莊培麗 周 璐 朱瑞齊 王丹丹 張 哲 馮百歲

鄭州大學第二附屬醫(yī)院消化內科(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要累及胃腸道，是一種慢性反復發(fā)作的免疫介導性炎癥性疾病，主要包括兩種疾病類型，即潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，盡管發(fā)病機制尚不完全明確，但目前認為其與腸道屏障完整性、先天性與適應性免疫失調、基因易感性、環(huán)境因素等均有密切的關聯[1]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一組蛋白水解酶家族，能夠調節(jié)膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等多種細胞外基質成分的更新[2]，同時可降解或激活多種非基質底物，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎細胞因子、生長因子等，從而促進組織重塑、參與傷口愈合，調節(jié)腸道局部炎癥[3]。MMP-7又名基質溶素，是IBD炎癥期間介導組織損傷的重要介質[4]，同時在腸道傷口愈合過程中起有重要的作用[5]，未來可作為潛在的治療靶點。

既往有研究證實活動期UC患者腸道活檢樣本中MMP-7表達增加[6]，但MMP-7是否與IBD炎癥嚴重程度有關尚未明確。本研究通過檢測IBD患者結腸組織中MMP-7表達情況，并分析其與各臨床指標的相關性，旨在探討結腸組織MMP-7能否反映IBD炎癥活動性，從而為IBD的臨床診斷和治療提供更多可能的方法和策略。

對象與方法

一、研究對象

收集2019年1月—2021年1月于鄭州大學第二附屬醫(yī)院就診治療的IBD患者結腸活檢樣本共38例(其中20例UC、18例CD)，診斷標準參照中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病學組制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年·北京》)[7]。排除標準：合并病毒、細菌、真菌等感染性疾病、嚴重心肺腎疾病、全身惡性腫瘤、其他自身免疫病以及其他慢性活動性疾病的患者。分別采用改良Mayo評分系統[8]和CDAI評分系統[9]對UC、CD患者進行評分，分組情況和入選者的基本情況見表1。各組患者的性別、年齡相比差異無統計學意義(P>0.05)。同時收集IBD患者結腸鏡檢查當天空腹抽取的肘靜脈血，檢測血清C反應蛋白(CRP)、白細胞(WBC)。選取5例結腸癌患者距癌灶5 cm以上的癌旁正常組織作為對照組，由專業(yè)的病理醫(yī)師證實切緣組織未見癌細胞浸潤，無IBD等消化道疾病、自身免疫病等病史。本研究的所有數據收集均經過鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

二、主要實驗試劑

表1 各組一般資料比較

抗人MMP-7鼠單克隆抗體[安迪生物科技(上海)有限公司]；鼠/兔通用二抗(徠卡生物系統有限公司)；抗體稀釋液購自基因科技(上海)股份有限公司；檸檬酸鹽緩沖液、磷酸緩沖鹽粉末、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木精染色液、返藍染色液購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

三、方法

收集入選者第一次電子結腸鏡檢查的結腸標本，4%多聚甲醛溶液固定2 h，梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡透明，包埋，連續(xù)切片，厚3～5 μm。60 ℃烘箱1 h，依次經二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟、水化；檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復，3% H2O2消除內源性過氧化物酶活性；加入抗人MMP-7單克隆抗體(稀釋濃度1∶100)，濕盒內常溫孵育30 min；滴加反應增強液，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗；DAB顯色、蘇木精復染、返藍液返藍、梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明，滴加中性樹脂，蓋玻片封片。

病理切片掃描儀400倍鏡下隨機選擇3個視野拍照，使用Image J軟件的IHC Profiler插件自動計算胞質內染色情況和陽性分數(強陽性區(qū)域的權重記為4分，陽性為3分，弱陽性為2分，陰性為1分，按此權重計算陽性分數)，取均值用于定量分析，觀察各組之間MMP-7表達差異，并分析其與CRP、WBC的相關性。

四、統計學分析

結 果

一、MMP-7在結腸組織中的定位和表達

在對照組、緩解期UC和緩解期CD結腸組織中，MMP-7僅在細胞質中少量表達，染色強度較弱，而活動期IBD患者結腸組織中可見大量陽性區(qū)域，染色可呈黃棕色或深棕色，主要集中于活動性炎癥區(qū)域的上皮細胞中，在少量炎性細胞中也可見到部分染色(圖1)。與對照組相比，活動期UC組和重度CD組MMP-7表達均明顯上調(P<0.05)。隨著嚴重程度的增加，MMP-7表達呈逐漸上調的趨勢，重度UC組和重度CD組組織中MMP-7表達與相應緩解期組相比均明顯上調(P<0.05)，而相同嚴重程度的UC與CD患者之間MMP-7表達未見明顯差異(P>0.05；表2、圖2)。

表2 不同組別患者結腸組織中MMP-7表達

二、MMP-7表達與患者一般情況的關系

不同性別、年齡以及是否使用抗TNF-α制劑的IBD患者之間MMP-7表達差異無統計學意義(P>0.05；表3、圖3)。

三、MMP-7表達與CRP、WBC的相關性分析

相關性分析提示活動期IBD患者MMP-7表達與CRP、WBC呈中度正相關(r=0.816，P<0.001；r=0.527，P<0.001；圖4)。

圖3 不同性別、年齡、治療方法的IBD患者結腸組織中MMP-7表達

圖4 活動期IBD患者MMP-7表達與CRP、WBC的相關性

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表3 不同年齡、性別、治療方法的IBD患者結腸組織中MMP-7表達

討 論

IBD是一種以復發(fā)與緩解交替為主要特征的腸道炎性疾病，具有高度異質性，根據累及部位、臨床表現、影像學檢查等的不同，分為UC和CD[10]。近年隨著現代人飲食結構和生活環(huán)境的改變，IBD的發(fā)病率和流行率逐年增高。MMPs是腸道內環(huán)境穩(wěn)定的核心，參與調節(jié)腸上皮屏障、組織重塑、傷口修復等過程[11-12]，其中MMP-7是MMPs家族中最重要的酶之一。Rath等[13]證實了UC患者結腸活檢組織炎癥細胞中MMP-7基因表達顯著上調，提示其在結腸炎相關的炎癥變化中起重要作用。本研究采用免組化染色法分析38例IBD患者和5例癌旁對照組的結腸組織中MMP-7表達和定位情況，結果顯示對照組和緩解期患者的組織中僅在細胞質中可見少量MMP-7表達，而在活動期IBD患者組織中表達顯著增高，且隨著嚴重程度的升高而呈升高趨勢，提示MMP-7表達與嚴重程度和活動性相關。相關性分析還發(fā)現活動期IBD患者組織中MMP-7表達與CRP、WBC呈顯著正相關，提示MMP-7表達在一定程度上可反映腸道炎癥程度，可能是IBD炎癥活動性的重要指標。

TNF-α是一種參與促炎過程的細胞因子，其水平在IBD患者血液和結腸組織中均有升高，抗TNF-α生物制劑(如英夫利昔單抗、阿達木單抗等)已成為常規(guī)治療無效的中重度活動性IBD患者的主要治療手段[14]。M?kitalo等[15]發(fā)現兒童IBD患者接受英夫利昔單抗治療后可實現臨床和組織學緩解，且MMP-7水平可降低甚至恢復至正常表達水平。本研究結果顯示，MMP-7表達與患者性別、年齡、有無抗TNF-α制劑治療均無關。但鑒于本回顧性研究的樣本量較少，同時僅局限于結腸組織中MMP-7表達差異，未能進行血清、尿液樣本中MMP-7的檢測，且不同患者MMP-7水平可能存在個體化差異，因此MMP-7表達與抗TNF-α制劑治療無關的結論還不夠嚴謹。下一步應完善研究方案，盡量使用同一患者抗TNF-α制劑治療前后的結腸組織，或設計前瞻性試驗干預治療方案以嚴格對比，從而明確抗TNF-α制劑對MMP-7表達的影響。

總之，MMP-7表達與IBD的活動性和嚴重程度有一定相關性，與性別、年齡、有無抗TNF-α制劑治療無關。MMP-7在一定程度上可反映腸道炎癥程度，可能是IBD炎癥活動的重要指標。但結論需行進一步研究證實。