OB和DL值，得出92個成分，重復成分有7個。篩選出瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點為227個。將以上收集的成分與靶點構建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡。本研究中，以Degree網(wǎng)絡特征為依據(jù)并進行分析，得出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分排序表，進而以Degree值中位數(shù)的2倍(Degree=30)為界限，篩選出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分29個和潛在靶點14個。

本研究由網(wǎng)絡分析獲得的29個瀉火消癭方治療GD的潛在有效成分，包括植物甾醇、西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇葡萄糖苷、山柰酚、齊墩果酸、異葒草素、薯蕷皂苷和迷迭香酸等成分。文獻報道異葒草素可通過干擾癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、調(diào)控活性氧水平等多種途徑實現(xiàn)抗癌目的[19]，熊果酸可有效抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡及影響腫瘤組織的血管生成[20]，以上作用與KEGG富集得到的通路信息癌癥通路(Pathways in cancer)結果一致；在對紅景天苷的研究中得知其可通過調(diào)控Nrf2的表達逆轉由AGE引起的HK-2細胞凋亡以及糖尿病導致的腎臟組織損傷[21]，這一作用與通路信息糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)息息相關；在對齊墩果酸研究中發(fā)現(xiàn)其會使大鼠的血清甲狀腺素[Thyroxin(e)]水平降低和促甲狀腺素(TSH)水平升高[22]，同時發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能顯著降低GD大鼠FT3、FT4水平[23]，此外迷迭香酸可抑制細胞自噬[24]，但都無法確定其具體機制。現(xiàn)有文獻對其他成分的報道較少，其抗GD的藥效及作用機制研究，同樣值得進一步研究。

本研究針對由網(wǎng)絡分析獲得的14個瀉火消癭方治療GD的作用靶點進行討論，ESR1通過甲狀腺激素通路參與DNA相互作用轉錄表達，該基因編碼雌激素受體[25]；ESR2是屬于NR3亞家族核激素受體家族的核蛋白，是一種核激素受體，與雌激素的親和力類似于ESR1；IGF1R是激素胰島素樣生長因子1(IGF-1)的細胞表面受體；MAPK1是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在機體免疫和炎癥反應中有重要作用[26]；當細胞在負面狀態(tài)下，MAPK通路被激活，進而引起細胞增殖、分化和凋亡等方面的改變[27]；MET基因編碼的蛋白為肝細胞生長因子受體(HGFR)，與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關，參與細胞信息傳導、細胞骨架重排的調(diào)控，是細胞增殖、分化和運動的重要因素。以上靶點提示瀉火消癭方可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素分泌水平、激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)、促進抗炎反應、加強細胞分化和凋亡機制從而起到治療GD的效果。

此外，對KEGG和GO得到的結果進行分析時發(fā)現(xiàn)，瀉火消癭方或許能夠對多種癌癥有所影響。其中KEGG條目有癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等；GO分析得到細胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對外部刺激反應的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對有機環(huán)狀化合物的細胞應答(Cellular response to organic cyclic compound)、對氮化合物的細胞應答(Cellular response to nitrogen compound)等條目，可推測瀉火消癭方或許能夠干預多種癌癥的進程，但詳細的作用機制有待于后期研究。

3.2 從分子層面分析瀉火消癭方的配伍機制

GD病變涉及心、肝、脾三臟，肝郁化火，則見肝火亢旺。母病及子，致心火亢盛。肝木乘脾，脾失健運，釀生痰濕，痰氣交阻，血行不暢，氣、血、痰壅結頸前，痰氣郁結化火，終致心肝火旺。瀉火消癭方重用君藥龍膽清瀉肝膽實火，清利肝經(jīng)濕熱，臣以夏枯草、黃芩增強君藥清肝瀉火之力，切合前述GD肝火旺盛的病機。GD損傷肝陰的同時，也會傷及心陰，出現(xiàn)心悸、煩躁、脈數(shù)等癥。故用生地黃、百合、知母滋陰養(yǎng)血，以使標本兼顧，其中知母既善降火，又能滋陰。反佐穿山龍既防君臣寒涼太過，又防陰傷血澀之變。全方共奏清肝瀉火、滋陰寧心之功[12]。

為了進一步闡述瀉火消癭方的配伍機制，對前文網(wǎng)絡藥理學得出的化學成分藥效Degree排序，并進行分析(見圖4)，發(fā)現(xiàn)其化學成分分布情況與復方藥材配伍有極大的相關性。龍膽中有12個化學成分排在前30位，說明其在瀉火消癭方中發(fā)揮了君藥的重要作用。再以Degree的中位數(shù)(Degree=27)為限，對化學成分進行分析，君藥龍膽，臣藥夏枯草和黃芩的化學成分較多，龍膽有13個化學成分，夏枯草有13個化學成分，黃芩有22個化學成分，而生地黃、百合、知母、穿山龍分別有3、6、6、1個化學成分。推測龍膽為關鍵藥材，夏枯草與黃芩對龍膽具有協(xié)同效應，促進和加強其對GD的治療，生地黃、百合、知母及穿山龍對治療GD起輔助補充之效。有文獻證明夏枯草多糖影響GD小鼠甲狀腺激素的合成和分泌[28]；同時，近期研究發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方中的重要成分黃芩苷可通過抑制mTOR信號通路重塑Tfh/Tfr細胞的平衡[29]；文獻報道表明甲亢初期加用百合能夠降低Thyroxin(e)水平[30]；知母主要成分知母皂苷能降低異常升高的β受體濃度，降低甲狀腺激素對CAMP的激活作用[31]；且穿山龍主要成分薯蕷皂苷元可以緩解甲狀腺腫大癥狀[32]。以上文獻可證明復方中的藥材可在多方面緩解GD，從而改善GD病況。

夏枯草化學成分中包含7個重復的化學成分，即存在較多重復的分子作用靶點，或可說明其作為臣藥輔助龍膽可加強對GD的治療作用。黃芩化學成分含量占比第一(36/104)，分子作用靶點最多(160)，其中有17個靶點為黃芩所獨有的，說明此藥是對瀉火消癭方作用靶點的擴充。百合和知母化學成分包含全方中Degree最大的植物甾醇(Degree=132)，且無特有靶點，或可說明其在治療GD中，起到增強君藥與臣藥療效的功用。

由成分-靶點網(wǎng)絡(圖4)可知重復成分具有較大Degree的化學成分，包括植物甾醇(Degree=132)、西托糖苷(Degree=120)、β-谷甾醇(Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(Degree=80)、山柰酚(Degree=72)、齊墩果酸(Degree=68)和異葒草素(Degree=65)，同時也是對接較好的成分(表2)。由此可得，單個成分可作用于多個靶點，或多個成分作用于同一個靶點，體現(xiàn)出中藥復方多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。且復方中藥材成分相互重合，推測在合理配伍之后，利用其相互間的協(xié)同作用，可提高療效或減少不良反應，適應復雜病情的治療。

由前述研究可知，瀉火消癭方中7味中藥所含共同靶點為227個，其中君藥龍膽占154個，臣藥夏枯草和黃芩在共同靶點中分別占121、160個，佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個。表明7味藥材具有大量的重疊靶點，說明復方藥材通過增強共同靶點的作用而改善GD病癥，揭示了復方用藥的原理。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，通過計算機挖掘網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫方法對瀉火消癭方進行靶點預測和通路分析，并對其活性成分的抗GD作用機制進行探究。同時借助分子對接技術對瀉火消癭方的核心成分與治療GD潛在靶點的結合能力進行研究，從而明確瀉火消癭方的主要調(diào)控靶點，提示臨床用該方治療GD的合理性，為其后續(xù)療效評價指標的篩選提供依據(jù)和方向。