欒宇軒，張 毫，王承寶*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省楊凌區(qū)職業(yè)技術(shù)教育中心，陜西楊凌 712100)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF) 是一種感染家豬和野豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病，臨床上以高熱、皮膚發(fā)紺和臟器廣泛性出血為特征，最急性型病死率達(dá)100%，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為法定報(bào)告的重大動(dòng)物疫病。

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的唯一成員，其基因組長(zhǎng)達(dá)170 kb～194 kb，編碼50余種結(jié)構(gòu)蛋白，150余種非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)中國(guó)科研團(tuán)隊(duì)首次解析的ASFV病毒顆粒結(jié)構(gòu)可知，該病毒由內(nèi)而外具有罕見的5層結(jié)構(gòu)，依次是病毒基因組、核心殼層、雙層脂膜、衣殼和外膜[1]。ASFV是唯一已知的蟲媒DNA病毒，其在非洲大陸和歐洲大陸的傳播媒介，主要是軟蜱科中的非洲鈍蜱和摩洛鈍蜱。但目前ASFV在我國(guó)的傳播媒介還未闡明，現(xiàn)有研究認(rèn)為，我國(guó)的樺尖鈍蜱和塔氏鈍蜱是其潛在的媒介[2]。

ASF最早報(bào)道于1921年，但由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜、變異度高，具有完備的免疫逃避機(jī)制，各類疫苗的研制大多以失敗告終，至今仍無獲批上市的商品化疫苗?，F(xiàn)有水平的疫苗株接種豬只后普遍存在毒力返強(qiáng)、持續(xù)帶毒和保護(hù)性不佳等問題。因此，豬群在沒有接種非洲豬瘟疫苗的前提下，血清中無ASFV特異性抗體或水平極低。血清學(xué)檢測(cè)基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，具有高度的敏感性和特異性，并且能大規(guī)模地進(jìn)行快速檢測(cè)。若發(fā)現(xiàn)ASFV抗體陽(yáng)性，則表明正在或已經(jīng)發(fā)生感染，對(duì)于疫病的早期控制和撲滅具有重要意義。本文重點(diǎn)討論了ASF各種血清學(xué)檢測(cè)方法，以及滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒活載體疫苗的研究進(jìn)展，旨在為ASF血清學(xué)檢測(cè)方法的開發(fā)提供新思路，為有效疫苗的研制提供借鑒。

1 ASF血清學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1.1 ELISA檢測(cè)方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是OIE推薦的首選血清學(xué)檢測(cè)方法，其大多是以具有良好抗原性的ASFV結(jié)構(gòu)蛋白為包被抗原，建立的間接檢測(cè)方法。該方法具有成本低、特異性好、靈敏度高和檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)，能夠用于大量樣品的自動(dòng)化檢測(cè)，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法。

串聯(lián)p72蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位，建立間接ELISA檢測(cè)方法，改良結(jié)構(gòu)蛋白抗原不集中、蛋白表達(dá)量低等問題[3]。以p30重組蛋白為包被抗原，建立間接ELISA檢測(cè)方法，其血清靈敏度可達(dá)1∶1600[4]。借助21個(gè)ASFV p30蛋白的單克隆抗體，鑒定出4個(gè)含線性表位的抗原區(qū)，其中2個(gè)高度保守，可用于ELISA檢測(cè)方法的建立[5]。通過優(yōu)化密碼子，改良在表達(dá)p54蛋白過程中易出現(xiàn)包涵體、丟失蛋白反應(yīng)原性等問題，為ELISA診斷試劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[6]。

1.2 膠體金免疫層析試紙條

OIE推薦的ASFV檢測(cè)方法如PCR、ELISA等，一般都需限制在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。而膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果容易判斷等優(yōu)點(diǎn)，而且適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法。以抗ASFV p72蛋白多克隆抗體作為檢測(cè)線，以葡萄球菌A蛋白作為質(zhì)控線，建立膠體金免疫層析檢測(cè)方法，其敏感性良好，最小檢測(cè)劑量可達(dá)15 ng和21 ng[7]。以金顆粒標(biāo)記的重組ASFV p30抗原作為檢測(cè)線，以p30蛋白及其多克隆抗體作為質(zhì)控線，建立金顆粒免疫層析檢測(cè)方法，其敏感性和特異性分別達(dá)到了92.52%和92.00%，可與標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑盒[8]相媲美。用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合免疫層析試紙條檢測(cè)ASFV，該方法最低檢出限度為200拷貝，與熒光定量PCR檢測(cè)方法符合率極高，具有快速、特異等優(yōu)勢(shì)，為多通道大規(guī)模檢測(cè)提供了發(fā)展方向[9]。

1.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

間接免疫熒光試驗(yàn)具有快速、敏感、高度特異的優(yōu)點(diǎn)，利用ASFV毒株感染單層綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，再通過抗原抗體反應(yīng)藕聯(lián)熒光素進(jìn)行檢測(cè)。如果檢測(cè)樣品為陽(yáng)性，可在細(xì)胞漿中觀察到特異性的免疫熒光。在ELISA檢測(cè)方法不便于建立或判定困難時(shí)，可應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 熒光抗體試驗(yàn)

熒光抗體試驗(yàn)一般用作ASFV輔助檢測(cè)方法，借助熒光顯微鏡和熒光標(biāo)記抗體，檢測(cè)豬脾臟、淋巴結(jié)等組織壓片或超薄冰凍切片中是否含有ASFV抗原。該方法特異性和敏感性好，但對(duì)檢測(cè)人員的操作要求較高，而且對(duì)亞急性和慢性感染的檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確，已逐漸被PCR檢測(cè)方法取代。

1.5 間接免疫過氧化酶試驗(yàn)

間接免疫過氧化酶試驗(yàn)應(yīng)用了免疫組織化學(xué)技術(shù)，利用感染ASFV的Vero細(xì)胞與過氧化物酶藕聯(lián)，可檢測(cè)血清或滲出液中是否存在ASFV抗體。該方法對(duì)設(shè)備的要求低，而且敏感性和特異性不遜于ELISA檢測(cè)方法，判定結(jié)果也較熒光抗體試驗(yàn)更為容易，但該方法能否取代ELISA檢測(cè)方法和熒光抗體試驗(yàn)，還需要獲取更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 免疫印跡法

免疫印跡法是基于高分辨率凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展起來的一種免疫生化雜交技術(shù)，該方法使得檢測(cè)過程更加可視，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可與間接免疫熒光試驗(yàn)共同用于確認(rèn)ELISA法的檢測(cè)結(jié)果。通過原核表達(dá)ASFV CP204L基因，建立一種新的免疫印跡監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Rec p30-IB)，其特異性達(dá)98.75%，敏感性達(dá)100%?？蓹z測(cè)極低量ASFV抗體蛋白的表達(dá)，而且較ELISA檢測(cè)方法更為省時(shí)，缺點(diǎn)是需要購(gòu)買昂貴的設(shè)備，增加了檢測(cè)成本[10]。

1.7 其他血清學(xué)檢測(cè)方法

建立一種使用干血拭子的檢測(cè)方法，能夠區(qū)分ASFV單純感染和混合感染，其特異性和敏感性高于PCR檢測(cè)方法[11]。針對(duì)ASFV的p72和p30蛋白，經(jīng)典豬瘟病毒的E2蛋白，基于微球技術(shù)建立了鑒別診斷經(jīng)典豬瘟和非洲豬瘟的血清抗體檢測(cè)方法，結(jié)果表明，其靈敏度和特異性可達(dá)97.3%和98.3%[12]。用量子點(diǎn)標(biāo)記SPA，以p73蛋白的優(yōu)勢(shì)表位合成多肽，分別作為質(zhì)控線和檢測(cè)線，建立ASFV抗體的量子點(diǎn)免疫層析試紙條，該方法與ELISA檢測(cè)方法符合率達(dá)100%，敏感性可達(dá)1∶320，可用于ASFV的快速檢測(cè)[13]。結(jié)合免疫層析試紙條和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立一種快速檢測(cè)方法，可在38℃、10 min內(nèi)進(jìn)行快速檢測(cè)，其準(zhǔn)確性與PCR結(jié)果符合率達(dá)100%，為檢測(cè)方法的開發(fā)提供了一種新思路[14]。

2 非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

雖然ASF最早發(fā)現(xiàn)于1921年，但疫苗的研究起步較晚，直到1967年才開始嘗試研制滅活疫苗，而且均告失敗。隨后分離得到部分天然弱毒疫苗候選株，但普遍存在殘余毒力，導(dǎo)致慢性感染等不良反應(yīng)。伴隨著基因工程的發(fā)展，重組弱毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒活載體疫苗也相繼展開研究，這些疫苗的優(yōu)點(diǎn)是可以敲除ASFV毒力基因，串聯(lián)表達(dá)多種病毒蛋白，起到增強(qiáng)安全性和保護(hù)性的作用，顯示出良好的應(yīng)用前景。

2.1 滅活疫苗

ASF滅活疫苗的保護(hù)效果并不理想。傳統(tǒng)滅活方法包括接種豬肺泡組織懸液、脾組織勻漿等不同培養(yǎng)方式，以及加熱、甲醛、甲苯、結(jié)晶紫、復(fù)方碘、β-丙內(nèi)酯、乙酰氮丙啶等物理或化學(xué)方法滅活病毒，然而均不能對(duì)強(qiáng)毒株攻擊提供有效的保護(hù)。用免疫佐劑如PolygenTM或Emulsigen?-D對(duì)ASF滅活疫苗研究，結(jié)果表明，接種豬后雖然產(chǎn)生了特異性抗體，但卻不具備保護(hù)作用，所有動(dòng)物均表現(xiàn)急性經(jīng)過，最后以失敗告終[15]。滅活疫苗不能提供有效保護(hù)，可能是因?yàn)椴《玖Ｗ拥牟煌墒旆绞骄哂胁煌拿庖咴?。病毒粒子的成熟包括?xì)胞內(nèi)成熟和細(xì)胞外成熟。細(xì)胞內(nèi)成熟是指在受感染細(xì)胞的病毒工廠(viral factory,VF)中組裝，形成包括病毒基因組、核心殼層、雙層脂膜和衣殼結(jié)構(gòu)的ASFV粒子，含有50余種蛋白；而細(xì)胞外成熟是指在VF中組裝后以出芽的形式獲得囊膜，并釋放到細(xì)胞外，形成含CD2v、p12等病毒蛋白和部分細(xì)胞蛋白的ASFV粒子。二者表面蛋白種類數(shù)量差異巨大，可能導(dǎo)致了免疫失敗。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過分離鑒定天然致弱毒株或使用人工手段產(chǎn)生致弱毒株，其中又包括連續(xù)傳代致弱毒株和基因工程重組致弱毒株。天然致弱毒株包括ASFV NHP68和OURT88/3，接種豬只后可抵抗同源強(qiáng)毒株的攻擊，并提供完全保護(hù)，根據(jù)免疫程序和注射劑量的不同，保護(hù)率為66%～100%，但是對(duì)異源毒株攻擊的保護(hù)率低，甚至沒有保護(hù)。近年來，在愛沙尼亞出現(xiàn)了一種5′端基因缺失的天然弱毒株，75%的仔豬和100%的家豬感染呈急性經(jīng)過后恢復(fù)正常[16]；從拉脫維亞野豬體內(nèi)分離得到ASFV基因Ⅱ型弱毒株Lv17/WB/Rie1，能引起非特異、亞臨床的癥狀，感染豬只后能完全抵抗相關(guān)強(qiáng)毒株的攻擊[17]。

這些天然弱毒疫苗還存在高熱、肺炎和慢性感染等不良反應(yīng)，其安全性還有待考察。以中國(guó)ASFV HLJ/18毒株為骨架，篩選出一種具有7個(gè)基因缺失的毒株HLJ/18-7GD，使用其免疫SPF豬、商品豬和妊娠母豬后，能對(duì)強(qiáng)毒攻擊提供完全保護(hù)，且不產(chǎn)生毒力返強(qiáng)，具有良好的保護(hù)性和安全性[18]。同時(shí)能夠在豬骨髓細(xì)胞高效增殖，具有大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可行性，成為當(dāng)前最理想的疫苗株。人工致弱毒株可在Vero細(xì)胞、豬骨髓細(xì)胞連續(xù)傳代致弱，但會(huì)出現(xiàn)ASFV基因組大段缺失和部分移碼突變，導(dǎo)致免疫失敗。用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除野強(qiáng)毒株Georgia07的8-DR基因，成功構(gòu)建ASFV重組病毒，并顯著提高了重組效率，為ASFV重組致弱毒株的建立提供了新的技術(shù)和工具[19]。

2.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是最安全的特異性抗原疫苗，先前的研究普遍集中于使用具有良好抗原性ASFV p30、p54、p72、pp62、CD2v等蛋白構(gòu)建亞單位疫苗，但面對(duì)ASFV強(qiáng)毒株攻擊的保護(hù)作用不強(qiáng)。用腺病毒和痘病毒載體，表達(dá)18種能被ASFV特異性淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原，結(jié)果未能提供有效保護(hù)[20]。有研究篩選了35種抗原制成亞單位疫苗，面對(duì)強(qiáng)毒攻擊仍以失敗告終[21]。因此，盲目地大量表達(dá)抗原基因是不可行的，需要合理篩選、組合抗原基因，并改進(jìn)抗原表達(dá)系統(tǒng)和免疫策略。有研究提出CD2v和C型凝集素蛋白在保護(hù)性免疫上發(fā)揮了重要作用，其基因突變會(huì)導(dǎo)致ASFV毒力減弱，對(duì)亞單位疫苗的研發(fā)具有指導(dǎo)作用[22]。將亞單位疫苗和減毒活疫苗相結(jié)合，用載體表達(dá)ASFV特異性抗原作初次免疫，再以減毒活疫苗增加能夠識(shí)別的抗原表位，作為加強(qiáng)免疫，能夠提高免疫效果，為亞單位疫苗的使用提供了新思路[23]。

2.4 DNA疫苗

DNA疫苗能夠顯著誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，不存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，展示出良好的開發(fā)潛力。將ASFV特異性蛋白和cDNA混合免疫豬只，發(fā)現(xiàn)能夠引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是使用重組蛋白pCD2-E和重組質(zhì)粒pcDNA312R免疫豬后，其血清可在體外中和病毒[24]。用上述相同的ASFV特異性蛋白和不同的cDNA構(gòu)建DNA疫苗，對(duì)豬只進(jìn)行了3次接種，在使用ASFV Armenia 2007株的強(qiáng)毒攻擊時(shí)，接種疫苗的豬非但不能受到有效保護(hù)，反而增強(qiáng)了ASFV的感染[25]。表明構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可以選擇ASFV結(jié)構(gòu)蛋白基因(如p30、p54、p72等)、膜蛋白基因(如CD2v)進(jìn)行免疫，也可使用DNA表達(dá)文庫(kù)的思路，但前提是需要合理篩選抗原基因，才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和活性的特異性抗體，否則可能會(huì)導(dǎo)致感染的加重。

2.5 病毒活載體疫苗

除體液免疫外，細(xì)胞免疫在ASFV感染的防御中也發(fā)揮了重要作用。病毒活載體疫苗的使用可以更好地刺激細(xì)胞免疫和CTL效應(yīng)。以α病毒為載體(RPs)，分別融合p30(RP-30)、p54(RP-54)、pHA72(RP-sHA-p72)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RP-30基因的免疫原性最強(qiáng)，其次是RP-54和RP-sHA-p72[26]。用47個(gè)具有潛在保護(hù)性的ASFV抗原基因制成了DNA疫苗和牛痘病毒活載體疫苗，將二者聯(lián)用后，共同促進(jìn)豬群的免疫反應(yīng)，再以致死劑量的毒株Georgia 2007/1做攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，雖然呈現(xiàn)急性經(jīng)過，但能夠從分子水平上顯著降低病毒基因組的表達(dá)[27]。

3 展望

目前非洲豬瘟持續(xù)影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，要阻止疫病的傳播，首先要進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷。雖然ELISA檢測(cè)方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但如果血清的運(yùn)輸或保存不當(dāng)，就可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的現(xiàn)象，對(duì)判定結(jié)果造成影響。而且使用血清學(xué)檢測(cè)方法需要采集血液樣本，由于血液中有較高水平的病毒，如果采血不當(dāng)就會(huì)增加病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)開發(fā)更多以組織液、口腔液體為目標(biāo)樣本的檢測(cè)方法。除此之外，在ASFV感染早期不易通過血清學(xué)檢測(cè)方法檢出，還須結(jié)合病原分離、PCR檢測(cè)等病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

由于ASFV變異迅速、具有完備的免疫逃避機(jī)制，目前疫苗的研發(fā)仍存在困難?，F(xiàn)有水平的滅活疫苗已均告失敗。亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒活載體疫苗等基因工程疫苗的研發(fā)依賴抗原基因的合理選擇，因此需要深入開展ASFV結(jié)構(gòu)解析、抗原基因或蛋白的鑒定、免疫保護(hù)機(jī)制的研究工作，同時(shí)開發(fā)高效的抗原表達(dá)系統(tǒng)，提高疫苗株的遺傳穩(wěn)定性，以更好地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體，因此短期內(nèi)不易研發(fā)出理想疫苗。

減毒活疫苗的保護(hù)效果最為理想，是短期內(nèi)疫苗的研發(fā)方向。文中提到的中國(guó)毒株HLJ/18-7GD已通過安全性和有效性評(píng)價(jià)，即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。同時(shí)，ASFV具有自然減毒的致弱規(guī)律，會(huì)和寄生宿主家豬和野豬逐漸相互適應(yīng)，現(xiàn)已存在感染ASFV后無癥狀的病例[28]，通過深入研究，可以為ASF疫苗研發(fā)提供新的思路。雖然目前在制備疫苗方面困難重重，但相信最終會(huì)研發(fā)出理想疫苗，實(shí)現(xiàn)ASF的有效防控。

最后，要實(shí)現(xiàn)ASF的凈化，還要研究清楚ASF的流行病學(xué)規(guī)律。ASFV的寄生宿主包括家豬、野豬和鈍蜱，目前國(guó)內(nèi)主要為家豬感染，但2019年12月陜西省佛坪縣報(bào)道了3起野豬感染ASFV死亡的病例，2020年3月湖北省神農(nóng)架林區(qū)又報(bào)道了7起同樣的病例，對(duì)ASF的凈化帶來了極大的困難。因此，一方面科研人員還需要深入研究ASFV進(jìn)入野豬和軟蜱后的維持與擴(kuò)散機(jī)制，另一方面豬場(chǎng)工作人員在沒有疫苗的條件下，必須嚴(yán)格做好消毒、隔離、檢測(cè)和撲殺工作，依據(jù)“早、快、嚴(yán)、小”的原則做好科學(xué)防控，最終實(shí)現(xiàn)ASFV在我國(guó)的凈化。