李 宇 蔡蕭君# 陸振華 頡彥鵬 王 濤 王 欽 吳圓圓

黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科1(150036) 消化內(nèi)科2

抑郁癥是臨床常見的精神心理性疾病之一[1]，已成為全球非正常死亡和致殘的主要原因之一[2]。目前選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)仍為抑郁癥的一線用藥，其中氟西汀因其神經(jīng)保護(hù)特性、抗炎、抗腫瘤[3]效果而廣為人知，但其對腸道微生物的潛在作用迄今被低估。Zheng等[4]在無菌小鼠腸道內(nèi)定植抑郁癥的患者腸道微生物而建立的人源化小鼠可誘導(dǎo)抑郁癥表型；Hsiao等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，脆弱擬桿菌可通過改變腸黏膜通透性影響小鼠抑郁相關(guān)行為的發(fā)生。而抗抑郁藥物對腸道菌群的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。本研究采用Biolog-ECO技術(shù)[6]，結(jié)合《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》判定標(biāo)準(zhǔn)[7]，選取6種常見菌屬進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，旨在探討SSRI類抗抑郁藥氟西汀對抑郁模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝多樣性的影響，從而為闡明其抗抑郁機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度21 ℃，相對濕度55%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。鹽酸氟西汀分散片購自法國禮來公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 動(dòng)物分組和模型建立：適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機(jī)分為空白組(n=10)、模型組(n=10)、氟西汀組(n=10)。模型組和氟西汀組均接受連續(xù)6周的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)，包括以下7種[8]：①電擊足底1 min；②4 ℃冰水游泳5 min；③行為束縛2 h；④夾尾1 min；⑤禁食24 h；⑥禁水24 h；⑦夜間光照12 h。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法每天定時(shí)隨機(jī)選擇1種刺激方法處理大鼠。每只大鼠單獨(dú)1籠，每籠之間用不透光擋板遮擋。

2. 模型驗(yàn)證和藥物干預(yù)：造模6周后，氟西汀組給予鹽酸氟西汀分散片3.17 mg·kg-1·d-1灌胃，空白組和模型組給予6.3 mg·kg-1·d-1蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃8周后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估，包括懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)[9]。

3. 糞便收集和處理：將大鼠尾部提起固定，輕壓下腹部，將新鮮糞便收集于無菌EP管中。4 ℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無菌條件下稱取1 g糞便樣品，加入10 mL 0.9% NaCl溶液，渦旋混勻，1 000 r/min離心5 min，去除食物殘?jiān)∩锨逡?，稀釋為濃?0-2～10-5g/mL菌懸液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0-3g/mL菌懸液均勻涂抹于選擇性培養(yǎng)基表層，倒置后恒溫培養(yǎng)，采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)數(shù)量。8通道移液器吸取150 μL濃度為10-3g/mL的菌懸液至Biolog-ECO微平板，接種后放入37 °C恒溫厭氧箱培養(yǎng)。運(yùn)用Biolog系統(tǒng)每間隔24 h進(jìn)行讀數(shù)測定，檢測碳源代謝過程中顏色和吸光度變化。平均顏色變化率(AWCD)表征微生物群落對單一碳源的利用能力和代謝總體活性。聚類分析對微平板中具有相同代謝特征的碳源進(jìn)行親疏度判別和重新分類，比較不同組別大鼠腸道菌群碳源代謝的差異。主成分分析使變量簡化降維，對吸光度相關(guān)矩陣進(jìn)行線性變換，提取對組間差異貢獻(xiàn)大的因子。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠行為學(xué)變化

與空白組相比，模型組大鼠懸尾掙扎時(shí)間、自主游泳時(shí)間和曠場內(nèi)移動(dòng)總距離顯著減少(P<0.05)；氟西汀組大鼠懸尾掙扎時(shí)間、自主游泳時(shí)間和移動(dòng)總距離較模型組顯著增加(P<0.05；圖1)。

二、大鼠腸道6種常見菌屬豐度變化

與空白組相比，模型組大鼠腸道內(nèi)脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，氟西汀組大鼠腸道內(nèi)脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，乳桿菌數(shù)量無明顯差異。與空白組相比，氟西汀組大鼠腸道內(nèi)脆弱擬桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，腸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05；圖2)。

三、大鼠AWCD值和多樣性指數(shù)變化

厭氧培養(yǎng)72 h內(nèi)，各組AWCD值均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增加，表明腸道微生物群的總體代謝活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增加。培養(yǎng)72 h后，各組AWCD值逐漸趨于平穩(wěn)。模型組大鼠Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均顯著低于空白組(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀組大鼠Shannon指數(shù)和Mclntosh指數(shù)明顯升高(P<0.01)，而Shannon均勻度和Simpson指數(shù)無明顯差異(圖3)。

四、大鼠腸道菌群代謝聚類分析

當(dāng)聚類距離≤5時(shí)，空白組和氟西汀組的碳源被聚為4類，模型組的碳源被聚為10類。說明 CUMS誘導(dǎo)的大鼠腸道微生物對碳源的利用比較分散，氟西汀治療后，碳源利用相對比較集中，接近于空白組?？瞻捉M和氟西汀組中糖類D-半乳糖酸γ內(nèi)酯、D,L-α-磷酸甘油、D-甘露醇和氨基酸類L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸、L-苯基丙氨酸均被聚為一類，而在模型組中這些碳源被聚在不同的類別中，空白組中羧酸類D-蘋果酸單獨(dú)被聚為一類，氟西汀組中糖類D,L-α-磷酸甘油和羧酸類D-蘋果酸、衣康酸、γ-羥基丁酸被聚為一類，說明氟西汀可使大鼠腸道微生物對D,L-α-磷酸甘油、D-蘋果酸的利用發(fā)生變化(圖4)。

五、大鼠腸道菌群代謝主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示，空白組、模型組、氟西汀組大鼠中成分1的方差貢獻(xiàn)率分別為84.69%、68.61%、84.71%(圖5)。

分析載荷圖中3組大鼠腸道微生物對31種碳源的代謝特點(diǎn)，空白組、模型組和氟西汀組中PC1在I-赤藻糖醇、N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖等糖類碳源和L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸等氨基酸類碳源上均有較高載荷，說明這兩類碳源是大鼠腸道微生物代謝的必需碳源。模型組和氟西汀組中PC1在衣康酸等羧酸類碳源均有較高載荷，這可能與CUMS造模有關(guān)。與空白組相比，模型組增加了苯乙基胺、腐胺等胺類碳源，氟西汀組增加了α-環(huán)式糊精、G-肝糖等聚合物類碳源，說明氟西汀能提高大鼠腸道微生物對復(fù)雜大分子物質(zhì)的利用能力。

A：懸尾實(shí)驗(yàn)；B：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；C：曠場實(shí)驗(yàn)

*與空白組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

**與空白組比較，P<0.01；##與模型組比較，P<0.01

圖4 大鼠腸道菌群代謝聚類分析

圖5 大鼠腸道菌群代謝主成分分析

空白組中PC2在4-羥基苯甲酸、D-蘋果酸等碳源上有較高的載荷，表明這些碳源對PC2貢獻(xiàn)率較大；模型組中PC2在葡萄糖-1-磷酸鹽、D-甘露醇、甘氨酸-L-谷氨酸、D,L-α-磷酸甘油等碳源上有較高的載荷；氟西汀組中PC2在4-羥基苯甲酸等碳源上有較高的載荷。D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖醛酸等糖類碳源在空白組和氟西汀組中對PC1貢獻(xiàn)率較大，在模型組中對PC2貢獻(xiàn)率較大。衣康酸等羧酸類和L-精氨酸等氨基酸類碳源在空白組和氟西汀組中對PC2貢獻(xiàn)率較大，而在模型組中對PC2貢獻(xiàn)率不大。

討 論

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括生化、遺傳、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌、心理社會(huì)環(huán)境等多種因素，近年研究發(fā)現(xiàn)，微生物-腸-腦軸在抑郁癥等神經(jīng)精神疾病中起有重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)、植物神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)和下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸共同形成了微生物-腸-腦軸雙向信號(hào)通路[10]，使大腦能夠?qū)δc嗜鉻細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和Cajal間質(zhì)細(xì)胞等[11-12]效應(yīng)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，腸道微生物又可通過腸-腦軸神經(jīng)通路、神經(jīng)內(nèi)分泌-HPA軸途徑、腸道免疫系統(tǒng)、合成神經(jīng)遞質(zhì)、腸黏膜屏障、血腦屏障等途徑影響大腦情感和認(rèn)知行為[13-14]。

Biolog-ECO微平板鑒定和變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是目前微生物研究的兩種重要方法。DGGE技術(shù)不依賴傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可基于PCR結(jié)果直接表征微生物遺傳特征，菌種分辨率高，但僅能分離較小DNA片段，且一個(gè)條帶可能代表多個(gè)菌種或同一菌種可能產(chǎn)生不同條帶[15]。Biolog-ECO微平板技術(shù)無需分離純種微生物，可通過碳源氧化快速檢測微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，尤其適用于快速生長型菌落，可最大限度保留微生物原有代謝特征，可重復(fù)性高，但碳源底物易受濕度、pH值等環(huán)境因素的影響[16]。

微生物Shannon指數(shù)可評(píng)估腸道微生物群落整體豐富度，Shannon均勻度是在菌群豐富度基礎(chǔ)上衡量微生物個(gè)體分布的均勻度，Simpson多樣性指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均表示多樣性測度，表征某些常見菌落的優(yōu)勢度和均勻度。本研究結(jié)果顯示，氟西汀組大鼠懸尾掙扎時(shí)間、自主游泳時(shí)間和移動(dòng)總距離較模型組顯著增加(P<0.05)，這與Yan等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Biolog-ECO結(jié)果顯示模型大鼠腸道微生物的碳源利用能力和總體代謝活性發(fā)生顯著變化，空白組大鼠AWCD值最大，表示其代謝總體活性最強(qiáng)，氟西汀可調(diào)節(jié)模型大鼠腸道菌群的整體代謝功能趨于正常。氟西汀還可上調(diào)模型大鼠Shannon指數(shù)和Mclntosh指數(shù)，而對整體均勻度和常見菌種優(yōu)勢度無明顯調(diào)節(jié)作用。聚類和主成分分析顯示，氟西汀干預(yù)后碳源利用相對集中，對聚合物類復(fù)雜大分子的利用增加，D,L-α-磷酸甘油和D-蘋果酸代謝發(fā)生變化。D,L-α-磷酸甘油和D-蘋果酸是連接胞質(zhì)糖酵解與線粒體氧化磷酸化的重要環(huán)節(jié)和穿梭機(jī)制，由于線粒體內(nèi)膜具有嚴(yán)格選擇通透性，糖酵解產(chǎn)生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不能進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，需經(jīng)D,L-α-磷酸甘油和D-蘋果酸轉(zhuǎn)移還原當(dāng)量才能進(jìn)入線粒體呼吸鏈進(jìn)行氧化供能[18]。說明氟西汀可通過調(diào)控糖酵解和線粒體氧化磷酸化途徑影響大鼠腸道菌群代謝活性。

SSRI類藥物主要通過靶向調(diào)節(jié)突觸間隙中5-HT濃度發(fā)揮抗抑郁作用。人體95%的5-HT存在于腸道中[19]，主要由嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生。腸道微生物可通過調(diào)控短鏈脂肪酸(SCFA)代謝、色氨酸羥化酶1(TPH1) mRNA和5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SERT)基因表達(dá)，進(jìn)一步影響5-HT水平[20]。5-HT又可對大腸埃希菌等微生物豐度和群體感應(yīng)性[21]產(chǎn)生影響，腸道微生物可編碼5-HT感應(yīng)元件[22]。5-HT必須經(jīng)由相關(guān)受體的介導(dǎo)才能發(fā)揮作用，其中5-HT2和5-HT3[23]被認(rèn)為與抑郁癥密切相關(guān)。5-HT2A受體在海馬CA1、CA2、CA3區(qū)[24]和腸黏膜下層膽堿能神經(jīng)元[25]中廣泛表達(dá)，5-HT3受體大量分布于腸道肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的神經(jīng)元中[26]，均受外來5-HT神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控。Lyte等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，長期口服氟西汀可顯著降低雄性健康大鼠腸道中乳桿菌豐度，提示氟西汀的負(fù)面臨床效應(yīng)是由腸道微生物群改變引起，口服乳桿菌制劑有助于改善氟西汀長期治療的不良反應(yīng)。由此可見，氟西汀對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝多樣性具有顯著調(diào)控作用，腸道微生物參與SSRI類藥物抗抑郁的機(jī)制包括，一方面在5-HT與中樞、腸道神經(jīng)元的受體結(jié)合后，可能通過腸-腦軸進(jìn)一步引起腸道微生物結(jié)構(gòu)和代謝多樣性的改變；另一方面是腸道微生物受到5-HT的影響后，可能通過微生物-腸-腦軸自下而上改變大腦的情感和認(rèn)知行為。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁大鼠模型，Biolog系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，抑郁大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝多樣性發(fā)生明顯變化，SSRI類抗抑郁藥氟西汀對抑郁導(dǎo)致的腸道菌群改變具有正向調(diào)控作用。氟西汀可使抑郁模型大鼠腸道中有益菌雙歧桿菌豐度上調(diào)，使其迅速成為優(yōu)勢菌種，這與Zhang等[28]的研究結(jié)果一致；使條件致病菌脆弱擬桿菌、腸桿菌、腸球菌和有害菌產(chǎn)氣莢膜梭菌豐度下調(diào)，而對乳桿菌豐度無明顯調(diào)節(jié)作用。同時(shí)氟西汀可調(diào)節(jié)微生物整體豐富度和常見菌種均勻度逐漸恢復(fù)正常。

本實(shí)驗(yàn)僅對抑郁模型大鼠腸道菌群的體外代謝影響進(jìn)行研究，而SSRI類抗抑郁藥物與腸道微生物之間相互作用的具體機(jī)制還有待通過基因測序、糞菌移植等進(jìn)一步揭示。因此，本課題組未來后續(xù)擬通過直接檢測血液、糞便的代謝物樣本來證實(shí)SSRI類抗抑郁藥物與微生物和代謝物之間存在的因果關(guān)系。