熊款款，譚 磊，王愛兵，楊凌宸

(湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128)

氧化應激是指動物機體受到有害刺激時，體內活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基 (RNS)等產生過多，超過機體對其清除能力，進而導致氧化還原系統(tǒng)失衡，引起細胞內脂質、蛋白質和核酸的氧化性應激，最終引發(fā)細胞凋亡和組織器官損傷[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞抵御氧化應激的關鍵通路是Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)-核因子E2相關因子2(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)[2]。該通路具有解毒與中和作用，也正因為該通路調控的抗氧化酶系及Ⅱ相解毒酶可清除ROS等有害物質，因此Keap1-Nrf2/ARE可作為一個藥物靶點，應用于炎癥、癌癥、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經退行性疾病等的預防和治療。此外，與Keap1-Nrf2/ARE相關的抗氧化劑在許多氧化應激誘發(fā)的疾病中也表現(xiàn)出良好的預防及治療作用，該通路的抗氧化作用因而備受國內外關注。

1 Keap1-Nrf2/ARE通路元件的結構

1.1 Keap1的結構

Keap1是由鼠胚胎cDNA文庫里篩選出的一種新蛋白，該蛋白與果蠅的KELCH蛋白高度同源。Keap1蛋白的分子質量為69 ku，是KELCH家族的一種多區(qū)域阻遏蛋白，位于19p13.2位點上。該蛋白一般存在于細胞質中，是Nrf2的負調節(jié)器，通常錨定于胞漿肌動蛋白的細胞骨架上[3]。Keap1的蛋白質序列分成5個區(qū)域，共627個氨基酸，分別為N端區(qū)域 、BTB 區(qū)域、中間連接區(qū)域、 KELCH區(qū)域和C端區(qū)域。其中BTB 區(qū)域與Nrf2的結合力密切相關，并且負責介導Keap1蛋白的二聚化作用。這個區(qū)域的核心位點是Ser-104，該位點的突變會影響Keap1的二聚化，對Nrf2的結合產生干擾作用[4]。中間連接區(qū)域富含半胱氨基酸殘基，是Keap1與ROS及RNS結合反應的區(qū)域，對氧化和核輸出的信號較敏感。Keap1介導Nrf2泛素化的關鍵位點Cys273和Cys288也位于該區(qū)域，并參與氧化還原信號的傳導。KELCH區(qū)域中有6個雙甘氨酸重復序列，其中Keap1和Nrf2的Neh2區(qū)的胞漿內肌動蛋白結合位點位于KELCH區(qū)域，可使細胞核內的Nrf2保持在一個相對較低的水平[5]。

1.2 Nrf2的結構

Nrf2又稱Nfe2l2，由Moi等人用β珠蛋白的基因啟動子NF-E2的重復序列作為識別位點探針，在K592 cDNA文庫中篩選分離獲得。Nrf2蛋白的分子質量為66 ku，位于2q31位點，屬于CNC(Cap-n-Collar)蛋白調節(jié)家族以及Bzip (basic leucine zipper)的轉錄因子。 Nrf2在未受誘導的正常細胞里代謝迅速，半衰期約為15 min～30 min。CNC家族中其他成員包括NF-E2、Nrf1、Nrf3、Bach1和Bach2，具有不同的生物學功能， Nrf2是該家族轉錄調節(jié)功能最強的蛋白[6]。

Nrf2蛋白可分為6個功能結構域，依次為Neh1～Neh6。Neh1可與Maf蛋白形成異二聚體并與ARE結合，誘導目標基因的轉錄與表達。Neh2位于N末端，其包含DLG和ETGE兩個結合位點可與Keap1的KELCH結合，干擾Nrf2的轉錄活性。Neh3位于C末端，與CHD6結合可激活ARE相關基因的轉錄，并與細胞轉錄活性有關[7]。Neh4和Neh5處于Neh1和Neh2中間，當Nrf2進入細胞核時，依靠Neh4和Neh5及cAMP反應原件的共同作用，啟動轉錄過程。Neh6的特點是非Keap1依賴的富含絲氨酸的Nrf2 降解調控，與Nrf2的負性調節(jié)有關。

1.3 ARE的結構

ARE又稱親電效應原件，位于許多細胞保護基因的啟動子上游，是一種包含特定DNA序列的調節(jié)原件。ARE中有活性的區(qū)域為長度16個核苷酸的序列：5′-T(A/C)ANN(A/G)TGA(C/T)NNNGC(A/G)-3，N代表中間5個可變的核苷酸。當細胞受到氧化刺激時，Nrf2進入細胞核內與Maf形成異二聚體，激活ARE依賴的基因表達，發(fā)揮抗氧化損傷的作用[8]。另有研究證實，Nrf2和Bach1均可與ARE 結合，激活Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶基因表達，保護機體組織細胞。

2 Nrf2-Keap1/ARE信號通路抗氧化應激機制

2.1 Nrf2-Keap1/ARE信號通路的激活

在正常狀態(tài)下，Nrf2以無活性的狀態(tài)存在于細胞質中，然而Keap1與Nrf2形成的二聚體和胞漿中的肌動蛋白結合并被錨定在細胞胞漿中。它可通過泛素蛋白酶體途徑快速分解，使Nrf2保持低轉錄活性。Nrf2-Keap1二聚體的解偶聯(lián)為該通路抗氧化應激的關鍵步驟，調控其解偶聯(lián)的機制主要有Keap1 構象改變和Nrf2磷酸化作用。

2.1.1 Keap1構象改變機制 當細胞受到刺激產生氧化應激時，ROS和RNS通過修飾Keap1的半胱氨酸殘基，使Keap1構象改變，進而抑制Nrf2的泛素化，促進Nrf2的磷酸化，降低26S蛋白酶體對Nrf2識別能力，使Nrf2-Keap1二聚體解偶聯(lián)，并促使Nrf2進入細胞核。Nrf2穩(wěn)定增加并與ARE結合，這是Nrf2-Keap1二聚體的解偶聯(lián)的經典方式。進入細胞核后的Nrf2先與Maf蛋白結合成異二聚體，再與ARE基因識別并結合，從而啟動其下游抗氧化應激酶和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄，編碼產生抗氧化蛋白，達到抗氧化應激的作用。

2.1.2 Nrf2磷酸化作用機制 許多蛋白激酶通過誘導Nrf2的磷酸化介導Nrf2的轉錄調節(jié)活性[9]，如蛋白激酶C(PKC)[10]、蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)[11]、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)[12]、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)[13]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)[14]等，以上蛋白激酶途徑均參與Nrf2-Keap1二聚體的解偶聯(lián)，誘導Nrf2磷酸化，并參與對Nrf2的轉錄活性調控。

2.2 Nrf2-Keap1/ARE信號通路的關閉

當機體由氧化應激狀態(tài)恢復至正常生理狀態(tài)時，Nrf2從ARE上解離并且返回胞漿，通過泛素化后降解，從而主動關閉Nrf2通路，Nrf2再次保持在相對較低水平。解離后的Nrf2和其他蛋白結合完成最終對靶基因轉錄的調控，恢復細胞的內穩(wěn)態(tài)。

2.3 Nrf2-Keap1/ARE信號通路調控的靶蛋白

在正常狀態(tài)下，Keap1與Nrf2的結合使Nrf2處于抑制狀態(tài)，而在外界氧化應激刺激下(如ROS或RNS)，解偶聯(lián)后的Nrf2進入細胞核，與ARE相結合，啟動下游的抗氧化酶，這些酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 醌氧化還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等[15]。

3 具有調節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號通路作用的抗氧化劑

3.1 天然植物多酚類

植物多酚是一種天然的抗氧化劑，可增強機體抵抗ROS或RNS的能力，但其抗氧化機制較復雜。隨著天然多酚的分離純化技術不斷發(fā)展，更多的天然植物多酚類被發(fā)現(xiàn)，而且這些抗氧化劑均與Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關。目前主要的植物多酚類抗氧化劑有白藜蘆醇、姜黃素、原花青素、槲皮素、茶多酚等。

3.1.1 白藜蘆醇 白藜蘆醇是一種存在于植物中的多酚類抗氧化素，有較強的抗氧化活性，可以保護肝臟、血管、神經系統(tǒng)。白藜蘆醇可有效的清除羥基、超氧化物以及金屬誘導的自由基，并在產生ROS的細胞中發(fā)揮抗氧化的能力。向母豬飼料中添加白藜蘆醇(300 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)其胎盤中Nrf2蛋白的表達水平提高，且Keap1蛋白的表達水平下降，證明了飼料中添加白藜蘆醇可以達到激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路的效果[16]。另外，白藜蘆醇可上調Keap1-Nrf2/ARE下游抗氧化基因的表達，其中包括過氧化氫酶(CAT)、GSH-Px、SOD 和HO-1，從而有效地保護由腎臟高血糖介導的氧化損傷[17]。

3.1.2 姜黃素 姜黃素主要由2個酚官能團與β-二酮組成，通過直接清除ROS，緩解氧化損傷。在亞慢性鎘污染的小鼠腎臟模型中，用姜黃素成功地誘導小鼠腎Nrf2蛋白的活化和表達，進而誘導其下游的靶基因表達，降低由鎘導致的氧化損傷[18]。此外，姜黃素可提高肝臟中的Nrf2、HO-1基因及其蛋白的表達量，使Nrf2的入核量均顯著增多，證明了姜黃素通過促進Nrf2的活化與轉入，激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路下游靶基因。但目前姜黃素的代謝和化學性質相對不穩(wěn)定，且細胞膜的通透性較差，從而導致動物口服姜黃素的生物利用度極低。鑒于姜黃素較強的抗氧化作用，可對姜黃素進行適當化學結構修飾，改善膜通透性差和生物利用度低等缺點，提高姜黃素的藥用價值。

3.1.3 槲皮素 槲皮素存在于許多植物中，是一種黃酮類抗氧化劑，其具有抗氧化和清除自由基的功能。槲皮素不僅可以通過Keap1-Nrf2/ARE信號通路上調Nrf2和抗氧化基因HO-1的表達，而且可上調腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，從而降低腦部的氧化應激反應，加強學習記憶的腦功能[19]。此外，槲皮素還作為丙型肝炎病毒(HCV)治療的輔助佐劑，干擾丙型肝炎病毒誘導的細胞氧化還原狀態(tài)的調節(jié)，減少病毒復制，從而緩解氧化應激。

3.1.4 兒茶素 兒茶素是綠茶中所富含的抗氧化成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抗病毒等作用，兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是主要活性成分。研究表明，EGCG不僅可以增加Nrf2基因在細胞核中的水平，還可促進ARE的熒光素酶的基因的轉錄[20]。EGCG還可通過Akt和ERK1/2信號途徑，來激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，誘導下游的抗氧化酶基因(HO-1和MnSOD)的表達，提高細胞的抗氧化能力。

3.1.5 其他 還有其他植物多酚也具備抗氧化功能，如金絲桃苷可通過促進Nrf2向細胞核轉移，與Bach1競爭結合ARE，促進保護細胞蛋白的水平上調，最終發(fā)揮細胞保護作用[21]。在氧化應激狀態(tài)下，葡萄籽原花青素(GSP)可降低Nrf2的mRNA的表達水平，并增加Keapl的mRNA的表達量減輕氧化應激對Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響[22]。丹酸酚、丹皮酚、染料木黃酮、黃芩素等均可作為Keap1-Nrf2/ARE信號通路的抗氧化劑，增強機體抗氧化能力。

3.2 含硫化合物

3.2.1 異硫氰酸酯類 在十字花科的蔬菜中，惰性芥子油苷前體是異硫氰酸酯類的主要成分。進入動物體內后，惰性芥子油在腸道內轉變?yōu)镮TCs，而ITCs可與Keap1半胱氨酸殘基中的巰基發(fā)生反應，干擾 Keap1和Nrf2的結合，刺激ARE調節(jié)靶基因產生抗氧化作用。異硫氰酸苯乙酯(PEITC)和蘿卜硫素(SFN)是Keap1-Nrf2/ARE信號通路中異硫氰酸酯類主要的抗氧化劑[24]。SFN和PEITC可增加Nrf2活性和Nrf2依賴基因(NRF2-GCS、HO-1)的表達，誘導Nrf2依賴的抗氧化途徑，而且該途徑可能為SFN和PEITC保護人類皮膚免受氧化損傷和細胞凋亡的一個潛在分子機制[25]。研究證明用寡核酸芯片鑒定化學預防性PEITC是一種很有前途的化學預防藥物，它通過激活Nrf2，從而誘導Ⅱ相酶發(fā)揮抗氧化作用[26]。SFN是一種從十字花科植物中提煉而出的異硫氰酸鹽，有著很強的抗氧化作用，它可通過上調Nrf2的表達達到抗炎和抗氧化的作用。而且SFN對腎臟、肝臟局部缺血導致的氧化應激損傷也有保護作用。另外，在與氧化應激相關的口腔癌變中，SFN也發(fā)揮重要的預防作用。

3.2.2 鄰二硫醇類 1，2-乙二硫醇和 2，3-二巰基琥珀酸可以在動物體內轉變?yōu)槎蜴I，而二硫鍵具有親電性質，可以激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路[27]。(R)-硫辛酸是鄰二硫醇類的一種變體，在許多的食物中均可內源產生，其中以菠菜和花菜中的含量最高。(R)-硫辛酸被證實可通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，誘導其下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達[28]。

3.2.3 二硫醚和二烯丙基硫化物 二硫醚是一種五元環(huán)狀含硫化合物，有抗氧化和抗癌的作用。其中3H-1，2-二硫-3-硫酮(D3T)是一種簡單的二硫醚化合物，存在于十字花科的蔬菜中。D3T可作為一種抗氧化劑，其作用機制是由于D3T五元環(huán)內的二硫鍵可與Keap1的半胱氨酸殘基中的巰基結合反應變化，進而改變Keap1蛋白上的半胱氨酸結構形態(tài)，破壞了Keap1和Nrf2的結合，促使Nrf2-Keap1二聚體解偶聯(lián)，進一步激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路[29]。

二烯丙基硫化物是一種蔥屬蔬菜中常見的有機硫化合物，有抗癌和抗氧化的作用。近年來對親脂性硫醚的研究發(fā)現(xiàn)，二烯丙基硫化物可激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路中解毒酶表達，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)，上述激活信號通路的強度順序為DATS>DADS>DAS。然而，人們對于這些二烯丙基硫化物抗氧化的機制尚未明確，有待進一步研究。

3.3 含硒化合物

3.3.1 無機硒化合物 無機硒化合物是含硒的抗氧化劑，其中亞硒酸鈉最為常見，但其尚有一些弊端，如一定的過氧化性，安全范圍小、生物利用率低，未吸收的硒易導致土壤和環(huán)境污染，這讓人們對于含硒抗氧化劑的研究逐漸轉向了有機硒源的抗氧化劑。

3.3.2 有機硒化合物 依布硒啉是一種新型抗炎藥物，是化學合成的有機硒化合物。依布硒啉可調節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號通路下游的解毒酶基因的表達，發(fā)揮細胞保護作用，可作為一種高效的抗氧化劑和抗炎劑[30]。SFN-isoSe是蘿卜硫素的硒異位體化合物，比SFN的抗氧化作用更強。同時有機硒化合物3selena-1-dethiacephem已被證實是一種ROS的清除劑和Keap1-Nrf2/ARE信號通路的激活劑。硒代蛋氨酸(SeMet)已被證實可在飼料中添加提高動物的抗氧化能力。SeMet通過向身體蛋白中非特異地摻入硒蛋氨酸形成內源硒儲備；在氧化刺激下，儲備的硒可形成硒蛋白，發(fā)揮抗氧化的作用。研究發(fā)現(xiàn)，富硒益生菌、富硒酵母可顯著提高奶牛Keap1-Nrf2/ARE信號通路下游抗氧化酶GSH-Px的活性，提高機體的抗氧化能力[31]。

3.3.3 硒多糖 采用熱水浸提法從新鮮的平菇子中提取觸動富硒平菇多糖，與平菇多糖比較發(fā)現(xiàn)富硒平菇多糖可更好的清除如羥基、ATBS、DPPH等ROS自由基，抑制由過氧化氫(H2O2)誘導小鼠心肌細胞的氧化損傷，說明富硒平菇多糖在體外具有較強的抗氧化能力[32]。此外，從富硒灰樹花子實體中提取粗硒多糖(Se-GFP)，并進一步分離純化出一種新型硒多糖-雜多糖Se-GFP-22。在對Se-GFP-22與不含硒的GFP-22比較中發(fā)現(xiàn)Se-GFP-22具有更強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力[33]。

3.3.4 硒納米顆粒 除了無機硒、有機硒源和天然硒多糖外，硒納米顆粒(SeNPs)與無機硒和有機硒比較，具有獨特的物理化學性質和生物活性。有研究建立一種干酪乳桿菌生物合成SeNPs的生物技術，用該方法合成的SeNPs不僅可以減輕敵草枯或羥基對腸上皮細胞的氧化應激損傷，提高GSH-PX活性，發(fā)揮抗氧化劑的作用，而且在硒的細胞毒性方面顯著低于亞硒酸鈉和SeMet和硒多糖[34]。除此之外，在殼聚糖(CTS)水溶液中合成SeNPs，通過噴霧干燥將SeNPs包埋到CTS微球中，從而形成載硒殼聚糖微球(SeNPs-M)，SeNPs-M不僅有較強的抗氧化活性，且細胞毒性顯著低于SeMet[35]。SeNPs作為一種特殊形式的硒補充劑，因其良好的抗氧化性和獨特的生物安全性受到世界各國的廣泛關注。

3.4 重金屬

微量的重金屬是動物生存的必備品，但是過量的重金屬可以對動物造成巨大的危害。有研究發(fā)現(xiàn)部分重金屬可以通過Keap1-Nrf2/ARE信號通路激活ARE的表達。鎘可以誘導ARE基因表達，抗鎘誘導的氧化應激。金諾芬是一種抗風濕藥物，它不僅含有重金屬成分金，同時也通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，發(fā)揮藥物抗炎作用。

除上述的4類抗氧化劑之外，過氧化氫類和多烯類的抗氧化劑也有被發(fā)現(xiàn)。對Keap1-Nrf2/ARE信號通路的作用大致分為兩種，一種是Keap1-Nrf2/ARE信號通路的激活劑，激活信號通路加強下游調控的抗氧化酶的活性；另一種是刺激Keap1-Nrf2/ARE信號通路發(fā)生作用的ROS和自由基的清潔劑，可以清除引起氧化應激的ROS和自由基等。

4 展望

Keap1-Nrf2/ARE信號通路是預防癌癥和其他慢性疾病(心血管疾病、神經退行性疾病和肺損傷)的重要靶點。當RNS或ROS等刺激細胞產生氧化應激反應時，會激活該信號通路負性調節(jié)Keap1蛋白使其與Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2進入細胞核與ARE識別并結合發(fā)揮抗氧化作用。Keap1-Nrf2/ARE信號通路可作為一個有效的藥物作用靶點，進行藥物研究試驗，為預防和醫(yī)治氧化應激相關疾病(如炎癥、癌癥、病毒病等)提供新的治療藥物以及治療方案，該通路有十分廣泛的研究潛力以及發(fā)展前景。因此，針對Keap1-Nrf2/ARE信號通路的抗氧化劑的研究已成為了十分重要的研究領域。

與Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關的抗氧化劑的研究中，有一部分已經進入了臨床試驗階段，已知的含硒化合物依布硒啉、蘿卜硫素以及天然植物多酚中的白藜蘆醇均已經參與了許多疾病的臨床試驗，比如慢性腎臟病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌等。在已知與Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關的抗氧化劑均為有親電性的Keap1抑制劑，可通過修飾和改變Keap1上的半胱氨酸巰基，激活Nrf2/ARE系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化的目的。所以，Keap1與Nrf2連接處的半胱氨酸巰基可作為Keap1-Nrf2/ARE信號通路抗氧化劑的分子作用靶點，通過針對這個靶點深入研究，發(fā)現(xiàn)更多的抗氧化劑，為該信號通路的抗氧化劑研發(fā)提供了十分重要的研究方向。

過度的激活Nrf2/ARE也會誘導動脈硬化和癌癥等疾病的發(fā)生，并且Keap1-Nrf2/ARE信號通路的對于氧化應激的抵御作用尚存在未知問題，還需進一步探索。此外，清除ROS和自由基也是抗氧化劑的作用機制之一。在含硒化合物的抗氧化劑中，不僅有通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路發(fā)生抗氧化功能的抗氧化劑，也有清除ROS和自由基而發(fā)揮抗氧化功能的抗氧化劑(亞硒酸鈉、硒多糖、SeMet等)?？寡趸瘎┚劢褂谖{米顆粒，其抗氧化性更強且生物利用率高，可作為抗氧化劑用于臨床研究。今后在Keap1-Nrf2/ARE信號通路的抗氧化劑的開發(fā)過程中，從含硒化合物中研發(fā)出具有高抗氧化活性和高生物安全性的抗氧化劑有巨大的潛力，如何能同時提高抗氧化活性和生物安全性是未來研制新型抗氧化劑的重點。