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重離子誘變微生物育種的研究進展

2021-03-31 09:52:20吳玉潔劉光琇
微生物學雜志 2021年6期
關(guān)鍵詞:重離子高產(chǎn)熒光

汶 瑛,于 雪, 吳玉潔, 張 威, 陳 拓, 劉光琇*

(1.中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點實驗室,甘肅 蘭州 730000;2.中國科學院大學,北京 100049;3.中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室,甘肅 蘭州 730000)

重離子束即原子序數(shù)大于2且原子核外圍電子剝離或部分剝離形成具有能量的帶電離子束,一般都指正離子[1]。20世紀以來,重離子誘變因具有突變率高、突變譜廣[2]、無毒無害等優(yōu)點,已經(jīng)廣泛應用于生物育種、疾病診斷和治療[3-4]。重離子束和X射線、γ射線等輻射誘變手段均屬于物理誘變。與傳統(tǒng)誘變方式不同,重離子具有較高的傳能線密度(Linear energy transfer, LET),離子穿透徑跡上有較大的能量沉積[5],從而具有更高的相對生物學效應(relative biological effectiveness, RBE)。重離子輻照對細胞的直接刻蝕作用會造成堿基替換[6]、DNA鏈斷裂[7-9],引發(fā)染色體畸變,如染色體缺失或重排[10],包括雙著絲粒、無著絲粒、易位和缺失突變[11-12],阻礙DNA復制,從而改變生物細胞的遺傳特性。近年來,科研人員發(fā)現(xiàn)LET值可能是影響重離子誘變效果的關(guān)鍵因素[11,13-16]。隨著LET值的增加,DNA單鏈斷裂(single-strand breaks, SSBs)[17]、雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)會增多,DNA損傷的復雜性增加[18]。低線性能量轉(zhuǎn)移輻射造成的DSBs可以被快速修復,但由高LET輻射誘導細胞出現(xiàn)的DNA團簇損傷(Clustered DNA damage)[19]比單個DNA損傷修復更困難或無法修復。因此,高LET的重離子束誘導細胞產(chǎn)生修復困難的DNA損傷使其在生物育種上具有明顯的優(yōu)勢。研究表明,相比于X射線、γ射線和電子、重離子在植物中誘發(fā)突變的效率高10倍以上[20]。隨著工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展,微生物產(chǎn)品已經(jīng)越來越多的應用到抗生素、酶、農(nóng)藥、染料等領(lǐng)域。目前,12C6+離子束主要用于微生物育種和植物育種,能量范圍約為80~1 000 MeV/u[21]。重離子束輻照技術(shù)已經(jīng)成功應用于工業(yè)微生物的高產(chǎn)菌株選育,如芽胞桿菌[22]、黑曲霉[23]、阿維鏈霉菌[24]等,并取得了較好的效果。本文將簡要總結(jié)近年來重離子輻照在微生物育種中的研究進展,以期對應用重離子改造微生物的遺傳代謝提供參考。

1 重離子輻照在高產(chǎn)微生物育種中的應用

由于重離子對微生物遺傳效應的顯著影響,目前通過輻照誘變獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌種已應用于食品、藥品、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。真菌已廣泛應用于食品工業(yè)及抗生素生產(chǎn),重離子誘變真菌突變株已有諸多應用。例如,在80 MeV/mu的12C6+離子輻照下獲得的高產(chǎn)黑曲霉菌株檸檬酸產(chǎn)量明顯高于原始菌株[23,25]。Li等[26]在80 MeV/u12C6+輻照條件下篩選出一株能將洛伐他汀(Lovastatin)產(chǎn)量提升4倍的土霉屬菌株Z15-7。Dong等[27]用重離子束對原始菌株煙曲霉MS13.1進行誘變后,突變菌株的β-葡萄糖苷酶活性增加15.1%。

在細菌類群中,重離子誘變在獲得高產(chǎn)抗生素菌株上也已取得積極進展。例如,阿維菌素被廣泛用于殺菌、殺蟲、除螨,使用12C6+離子輻照阿維鏈霉菌,有利于提高阿維菌素的產(chǎn)量[24]。Song等[28]使用12C6+重離子輻照和亞硝酸鈉的聯(lián)合處理,篩選得到的突變株阿維菌素產(chǎn)量提高了23.8%。此外,重離子輻照技術(shù)已成功應用于誘導金霉素[29]、角黃素[30]、丁酸[31]高產(chǎn)菌株。

重金屬污染嚴重影響環(huán)境和人體健康,擁有特定重金屬耐受性的菌株可以在不利條件下生長并儲存重金屬以減少其對環(huán)境和人體的危害。已有研究表明,微生物可用來解決重金屬對土壤的污染問題[32]。Kumar等[33]發(fā)現(xiàn)黃曲霉可吸收污水中的六價鉻。Li等[32]使用碳離子束輻照提高了ArthrobacterC2的抗Cd2+特性,與原始菌株相比,由12C6+束照射的Cd2+抗性突變菌株C2可以在Cd培養(yǎng)基中生長,范圍為20~100 mg/L。因此使用重離子誘變技術(shù)提高微生物重金屬耐受性,將其應用于治理鎘污染的廢水和土壤是可行的。此外,12C6+重離子誘變也可提升嗜酸乳桿菌的乳酸積累[34]。

重離子輻照誘導藻類突變株的產(chǎn)生在生物燃料微生物育種、生物工業(yè)中也有應用[35],近年來,碳排放導致的人為氣候變化,使生物柴油受到了全世界的廣泛關(guān)注,重離子束可作為一種高效的誘變手段誘導高產(chǎn)生物燃料菌株,為清潔能源的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。Ma等[36]使用80 MeV/u 的12C6+離子束輻照微擬球藻,獲得了一個生長速度較快的突變體HP-1。與野生型相比,HP-1的生物量積累和最大生長率分別提高了19%和6%,油脂產(chǎn)量提高了28%。王麗娟等[37]利用12C6+離子束對極大螺旋藻(Spirulinamaxima)進行輻照誘變,發(fā)現(xiàn)突變株的蛋白質(zhì)和多糖含量均高于對照組。部分近年來重離子輻照誘導獲得的高產(chǎn)工業(yè)菌株,見表1。

表1 重離子輻照在高產(chǎn)微生物工業(yè)菌育種中的應用

2 重離子輻照后突變菌株的篩選策略

重離子輻照誘變可以誘導大量突變體產(chǎn)生,但由于其非定向性造成篩選階段工作量大。更具挑戰(zhàn)性的問題是輻照后如何從海量突變體中快速將有應用價值的菌株篩選出來。傳統(tǒng)篩選主要依靠人工分離純化和搖瓶培養(yǎng),通量低且速度慢。多孔U型底的微滴板(deep-square deep well microplate, MTP)與搖瓶有較高的相似性,可以替代搖瓶培養(yǎng),提高培養(yǎng)效率[46-47]?,F(xiàn)有的高通量篩選(High-Throughput Screening, HTS)方法,主要有四大類:①基于檢測吸光度的篩選策略:直接檢測目標分子結(jié)構(gòu)或固有顏色[48];間接檢測,例如添加pH指示劑、金屬離子螯合劑或通過酶促反應和化學反應,使不易直接檢測的突變株可通過吸光度進行篩分。②基于檢測熒光強度的篩選技術(shù):直接檢測目標產(chǎn)物的固有熒光信號;使用熒光染料、探針以及基于化學或酶聯(lián)反應使目標菌株產(chǎn)生熒光信號進行篩分。③基于生物傳感器的篩選策略:生物傳感器通常分為基于蛋白質(zhì)的生物傳感器和基于核酸的生物傳感器兩種類型。大多數(shù)基于蛋白質(zhì)的生物傳感器都基于轉(zhuǎn)錄因子(TF)和工程熒光蛋白(FPs),而基于核酸的生物傳感器主要包括RNA核糖開關(guān)和RNA-熒光基團(RNA Spinach)以及基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的DNA生物傳感器[49-50]。④基于特殊光譜的篩選策略:例如拉曼光譜(RS)[51]、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)[52]和傅立葉變換近紅外光譜(FTNIR)等。

實際應用中一般會多策略聯(lián)合或與流式細胞儀、微流體液滴系統(tǒng)結(jié)合[53]。微液滴可實現(xiàn)對單個真菌孢子的分選,一次篩選試驗的試劑消耗可減少百萬倍,降低了培育生產(chǎn)菌株的成本[54]。納升級別液滴的微流體系統(tǒng)已成功應用到分離絲狀真菌[55]、分泌維生素B2(核黃素)的乳球菌突變體[56]以及高產(chǎn)α-淀粉酶的酵母菌等。微流體液滴技術(shù)與熒光激活方法結(jié)合,也可顯著提高菌株篩選效率[57]。

菌株不同生長狀態(tài)和細胞類型可通過熒光強度和熒光類型識別。與目標菌株的細胞化學或物理特性相關(guān)的熒光信號使微生物可以通過熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS)進行選擇。理論上,每個突變體都可以通過熒光強度被檢測和分類。由于FACS具有非特異性背景較高的缺點,因此通過FACS篩選的菌株需要微孔板培養(yǎng)進一步篩選。例如,Cao等[58]借助熒光激活細胞分選術(shù)篩選由常壓室溫等離子誘變(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)處理過的孢子,再將單個活孢子分選并噴霧到含有50 μL固體瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中,從5 760個突變體中獲得了阿維菌素高產(chǎn)突變株,搖瓶和發(fā)酵培養(yǎng)的效價分別提高18.9%和20.6%。生物傳感器和熒光激活細胞分選技術(shù)結(jié)合,也可以極大提高目標菌株的篩選效率。例如,Liu等[59]通過蛋白質(zhì)組學分析得到的啟動子構(gòu)建了蘇氨酸傳感器,并利用熒光激活細胞分選技術(shù)從2 000萬突變體庫中篩選出400多株,進而分離到34個高產(chǎn)蘇氨酸突變株。此外,流式細胞儀(Flow cytometer, FC)與細胞熒光染色技術(shù)結(jié)合后也可以實現(xiàn)對突變株的高通量篩選。Wang等[60]通過使用流式細胞儀檢測單個細胞發(fā)出的熒光強度,篩選出了高產(chǎn)谷胱甘肽的釀酒酵母突變株。

3 重離子束誘導微生物突變的機制

重離子束誘導的遺傳物質(zhì)改變是獲得穩(wěn)定突變體的生物學基礎(chǔ)[61],本文將從輻照造成生物大分子損傷、DNA損傷以及損傷后遺傳物質(zhì)的修復路徑三個方面闡明重離子束誘導生物體突變的機制。

3.1 重離子輻照造成微生物生理生化損傷

細胞膜是細胞與外界接觸的第一道屏障,離子束可損傷或影響細胞膜的結(jié)構(gòu)、流動性、通透性,影響細胞與環(huán)境之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號轉(zhuǎn)導。α、β和γ粒子可沿軌道電離細胞組分,從而導致各種解離/電離通道,沿軌道的高能粒子會產(chǎn)生大量二次電子,繼而對遺傳物質(zhì)和生物大分子造成更嚴重的損傷[62]。一般來說,電離輻射主要通過水的輻射分解[63]誘導自由基[64-65]形成,產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS),損傷細胞膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[66]。Cao等[67]對模式生物釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞研究發(fā)現(xiàn),輻照會使細胞膜完整性發(fā)生改變,導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸外泄,威脅細胞生存。對原核微生物耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的研究發(fā)現(xiàn),輻照會增加蛋白質(zhì)的羰基化,阻礙蛋白質(zhì)的催化活性[68]。細胞內(nèi)大量參與生命活動的關(guān)鍵蛋白質(zhì)受損,會嚴重影響正常生命活動的進行,例如堿基切除修復的DNA糖基酶,對輻照引起的DBS及時修復具有重要價值[69],未修復或錯誤修復的DSBs會導致細胞遺傳特性改變甚至凋亡。

3.2 重離子誘導微生物DNA突變的機制

DNA是遺傳物質(zhì)的基本單位,易受到內(nèi)源性和外源性刺激損傷。內(nèi)源性DNA損傷主要是由DNA與細胞內(nèi)的水和ROS發(fā)生水解和氧化反應產(chǎn)生的,外源性刺激因子通常為紫外線、電離輻射以及化學誘變劑等[70]。重離子作為物理輻照源的一種,主要通過電離作用對生物大分子和細胞遺傳物質(zhì)造成損傷,從而改變微生物的遺傳代謝特征。

原核微生物因為基因組相對較小,重離子束可直接作用于DNA使其電離,或由水輻射分解產(chǎn)生的分解產(chǎn)物(羥基自由基、過氧化氫、單態(tài)二氧)間接破壞DNA[71]。進入細胞的離子與生物大分子發(fā)生電離作用后會迅速沉積下來,電子直接附著在DNA主鏈上導致鏈斷裂[72-73]。沉積的粒子還會引發(fā)生物細胞表面的二次粒子和電子濺射, 造成細胞膜表面穿孔,使后續(xù)粒子更容易進入細胞內(nèi)部,最終導致 DNA 損傷和生物體變異[74]。

目前重離子輻照誘導微生物突變的機制大多是基于模式微生物釀酒酵母來探究的,釀酒酵母基因組大小約 12 Mbp,和高等真核生物具有高度的同源性,遺傳背景清晰、基因功能研究深入[75-76]。在釀酒酵母中,線粒體是重要的細胞器,擁有獨立于核DNA的基因組,能夠編碼與呼吸作用相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[77],確保呼吸作用為真核細胞提供能量[78]。新一代測序技術(shù)的出現(xiàn),促進了功能基因組學和分子育種的研究,目前全基因組序列比對[79]可揭示重離子如何改變遺傳物質(zhì)。Guo等[80]通過對比碳離子束(carbon ion beam, CIB)照射后釀酒酵母的全基因組序列差異發(fā)現(xiàn)在核基因組中,CIB的照射主要引起堿基的置換和一些小的DNA插入/缺失。Szumiel[81]研究發(fā)現(xiàn),在釀酒酵母中線粒體DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)是輻射損傷的主要靶點之一,而mt DNA的損傷會嚴重影響細胞的生理代謝甚至導致細胞凋亡[36,82]。高LET的重離子束造成釀酒酵母核DNA損傷的一個顯著特征是突變位點集中在核小體之間的連接區(qū)附近[83],而伽瑪射線引起的突變分布均勻;突變譜分析表明,碳離子束和γ射線均能顯著誘導G∶C到T∶A的轉(zhuǎn)換[84]。

3.3 突變DNA的修復機制

目前,針對重離子誘導的微生物遺傳物質(zhì)損傷修復機制研究較少,在酵母中,同源重組(homologous recombination, HR)通路在DSBs修復中占主導地位[84]。可以做為高等真核細胞中對損傷修復機制研究的參考。細胞主要通過HR[85]和非同源末端連接(classical nonhomologous end joining, C-NHEJ)[86-87]來修復DSBs(圖1)。復雜的DSBs可以有效地激活DNA末端切除,因此,大約85%的復雜DSBs在DNA修復過程中被切除[88]。盡管在不同類型的細胞中C-NHEJ和HR通路的使用頻率有差異,但研究表明C-NHEJ在整個細胞周期中均起作用,而HR在DNA復制后的S(S phase)/G2(G2 phase)期相對活躍[89]。C-NHEJ主要通過多種修復蛋白的協(xié)同作用連接DSBs的末端,盡管C-NHEJ具有較高的出錯率,但其可快速抑制染色體易位,對保護基因組的完整性具有重要價值。Yajima等[88]在宮頸癌細胞(HeLa細胞)中發(fā)現(xiàn),與X射線或激光輻照相比,高LET重離子輻照誘導的DSBs優(yōu)先由HR修復。HR通常需要以同源序列作為模板,精確地重建損傷丟失的序列。Lee等[90]使用重離子束照射同一供體的淋巴細胞,在G2期細胞中觀察到了染色體畸變增加,這表明一些DSBs可能通過易出錯的途徑修復,如替代性末端連接(alternative end joining, A-EJ)和單鏈退火(single-strand annealing, SSA)[91-93]。

圖1 兩種主要的DSBs修復途徑(修改自文獻[90]、[94])

在人G2期細胞中,約70%的DSBs由C-NHEJ修復,30%的DSBs由HR修復。C-NHEJ 從Ku蛋白與DNA斷裂端結(jié)合開始,DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunits, DNA-PKcs)經(jīng)過磷酸化與Ku蛋白組成DNA-PK(DNA 依賴性蛋白激酶),促進DNA連接酶和X 射線修復交叉互補基因4(XRCC4)、XRCC4類似因子(XRCC4-like factor, XLF)等聚集到斷端形成連接復合體[94]。隨后,經(jīng)過多種修復蛋白因子對DNA末端的加工修飾作用,完成DSBs修復。HR過程起始于MRN復合體(MRE11/Rad50/NBS1 complex)對DNA斷端的識別結(jié)合,同時還與招募的BRCA1/2和CtIP(CtBP-interacting protein)等,對斷端進行加工。CtIP隨后募集復制蛋白A(replication protein A, RPA)至加工過的單鏈上,穩(wěn)定斷端DNA并激活ATM與Rad3相關(guān)蛋白激酶(ATM-and Rad3-related protein kinase, ATR),促進DNA鏈侵入。HR的關(guān)鍵步驟是Rad51競爭替換 RPA,形成核蛋白細絲,促進與姐妹染色單體的重組,完成DNA鏈配對、延伸之后HR修復過程結(jié)束[89,93]。

4 展 望

本文簡要綜述了重離子輻射的生物效應,輻照后突變株的篩選方法以及近年來通過重離子輻照技術(shù)選育的一些高產(chǎn)菌株。但目前重離子輻照誘變技術(shù)在篩選微生物突變株方面還存在一些問題。①重離子技術(shù)對設(shè)備要求較高,使其發(fā)展受限。世界范圍內(nèi)僅有幾家重離子加速器裝置,主要分布在中國(中國科學院近代物理研究所)、日本(NIRS、RIKEN)、德國(GSI)、美國(LBL)、法國(GANIL)、意大利(LNS)等。②不同離子束和輻照劑量對菌株的誘變效果存在差異。重離子有多種類型,例如16O6+、12C6+、20Ne10+、36Ar18+、40Ca12+、129Xe27+等。目前,12C6+離子束主要被用于微生物育種和植物育種,后續(xù)的研究也可探究不同輻照源對菌株誘變效果的差異并總結(jié)規(guī)律,以期提升誘變效率。③突變基因在穩(wěn)定遺傳性方面存在的問題。在針對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn),大多數(shù)嚴重的DNA損傷,包括由輻射引起的大量缺失(從kb到Mb),不能遺傳給后代。這是由于一般子代只能穩(wěn)定遺傳1~4 bp缺失突變[83],大片段的缺失可能涉及到對配子發(fā)育或生存能力至關(guān)重要的基因。因此重離子輻照育種是否具有遺傳穩(wěn)定性,還需要更多的實驗驗證。

盡管重離子誘變在微生物育種方面已經(jīng)取得了一些成功,但目前對重離子誘變的陽性突變株代謝物積累的生理機制認識有限,隨著組學技術(shù)的發(fā)展,未來可結(jié)合多種工具對重離子誘變的機制進一步研究。在解析機理的基礎(chǔ)上,將重離子束的高效誘變育種與生物工程技術(shù)融合,定向培育高產(chǎn)微生物菌株,快速提高微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,使其更好地服務于生產(chǎn)生活。

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