韓超逸，湯德元，曾智勇，黃 濤，王 彬，郭倩妤，廖少山，張 森，楊志剛，晏仁潭

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025)

豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種豬的急性傳染病。PRV屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，豬皰疹病毒屬，為線性DNA病毒。PRV可引起仔豬嘔吐、高熱及神經(jīng)癥狀，病死率較高，母豬出現(xiàn)繁殖障礙，成年豬出現(xiàn)高熱癥狀耐過(guò)后通常呈隱性感染[1]。因?yàn)镻R傳播速度快、危害大，OIE將其列為必須報(bào)告的疫病。PRV具有潛伏感染的特點(diǎn)，病毒經(jīng)口鼻呼吸道感染宿主后，可潛伏于外周神經(jīng)系統(tǒng)中，此時(shí)不產(chǎn)生新的病毒粒子，當(dāng)外界條件變化引起動(dòng)物應(yīng)激時(shí)，PRV會(huì)被激活導(dǎo)致宿主向外排毒，感染豬群甚至造成PR的暴發(fā)[2]。潛伏感染這一特點(diǎn)是PRV難以凈化的主要原因。

1 病毒結(jié)構(gòu)

PRV病毒呈圓形或橢圓形，從內(nèi)到外由雙鏈DNA、20面體核衣殼、被膜、脂質(zhì)雙層膜形成的囊膜構(gòu)成。20面體核衣殼由162個(gè)殼粒組成，其中150個(gè)六鄰體，12個(gè)五鄰體，衣殼直徑約為110 nm～150 nm。被膜位于囊膜和衣殼之間由雙層蛋白質(zhì)構(gòu)成，且內(nèi)外組分蛋白不同。囊膜位于病毒粒子最外層，由11種糖蛋白和4種非糖蛋白組成，囊膜在PRV感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。位于胞漿內(nèi)被囊膜包裹的成熟病毒粒子直徑為150 nm～180 nm，囊膜表面有長(zhǎng)約8 nm～10 nm呈放射狀排列的纖突[1]。

2 病毒基因結(jié)構(gòu)及其功能

2.1 基因結(jié)構(gòu)

PRV基因組為線狀雙鏈DNA，大小約為150 kb，G+C含量為74%，具有長(zhǎng)獨(dú)特區(qū) (unique long region,UL)110 kb 、短獨(dú)特區(qū)(unique short region,US) 10 kb，US區(qū)兩端分別插入了大小為15 kb的末端重復(fù)序列 (terminal repeats,TRS)與內(nèi)部重復(fù)序列 (internal repeats,IRS)[3]。因?yàn)閁L區(qū)與US區(qū)方向可以相同或相反，所以PRV有兩種異構(gòu)體，并且兩種異構(gòu)體都具有感染力。PRV基因組復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)位于UL區(qū)域稱為OriL，另一個(gè)稱為OriS，在IRS區(qū)重復(fù)存在；PRV基因組含73個(gè)基因，67個(gè)開(kāi)放閱讀框，可編碼70～100種蛋白質(zhì)，主要包括衣殼蛋白、囊膜糖蛋白以及各種酶，但其中一半是PRV復(fù)制的非必需蛋白，因此PRV可以作為外源基因的載體[4]。近年來(lái)我國(guó)各地區(qū)都分離出了變異的PRV毒株，YE等將我國(guó)分離出的PRV毒株基因序列與歐美毒株序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯差異，故對(duì)PRV進(jìn)行了基因分型，我國(guó)PRV屬于基因Ⅱ型，歐美PRV屬于基因Ⅰ型，對(duì)比歐美基因Ⅰ型，基因Ⅱ型PRV的US1基因出現(xiàn)了很大的突變，UL36、UL49.5、UL51基因突變率超過(guò)了10%，導(dǎo)致了我國(guó)PRV毒株與歐美PRV毒株出現(xiàn)了生物學(xué)功能差別，進(jìn)口疫苗已經(jīng)不能起到很好的保護(hù)作用[5]。根據(jù)PRV基因功能的不同可將基因分為結(jié)構(gòu)基因、毒力基因和調(diào)節(jié)基因；根據(jù)PRV侵入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄先后順序可以將其基因組分為立即早期基因、早期基因和晚期基因。

2.2 主要基因及其功能

2.2.1TK基因TK基因位于UL23區(qū)，基因全長(zhǎng)963 bp，共編碼321個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的非必需基因。TK基因是PRV毒力基因之一，TK基因編碼的胸苷激酶是PRV在靜息細(xì)胞中復(fù)制所必需的。缺失TK基因的病毒在神經(jīng)組織中潛伏感染能力減弱，但并不影響病毒免疫原性，因此TK基因可作為基因缺失疫苗的靶點(diǎn)基因。我國(guó)分離出的PRV變異毒株TK基因相對(duì)于gC、gE較為保守，與國(guó)外毒株同源性可達(dá)99.5%～100%，屬同一分支[6-7]。因?yàn)門(mén)K基因的保守性較好，所以TK基因的生物學(xué)功能在不同的PRV毒株中具有代表性，可為抗PRV藥物的研發(fā)提供參考。

2.2.2gE基因gE基因位于US區(qū)，基因全長(zhǎng)1 740 bp，編碼577個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的非必需基因。gE基因是PRV的毒力基因之一，gE蛋白可以促進(jìn)PRV與細(xì)胞融合，介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散，缺失gE基因的PRV只能感染第一級(jí)三叉神經(jīng)和調(diào)控鼻黏膜的交感神經(jīng)，而不能擴(kuò)散感染第二級(jí)神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)元[8]，近年來(lái)我國(guó)部分地區(qū)分離出的PRV變異株gE基因氨基酸疏水殘基和親水殘基發(fā)生了突變，這可能會(huì)影響PRV與細(xì)胞的融合[9]，gE蛋白不具有免疫原性，缺失gE基因會(huì)降低病毒的毒力但不影響PRV免疫原性，因此gE基因可成為基因缺失疫苗的研發(fā)靶點(diǎn)，目前臨床應(yīng)用的PRV疫苗基本都缺失gE基因，可以通過(guò)檢測(cè)gE特異性抗體區(qū)分野毒感染和疫苗免疫。

2.2.3gB基因gB基因位于UL區(qū)，基因全長(zhǎng)2 800 bp，編碼913個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的必需基因，gB蛋白是一個(gè)復(fù)合蛋白由gBa、gBb、gBc組成，是囊膜的組成成分。gB蛋白參與病毒與細(xì)胞膜的融合，也可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。gB蛋白與三類融合蛋白類似，具有三聚體折疊，二聚體融合環(huán)，α-螺旋結(jié)構(gòu)，gB蛋白以膽固醇依賴方式通過(guò)融合環(huán)與細(xì)胞膜結(jié)合[10]。gB具有良好的免疫原性，周莎莎等將JS-2012與Bartha-k61的gB基因交換，顯著的改變了兩個(gè)毒株的免疫原性[11]，因?yàn)間B良好的免疫原性在臨床中可通過(guò)gB-ELISA檢測(cè)豬群是否獲得免疫保護(hù)。馬震元等建立了PRV-gB-CLEIA法，45 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，且具有良好的敏感性、特異性可實(shí)現(xiàn)抗體劑量值的定量檢測(cè)，為臨床gB抗體的檢測(cè)提供了更高效的手段[12]。

2.2.4gI基因gI基因位于US區(qū)，基因全長(zhǎng)1 053 bp，編碼351個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的非必需基因。gI蛋白是囊膜蛋白，可促進(jìn)病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散。gI與gE通常以非共價(jià)鍵形式復(fù)合體存在，gI蛋白能促進(jìn)gE蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分泌，保證gE蛋白的正確糖基化[13]，DONG等將經(jīng)典株gE/gI基因與變異株互換發(fā)現(xiàn)gE/gI基因變異可增強(qiáng)PRV毒力[14]。因?yàn)間E、gI蛋白關(guān)系密切，所以臨床上經(jīng)常以二者的重組蛋白作為抗原研發(fā)抗體檢測(cè)技術(shù)，申一蘭等用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了gE/gI重組蛋白純度較高，并且具有良好的反應(yīng)原性，為膠體金試紙的研發(fā)打下了基礎(chǔ)[15]。

2.2.5gD基因gD基因位于US區(qū)，基因全長(zhǎng)1 300 bp，編碼402個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的非必需基因。gD蛋白是囊膜蛋白，在PRV中高度保守并具有良好的免疫原性，gD基因是PRV吸附細(xì)胞所必需的，缺失gD基因的PRV無(wú)法感染細(xì)胞，與HSV相比PRV的gD蛋白只能與細(xì)胞表面受體Nectin-1結(jié)合，并且PRV對(duì)人源和豬源的Nectin-1受體結(jié)合能力并無(wú)差異，gD蛋白與Nectin-1受體以1∶1的比例結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別是N77、I80、M85、F129，其中F129位點(diǎn)有著決定性作用，若突變此位點(diǎn)病毒幾乎不能侵入細(xì)胞[16]。病毒進(jìn)入細(xì)胞是其感染機(jī)體的關(guān)鍵步驟，病毒只有進(jìn)入細(xì)胞才能進(jìn)行復(fù)制。gD基因是PRV吸附細(xì)胞的關(guān)鍵基因，通過(guò)了解gD蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合的機(jī)制可為后續(xù)研發(fā)抗PRV藥物提供參考。

2.2.6gC基因gC基因位于UL區(qū)，基因全長(zhǎng)1437 bp，編碼479個(gè)氨基酸，是PRV復(fù)制的非必需基因，成熟的gC糖蛋白大小為92 ku，是囊膜的組成成分。gC蛋白可與細(xì)胞表面的肝素樣受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞，但缺失gC蛋白的PRV仍對(duì)細(xì)胞有較低的感染性，此外gC蛋白具有多個(gè)抗原表位可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，王一鵬對(duì)從免疫豬場(chǎng)發(fā)病仔豬中分離出的變異PRV進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)gC基因多處發(fā)生單個(gè)或連續(xù)幾個(gè)堿基的置換、插入和缺失導(dǎo)致了gC蛋白的抗原表數(shù)目、位置、或氨基酸發(fā)生改變，國(guó)外疫苗株的抗血清對(duì)該變異毒株中和作用較差[17]，因此gC基因的變異可能是我國(guó)近年來(lái)各地出現(xiàn)免疫豬場(chǎng)PRV“返陽(yáng)”的原因之一。

2.2.7IE180基因IE180基因分別位于IRS和TRS區(qū)，編碼1460個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)大小約為153 ku。IE180基因是PRV中唯一的立即早期基因，可獨(dú)立發(fā)生轉(zhuǎn)錄。IE180蛋白累積后可啟動(dòng)病毒其他基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，PRV IE180蛋白與單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)ICP4蛋白部分區(qū)域有很高的相似度，二者部分功能互補(bǔ)[18]。鄧輝發(fā)現(xiàn)IE180 3′UTR端部分序列可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，抑制基因的轉(zhuǎn)錄，G-四鏈體配體小分子TmPyP4可穩(wěn)定此結(jié)構(gòu)，從而抑制PRV的早期增殖過(guò)程[19]。IE180基因轉(zhuǎn)錄位于PRV基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)端，對(duì)于PRV的復(fù)制有著重要意義，因?yàn)檫@一特性IE180基因也可成為抗PRV藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

2.2.8EP0基因EP0基因位于UL區(qū)，可編碼1 230個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約為45 ku，是PRV復(fù)制的非必需基因。EP0基因?qū)α⒓丛缙诨騃E180有反式激活作用，可促進(jìn)IE180蛋白的表達(dá)，EP0蛋白可與IE180蛋白共同作用激活TK基因及gG基因的轉(zhuǎn)錄，EP0蛋白定位于細(xì)胞核，并且EP0蛋白的入核由Ran蛋白、輸入蛋白α1、α3、β1共同調(diào)控[20]。缺失EP0基因的PRV在細(xì)胞中的復(fù)制能力會(huì)減弱，但并不影響PRV毒力[21]。目前對(duì)于EP0基因的研究較少，但不可否認(rèn)的是EP0基因?qū)τ赑RV基因轉(zhuǎn)錄具有重要意義。未來(lái)，EP0基因是如何調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，以及我國(guó)各地分離出的變異PRV毒株EP0基因是否發(fā)生變異，都應(yīng)該是我們積極探討的。

2.2.9UL21基因UL21基因位于UL區(qū)是PRV復(fù)制的非必需基因，pUL21是被膜蛋白，缺失UL21基因的PRV與野毒株相比增殖速率減慢，但在pUL21代償性細(xì)胞上可恢復(fù)其增殖能力，外源性的pUL21可抑制NF-κB通路，且pUL21量越高抑制效果越強(qiáng)[22]，UL21基因也與PRV的神經(jīng)浸染性有關(guān)，pUL21羧基端可與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白R(shí)oadblock-1互作，使用pUL21羧基端缺失的PRV攻毒小鼠后，小鼠死亡時(shí)間延長(zhǎng)，頸上神經(jīng)節(jié)中的病毒含量顯著降低[23]。相比國(guó)外疫苗毒株，我國(guó)近年來(lái)分離出的變異毒株UL21基因發(fā)生了突變，其pUL21表達(dá)水平升高，意味著變異毒株可能會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫抑制功能，以及神經(jīng)浸染性[24]。

2.2.10UL41基因UL41基因是PRV復(fù)制的必需基因，UL41基因編碼宿主關(guān)閉蛋白(vhs)，蛋白分子質(zhì)量約為40 ku，PRV與HSV-1的vhs同源性為38.4%。vhs蛋白在體內(nèi)外均具有核糖核酸酶活性，可降解宿主細(xì)胞的mRNA，抑制宿主基因表達(dá)。vhs可以切割I(lǐng)RES下游區(qū)域翻譯起始因子eIF4H和eIF4B，增強(qiáng)其核糖核酸酶活性[25-26]。但在PRV中，vhs蛋白并不是唯一能抑制宿主基因表達(dá)的病毒蛋白，缺失UL41基因的PRV仍對(duì)宿主基因表達(dá)有顯著的抑制作用，同時(shí)，缺失UL41基因也會(huì)顯著減弱PRV在體內(nèi)外的復(fù)制能力和感染力[27]。UL41基因編碼蛋白可抑制宿主細(xì)胞基因表達(dá)，通過(guò)進(jìn)一步研究vhs對(duì)哪些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響可為PRV對(duì)宿主細(xì)胞的作用的研究提供更多參考。

3 小結(jié)

PR因?yàn)槠渲虏×?qiáng)、傳播途徑多樣、可潛伏感染等特點(diǎn)，成為危害我國(guó)豬業(yè)養(yǎng)殖最嚴(yán)重的傳染病病原之一。PRV基因是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，基因發(fā)生變異的同時(shí)也意味著病毒生物學(xué)功能的改變，自2011年以來(lái)我國(guó)各地陸續(xù)從接種過(guò)PRV疫苗的“返陽(yáng)”豬場(chǎng)分離出了變異PRV毒株。這表明PRV變異并不是個(gè)例而已成為一種趨勢(shì)，在這種趨勢(shì)下了解PRV基因結(jié)構(gòu)及基因功能，才能從“已知”得“未知”，為預(yù)測(cè)PRV變異株的生物學(xué)功能提供參考。除此之外，了解PRV基因功能，有助于疫苗及藥物的研發(fā)，例如TK、gE基因是病毒的毒力基因且是病毒復(fù)制非必需的，故其可以成為基因缺失疫苗的靶點(diǎn)基因，通過(guò)檢測(cè)是否存在缺失基因相應(yīng)的抗體，還可對(duì)疫苗免疫豬及野毒感染豬進(jìn)行區(qū)分。gD基因、IE180基因、EP0基因，對(duì)于PRV感染細(xì)胞以及PRV的增殖都具有著重要作用，可成為抗PRV藥物研發(fā)的靶點(diǎn)基因。雖然目前PRV基因定位和基因功能還沒(méi)有完全被報(bào)道，但隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來(lái)對(duì)PRV基因結(jié)構(gòu)及功能的研究會(huì)不斷深入，為PRV的防控提供更多的參考。