謝婷婷，邢若丹，顧歆韻，付 聰，馬 威，楊文強，余 浩，田立群，吳勇宏，柯于鶴△

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 武漢 430065； 2. 武漢市第一醫(yī)院， 武漢 430022； 3. 武漢市第一醫(yī)院神農(nóng)架林區(qū)中醫(yī)院，湖北 神農(nóng)架 442421)

目前，我國心血管病(CVD)患病人數(shù)仍快速增長，CVD患病率及死亡率上升，心衰(HF)作為臨床最常見的心血管疾病之一，其發(fā)病率亦不斷增長。急性心肌梗死(AMI)是臨床冠狀動脈疾病中最常見造成HF的原因之一[1]。研究報道顯示，盡管心梗后心衰的發(fā)生率有所減少，但HF診斷后5年生存率仍較低而死亡率較高[2]，故如何改善HF患者預(yù)后及延長其壽命仍是亟待解決的問題。

近年諸多研究表明，中藥可通過多種途徑延緩HF發(fā)展進(jìn)程，明顯改善患者生活質(zhì)量。本課題組前期研究證實，蔥白提取物具有改善心肌缺血、抗氧化、調(diào)脂、改善心肌纖維化等作用[3-5]。細(xì)胞凋亡參與HF的心室重構(gòu)是HF重要機制之一。本實驗旨在探究蔥白提取物對于心梗后心衰大鼠心室重構(gòu)及細(xì)胞凋亡的影響及其作用通路。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠65只，體質(zhì)量(200±10 g)，由湖北省實驗動物中心提供，合格證號42000600027433、42000600026538，飼養(yǎng)于武漢市第一醫(yī)院SPF級動物實驗室，動物號SYXK(鄂)2014-0030。本研究已通過武漢市第一醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審查。

1.2 藥物

原料為神農(nóng)架林區(qū)天蔥蔥白，蔥白提取物由武漢市第一醫(yī)院盤龍制劑中心提取，提取過程簡述如下：蔥白經(jīng)過冷凍干燥和超臨界CO2萃取，溶于吐溫- 80配成 0.07% 的混合液，制取后4 ℃保存。培哚普利(8 mg/片，天津制藥廠)碾碎后溶于蒸餾水，蒸餾制成0.07%的混合液。

1.3 試劑與儀器

免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；大鼠B型腦鈉肽(BNP)試紙(Elabscience公司)。DW300-B型小型動物呼吸機(淮北正華有限公司)；ABI QuantStudio 6型實時熒光定量PCR儀等。

1.4 造模、分組及給藥

參照心衰動物模型建模[6]，取65只大鼠進(jìn)行左冠狀動脈結(jié)扎，取9只大鼠僅于同位置穿線不結(jié)扎，術(shù)后所有大鼠注射等量青霉素，飼養(yǎng)1周后將結(jié)扎并存活的大鼠隨機分成模型組、蔥白提取物組(后文簡稱蔥白組)和對照組，其中蔥白組又分為高、中、低劑量組，未結(jié)扎大鼠為假手術(shù)組，每組均為9只(造模過程中大鼠共存活54只，死亡11只，死亡率16.9%，其中假手術(shù)組無死亡，與文獻(xiàn)報道相符[6])。蔥白組以相應(yīng)劑量蔥白提取物灌胃，對照組以培哚普利相應(yīng)劑量灌胃，假手術(shù)組、模型組以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。以上藥物給藥劑量根據(jù)人臨床用藥劑量，參照人與動物用藥劑量換算標(biāo)準(zhǔn)[7]，給予相應(yīng)藥物灌胃給藥12周。

1.5 標(biāo)本采集

給藥12周后將大鼠禁食不禁水過夜，分別稱重，以0.3 kg/ml 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采腹主動脈血6 ml，經(jīng)3000 r/min離心10 min，分離血清以備檢測。迅速開胸取出心臟，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，取0.5 cm厚的心尖部組織于5%多聚甲醛中固定避光保存以備染色，取剩余新鮮左心室組織存于-80 ℃冰箱，用于Western blot 等檢測。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 苦味酸-天狼星紅染色 取制備好的左心室組織切片若干，用二甲苯脫蠟至水，置于0.1%苦味酸天狼星紅染液浸泡1 h，Harris's蘇木素復(fù)染5 min，乙醇脫水，二甲苯固定，中性樹膠封片風(fēng)干。在顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，每組取2塊切片，每塊切片記錄3個高倍鏡視野(×400)。

1.6.2 血清BNP含量測定 ELISA測定大鼠血清BNP含量，參照試劑盒說明書。

1.6.3 RT-qPCR檢測Caspase-3 mRNA表達(dá) 取各組新鮮冰凍大鼠心肌組織100 mg加入1 ml Trizol試劑研磨成漿，移至無RNase的1.5 ml EP管中裂解、離心，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行RNA提取，將稀釋的RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，依次加入Oligo (dT) 18 (10 μM) 2 μL、dNTP (2.5mM) 4 μL、5×Hiscript Buffer 4 μL、Hiscript Reverse Transcriptase 1 μL、Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL、樣本RNA4.96326 μg，加入ddH2O (Rnase free)混合至20 μL，25 ℃條件下孵育5 min，50 ℃ 孵育15 min，85 ℃孵育5 min，4℃孵育 10 min，將稀釋至10倍的cDNA進(jìn)行qPCR擴增，以Rat GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 1 min，退火50℃ 30 sec，延伸60℃ 30 sec，循環(huán)40次。最終數(shù)據(jù)以目的片段/內(nèi)參Rat GAPDH片段條帶灰度值比值的半定量比較。Caspase-3上游引物序列：5′- TGGACTGCGGTATTGAGACA -，下游引物序列：5′- GCGCAAAGTGACTGGATGAA -3’。

1.6.4 Western Blot檢測Caspase-3、p65、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 取新鮮左心室組織裂解，提取其總蛋白，灌膠上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，經(jīng)免疫反應(yīng)后采用ECR化學(xué)發(fā)光法檢測顯色條帶強弱。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩獨立樣本采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟組織病理學(xué)結(jié)果

天狼星紅染色顯示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可辨，多數(shù)細(xì)胞核間距相差不多，整體著色較淺，鮮見紅染的纖維組織；模型組排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞較重，細(xì)胞核間距大小不一，整體著色較深，多數(shù)心肌細(xì)胞壞死區(qū)可見大量紅染纖維組織；由此圖1可以看出，一定程度上蔥白提取物、培哚普利均可改善心肌纖維化。

注：A.假手術(shù)組； B.模型組； C.高劑量組； D.中劑量組； E.低劑量組； F.對照組，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡(×400)

2.2 血清BNP含量

表1示，與假手術(shù)組比較，模型組BNP(>100pg/ml)顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，對照組、蔥白組BNP含量均顯著降低(P<0.01)，尤以高劑量組降低最為明顯。結(jié)果提示，心梗后心衰模型成功；蔥白提取物和培哚普利均能降低大鼠BNP含量，且蔥白提取物降低大鼠血清BNP的效用呈劑量相關(guān)性，高劑量較中、低劑量效果好。

2.3 Caspase-3 mRNA的表達(dá)結(jié)果

表1示，與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡水平增加，Caspase-3 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，蔥白組和對照組Caspase-3 mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；與對照組比較，低、中劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，高劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清BNP含量及心肌組織Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較

2.4 Western Blot 檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、p65蛋白的表達(dá)結(jié)果

表2圖2示，Caspase3、Bax蛋白表達(dá)水平各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；bcl-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組升高(P<0.05)；與模型組比較，蔥白組均降低(P<0.05)；p65蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組升高(P<0.05)；與模型組比較，蔥白組、對照組均下降(P<0.05)；與對照組比較，蔥白高劑量組降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、p65分別于內(nèi)參灰度值比值比較

3 討論

AMI屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，用蔥白治療“胸痹”早有記載。明·李時珍《本草綱目》記載：“卒心急痛，牙關(guān)緊閉欲絕，以老蔥白五莖去皮須，搗膏，以匙送入咽中，灌以麻油四兩，但得下咽即蘇。[8]”AMI是臨床冠狀動脈疾病中最常見造成HF的原因之一。蔥白相關(guān)現(xiàn)代研究及前期臨床實驗研究表明，蔥白提取物具有改善心肌缺血、抗氧化、調(diào)脂、改善心肌纖維化等作用，臨床防治心梗后心衰療效較好[3-5]。

BNP是HF診斷、臨床事件風(fēng)險評估、預(yù)后評估的重要指標(biāo)，還可用于評價HF治療效果。心室重構(gòu)是HF重要機制之一，是由多種復(fù)雜的分子和細(xì)胞機制導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型變化，包括病理性心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞的凋亡與壞死、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積或降解增加。心肌細(xì)胞凋亡是心梗后心衰心臟重構(gòu)的重要機制之一，故抑制心肌細(xì)胞凋亡可以減輕心臟重構(gòu)，改善心功能。

注： A.假手術(shù)組； B.模型組； C.高劑量組 D：中劑量組 E：低劑量組 F：對照組

細(xì)胞凋亡途徑之一是細(xì)胞外的死亡受體途徑，主要靠刺激因素激活p53、Bcl-2、NF-κB等基因，由腫瘤壞死因子 (TNF) 家族受體介導(dǎo)激活Casepase-8。隨后通過介導(dǎo)不同的級聯(lián)信號，激活效應(yīng)性Caspase-3(Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶)，進(jìn)一步激活內(nèi)切核酸酶，促使DNA鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)最終解體，完成整個細(xì)胞凋亡的過程。NF-κB還能影響促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，調(diào)控Bcl-2和Bax的比值，以達(dá)到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。NF-κB以p65和p50組成的異源二聚體形式最為常見[9-11]。

實驗結(jié)果表明，蔥白提取物在一定程度上可以改善心梗后心衰的心肌纖維化表現(xiàn)以逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，降低血清BNP水平以改善HF預(yù)后，降低Caspase-3 mRNA、bcl2蛋白和p65蛋白表達(dá)，以抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)合實驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，蔥白提取物抑制細(xì)胞凋亡的機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)。通過抑制bcl2、p65蛋白的表達(dá)，結(jié)合Caspase-3、Caspase-7，阻止Caspase-9的活化，起到抗細(xì)胞凋亡的作用。HF重要機制之一是心室重構(gòu)，而細(xì)胞凋亡是心室重構(gòu)的重要機制之一，故抑制細(xì)胞凋亡、延緩心肌細(xì)胞衰老、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)可以改善心臟功能及遠(yuǎn)期預(yù)后，對臨床診治心力衰竭具有重要臨床意義。

綜上所述，蔥白提取物可以在一定程度上抑制心肌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，延緩心衰進(jìn)展，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。