丁姮月，朱惠萍，梁國強(qiáng)，張 川，連秋華，孫宏文△

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)， 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛、排便頻率與大便性狀改變?yōu)樘卣鞯呐R床常見的功能性胃腸道疾病，腹瀉為主的腸易激綜合征(IBS-D)是其主要亞型，其主要表現(xiàn)是腹痛和腹瀉[1]。IBS-D屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“鶩溏”“飧泄”“濡泄”“洞泄”“注下”“后泄”等范疇，其病因有外感、內(nèi)傷之分，外感中濕邪最為重要，內(nèi)傷中脾虛最為關(guān)鍵，因此脾虛濕盛是導(dǎo)致本病發(fā)生的關(guān)鍵因素。泄瀉的病位在脾、胃、腸，脾胃為泄瀉之本，脾主運化水濕，脾失健運、清氣不升、清濁不分自可成瀉，其他諸如寒、熱、濕、食等內(nèi)外之邪以及肝腎等臟腑所致的泄瀉都只有在傷脾的基礎(chǔ)上，導(dǎo)致脾失健運時才能引起泄瀉[2]。正如《景岳全書·泄瀉》曰：“泄瀉之本，無不由于脾胃?！蔽麽t(yī)方面，IBS-D的病因尚不完全明確，但大量的實驗研究提示，可能與胃腸道動力紊亂、內(nèi)臟感覺異常、中樞感覺異常、“腦-腸-菌”軸失調(diào)、腸道感染與炎癥反應(yīng)、精神心理因素等相關(guān)[3]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與IBS-D的關(guān)系密切。近年來，16S rDNA基因高通量測序方法的發(fā)展，使學(xué)者們能夠?qū)δc道細(xì)菌進(jìn)行較詳細(xì)的分析。本研究采用此技術(shù)，旨在觀察脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的變化情況。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級幼齡ICR雄性小鼠20只，40～50 d齡，體質(zhì)量(20±2) g，購自江蘇省蘇州市新區(qū)昭衍新藥研究中心有限公司，動物合格證號scxk(蘇)2013-0003。光暗每日各半，室溫控制在(23±2 )℃，相對濕度45%～70%。小鼠無菌標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，購自蘇州市雙獅實驗動物飼料科技有限公司，自由飼食、水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后備用。本研究已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查(批件號2017倫研批009)。

1.2 實驗藥物

戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠提供，sigma公司生產(chǎn)，批號20089104)；番瀉葉：蘇州市春輝堂藥業(yè)有限公司，批號170909。

1.3 實驗試劑

SYBR Green PCR試劑盒(貨號K0223)Thermo；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號，K1622)Fermentas；Trizol，(貨號1596-026)invitrogen；無水乙醇(貨號100092680)國藥集團(tuán)產(chǎn)品；氯仿(貨號10023419)國藥集團(tuán)；異丙醇(貨號80109218)國藥集團(tuán)。

1.4 實驗儀器

352型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS)；TG16 W離心機(jī)(國產(chǎn))微量高速離心機(jī))；GNP-9080型培養(yǎng)箱(國產(chǎn))隔水式恒溫培養(yǎng)箱；Sigma 1-13微量離心機(jī)(美國Sigma公司)；AX-26DR萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ABI9700智能梯度PCR儀(ABI 美國)；Axygen 凝膠回收試劑盒(Axygen 美國)；FTC-3000TM real-time PCR(楓嶺 上海)；Miseq測序儀(Illumina 美國)等。

2 方法

2.1 實驗分組

隨機(jī)將20只清潔級幼齡ICR小鼠分為空白組(CK)與模型組(IBS-D)，CK組5只，IBS-D組15只。

2.2 動物造模

造模前每日定時記錄觀察小鼠的大便性狀，測量其飲食、體質(zhì)量并記錄一般情況。采用100%番瀉葉浸液(1 g生藥/ml)以10 ml/kg小鼠體積灌胃，每日2次，連續(xù)10 d，期間喂食不定時，飲食無常，制定脾虛型IBS-D模型[4-5]。

2.3 脾虛型IBS-D動物模型標(biāo)準(zhǔn)

主癥：泄瀉嚴(yán)重甚至脫肛;食少納呆；次癥：消瘦、體質(zhì)量減輕;神態(tài)萎靡，四肢不收，毛色枯槁;蜷縮聚堆;易疲勞。其中具備2項主癥、2項次癥即可確認(rèn)脾虛型IBS-D造模成功[6]。

2.4 觀察及檢測指標(biāo)

2.4.1 一般情況觀察 每天定時記錄造模前后小鼠的大便性狀、飲食及體質(zhì)量。

6) 外輸結(jié)束。當(dāng)外輸油量達(dá)到既定值時，外輸結(jié)束，關(guān)閉外輸泵，常規(guī)油船將之前接收的水通過CTV打回到FPSO以沖洗油管，增壓泵旁通閥打開，外泄閥關(guān)閉，CTV軟管與常規(guī)油船斷開，并將油管中殘余的水排至CTV的污液艙，由拖船協(xié)助軟管回收到CTV的卷筒上。常規(guī)油船系泊解脫，CTV回收系泊纜索，斷開側(cè)裝載接頭，由拖船協(xié)助軟管回收到FPSO的軟管收放滾筒上。

2.4.2 小鼠腸道菌群的檢測 造模成功后，提取CK、IBS-D組小鼠腸道內(nèi)糞便，無菌操作收集于凍存管中。隨后稱取樣本質(zhì)量，采用組織勻漿器冰浴上勻漿并離心取上清液。最后對所有樣本進(jìn)行基因組DNA抽提進(jìn)行雙向測序，并采用兩步PCR擴(kuò)增方法(表1)，將全部PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備，而后進(jìn)行illumina miseq 2×300 bp高通量測序及生物信息學(xué)分析。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.4.1語言作圖軟件剖析腸道菌群，采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析， wilcox、Ttest分析比較各組之間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脾虛型IBS-D小鼠一般情況比較

表2、3示，模型組在造模過程中，均出現(xiàn)了主癥2項及次癥中至少2項。參照Bristol分型積分標(biāo)準(zhǔn)對造模前后小鼠的大便進(jìn)行評分，結(jié)果表明模型組小鼠的Bristol積分值明顯高于空白組(P<0.05)，主要表現(xiàn)為水樣便；另對造模前后小鼠的進(jìn)食量與體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計比較，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的進(jìn)食量與體質(zhì)量明顯低于空白組(P<0.05)。以上信息初步確認(rèn)脾虛型IBS-D小鼠造模成功(表3)。

表2 Bristol分型積分標(biāo)準(zhǔn)

表3 小鼠造模前后數(shù)據(jù)結(jié)果比較

3.2 小鼠樣本的基因DNA質(zhì)控及PCR擴(kuò)增

首先采用QIAamp DNA Stool Mini Ki方法對樣本進(jìn)行基因組DNA提取，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，文庫構(gòu)建主要采用兩步PCR擴(kuò)增方法。(1)一次擴(kuò)增(圖1A)：電泳檢測條帶單一，片段長度與預(yù)期片段大小一致，且濃度適中，負(fù)對照無污染；(2)二次擴(kuò)增(圖1B)：二次PCR擴(kuò)增后條帶單一，亮度適中，每個條帶的分子量均在750～500 bp之間，符合預(yù)期結(jié)果，可進(jìn)行后續(xù)凝膠回收實驗。

注：圖中每一條帶代表一個分子量，Marker為DL2000，從上至下條帶依次為2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30ng/μL，其余條帶均為10ng/μL

3.3 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細(xì)菌多樣性分析

3.3.1 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細(xì)菌的測序深度分析 本實驗將相似性等于或大于97%的序列歸為同一單元OTU，并基于物種分類學(xué)信息，在門、界、綱、目、科、屬、種分類水平上分別進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。為得出樣本的測序深度情況，使用mothur軟件進(jìn)行稀釋性曲線(Rarefaction curve)的繪制。圖2示，所有樣本在測序量1000左右出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)折點，隨后即進(jìn)入平緩期，說明本次測序深度充分，測序數(shù)據(jù)量大且合理，能反映出標(biāo)本中的絕大部分生物信息。

注：橫坐標(biāo)表示隨機(jī)抽取的測序量，縱坐標(biāo)表示OUT數(shù)值

3.3.2 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細(xì)菌的豐度、均勻度分析 為證明本次樣品細(xì)菌的多樣性達(dá)到實驗要求，進(jìn)行了豐度等級圖(Rank-abundance)繪制。圖3示，大部分樣品曲線在水平方向較寬，下降趨勢較平緩，可見20例樣本中細(xì)菌豐度和均勻度皆較為合理。

注：橫坐標(biāo)代表OTU數(shù)值，縱坐標(biāo)表示OTU中序列數(shù)的相對百分含量

3.4 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠之間細(xì)菌多樣性比較

細(xì)菌多樣性主要采用基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性(Alpha diversity)分析的方法，包括chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等。圖4示，這20例樣本中細(xì)菌的豐富度與多樣性均較高，且曲線都進(jìn)入平臺期。

圖4 20例樣本腸道細(xì)菌的Alpha多樣性分析

圖5 20例樣本腸道細(xì)菌Alpha多樣性的差異性分析

3.5 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本間腸道菌群的物種信息及差異分析

3.5.1 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群在門水平上的分布及差異 表4示，對CK、IBS-D組的20個樣本進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)與差異分析，發(fā)現(xiàn)2組小鼠腸道菌群的構(gòu)成存在差異，且各菌門的構(gòu)成比不同；與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠擬桿菌門、Saccharibacteria、藍(lán)藻門減少，變形菌門、疣微菌門增多(P均<0.05)。

表4 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本在門水平上物種相對豐度及差異分析

3.5.2 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群在屬水平上的分布及差異 表5示，本次實驗共在小鼠糞便中檢測出58種菌屬，選取CK、IBS-D組樣本中前27種優(yōu)勢菌群，分別統(tǒng)計其占比并繪制表格。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組小鼠腸道菌群的構(gòu)成存在差異，且各菌屬的構(gòu)成比不同。進(jìn)一步進(jìn)行物種差異分析可以發(fā)現(xiàn)，與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠另枝菌屬、乳酸菌屬、理研菌屬、Candidatus Saccharimonas、分節(jié)絲狀菌屬、瘤胃球菌屬、脫硫弧菌屬、Gelria減少，擬桿菌屬、阿克曼菌屬、Parasutterella、Lachnoclostridium、厭氧棍狀菌屬、Blautia、埃希氏菌屬、Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、克雷伯氏菌屬、厭氧原體屬、Flavonifractor、Candidatus Stoquefichus、Anaerostipes、Epulopiscium、沙雷氏菌屬增多(P均<0.05)。

表5 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠樣本在屬水平上物種的相對豐度及差異分析

3.5.3 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群各分類差異性分析 表6圖6示，為對脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群進(jìn)行門、綱、目、科、屬、種6個分類匯總分析，采用組間群落差異分析方法(LDA Effect Size)。

注：這個由內(nèi)至外輻射的圓圈圖為聚類樹，依次代表由門、綱、目、科、屬、種的分類級別。在不同圓圈層上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈的直徑與該分類的相對豐度大小呈正比。該圖中，紅色區(qū)域表示CK組，綠色區(qū)域表示IBS-D組；樹枝中紅色、綠色節(jié)點分別表示在該組別中起到重要作用的微生物類群。圖中英文字母表示物種名稱在右側(cè)圖例中進(jìn)行展示

表6 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本組間結(jié)構(gòu)差異性分析

4 討論

IBS-D 屬于中醫(yī)“泄瀉”等范疇，古代醫(yī)家早已認(rèn)識到泄瀉乃脾之功能失常所致。正如《素問·藏氣法時論篇》曰：“脾病者，虛則腹?jié)M，腸鳴，饗泄，食不化?！爆F(xiàn)代醫(yī)家亦對該疾病進(jìn)行了中醫(yī)證候探究，黃紹剛等[7]經(jīng)聚類分析得知，IBS-D的主要證型為脾胃氣虛證、肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、脾胃濕熱證；李梅等[8]認(rèn)為， IBS 可分為脾胃虛弱、肝郁脾虛、肝脾不和、肝氣郁結(jié)、脾胃濕熱5型，可見脾胃虛弱及肝郁脾虛為IBS-D的常見證型，而此2型又以脾虛為基礎(chǔ)。脾失健運，升降失調(diào)，水谷不化，清濁不分，混雜而下，形成泄瀉。

IBS是一種常見的功能性胃腸道疾病，臨床根據(jù)大便性狀將其分為腹瀉型、便秘型、混合型與未定型4種類型，其中腹瀉型在我國發(fā)病率最高，是IBS最常見的類型[9]。近年來，越來越多的實驗致力于腸道微生物群的研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與IBS-D的關(guān)系密切。相關(guān)報道指出，一旦腸道菌群的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致菌群失調(diào)，可能會引起腸道功能紊亂，從而導(dǎo)致IBS-D的發(fā)生[10]。

目前，學(xué)者們對脾虛型IBS-D腸道菌群的研究較為粗略，僅停留于較常見的數(shù)種細(xì)菌。江月斐等[11]發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D患者腸桿菌、腸球菌、酵母菌增多，雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、消化球菌減少。張衛(wèi)平等[12]指出，脾虛型泄瀉小鼠類桿菌、腸球菌增多，腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少。

因此，為進(jìn)一步觀察脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的變化情況，此次研究對2組小鼠糞便進(jìn)行了16S rDNA基因測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠的腸道菌群表現(xiàn)為大量有益菌的下降和有害菌的增加。

在門水平上發(fā)現(xiàn)，健康小鼠的擬桿菌門與厚壁菌門共占94.14%，而脾虛型IBS-D小鼠則占79.63%，較健康小鼠有所減少。報道指出，擬桿菌門與厚壁菌門不僅能夠促進(jìn)碳水化合物的代謝與能量的吸收[13]，還能夠生成腸道自由基清除劑及炎癥調(diào)節(jié)因子，抑制腸道的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，有效阻止胃腸疾病的發(fā)生與發(fā)展[14]。Bennet SMP等[15]表明，厚壁菌門與擬桿菌門比值的升高會引起腸道免疫活性的改變，從而導(dǎo)致IBS-D的發(fā)生。本次研究發(fā)現(xiàn)該比值升高了7.03%，與文獻(xiàn)報道相一致。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等致病菌。報道指出，健康人腸道中變形菌門豐度較低，而在一些致病因素的作用下會誘發(fā)其大量增殖，產(chǎn)生促炎因子引起腸道炎癥[16]。Durbán A等[17]通過研究IBS-D患者腸道菌群的不穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，急性腹瀉的發(fā)生可能與變形菌門相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠變形菌門增多，提示該菌門的增多與脾虛型IBS-D有一定的相關(guān)性。

在屬水平上發(fā)現(xiàn)，另枝菌屬隸屬于理研菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門。漆靖等[18]指出，另枝菌屬的減少能夠使腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道的炎癥。本實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠另枝菌屬減少，提示該菌屬豐度的下降或與本疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。乳酸菌屬隸屬于乳酸菌科、乳酸菌目、芽孢桿菌綱、厚壁菌門，是益生菌的重要組成部分，對宿主具有促進(jìn)消化、提升免疫力和抑制病原菌生長的益生特性[19]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠乳酸菌屬減少，與以往研究結(jié)論相一致。理研菌屬隸屬于理研菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門，徐航宇等[20]研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群中理研菌屬豐度較高，其在該疾病的活動期發(fā)揮重要作用；而本次研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠理研菌屬減少，兩者結(jié)論不相符，尚待進(jìn)一步探究。阿克曼菌屬隸屬于疣微菌科、疣微菌目、疣微菌綱、疣微菌門，Derrien M等[21]發(fā)現(xiàn)，其具有降低黏蛋白的作用，能夠破壞黏液層的完整性，從而破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致IBS-D的發(fā)生。本次實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠腸道中該菌屬增多，表明阿克曼菌屬可能與該疾病存在關(guān)聯(lián)。Chen YJ等[22]研究表明，IBS-D患者腸道菌群中Parasutterella顯著增加，指出該菌屬與慢性腸道炎癥相關(guān)，并認(rèn)為其與IBS-D的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實驗結(jié)果與之相符。

在種水平上發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌隸屬于梭菌屬、梭菌科、梭菌目、梭菌綱、厚壁菌門，是腸道內(nèi)重要的有益菌，可促進(jìn)腸系膜的修復(fù)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，抑制炎癥因子的形成[23]。Lopez-Siles M等[24]指出，IBS患者體內(nèi)的柔嫩梭菌低于健康人。本研究亦發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠柔嫩梭菌減少，其為健康小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，與文獻(xiàn)報道相一致。艱難梭菌隸屬于梭菌屬、梭菌科、梭菌目、梭菌綱、厚壁菌門，其主要通過產(chǎn)生毒素A、毒素B、二元毒素致病，從而導(dǎo)致腹瀉或偽膜性結(jié)腸炎[25]。本次實驗亦發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠腸道中艱難梭菌增多，表明艱難梭菌或與脾虛型IBS-D的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

本研究提示，16S rDNA測序技術(shù)能夠滿足小鼠腸道微生態(tài)的研究需求。盡管本次實驗樣本數(shù)量較少，但已基本闡明脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠的腸道菌群比較已發(fā)生明顯的偏移。與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的豐富度與多樣性均降低。在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平上，2組小鼠的菌群構(gòu)成及構(gòu)成比皆存在差異，脾虛型IBS-D小鼠表現(xiàn)為大量有益菌的下降、有害菌的增加。由于本研究受客觀條件的限制，并未對脾虛型IBS-D小鼠菌群改變的具體因果關(guān)系進(jìn)行研究，未來可加大樣本數(shù)量進(jìn)一步分析探討。