楊 梅，胡小蘭，申 濤，譚 康，劉代鈴，邱紅波

(貴州大學 農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025)

玉米是目前種植面積最廣的作物之一，其用途廣泛，是不可或缺的飼料、食品、工業(yè)原料，對我國糧食安全極其重要。近年來灰斑病成為世界范圍內(nèi)最嚴重的玉米病害之一，該病由多種尾孢菌所致[1]。在中國，主要病原是玉蜀黍尾孢(Cerosporazeae-maydis)、玉米尾孢(Cercosporazeina)[2]。目前，玉米灰斑病在我國多地區(qū)發(fā)生[3]，嚴重影響了玉米產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。貴州省玉米灰斑病主要在中西部高海拔地區(qū)(貴陽市、安順市、黔西南州、六盤水市、畢節(jié)市等)發(fā)生[5]。生產(chǎn)中主要通過化學農(nóng)藥來防治該病害，但化學防治易引發(fā)環(huán)境、生態(tài)等方面的問題，培育抗性品種是最佳的防治途徑[6]，而抗病育種的基礎在于抗源材料的篩選和獲得[7]。前人對玉米種質(zhì)資源灰斑病的抗源篩選進行了大量的研究工作，但發(fā)現(xiàn)的高抗和抗病類型占比較小，除少部分含熱帶、亞熱帶血緣種質(zhì)表現(xiàn)抗病外，大多數(shù)常用自交系均表現(xiàn)高感和感病[8]。目前為止，在眾多玉米灰斑病數(shù)量性狀座位(QTL)定位報道中發(fā)現(xiàn)玉米的10條染色體上均存在抗病QTL[9]。對常用種質(zhì)資源進行抗性改良，構建染色體片段代換系可作為品種改良的理想材料，并已在水稻、小麥、番茄、大麥等作物中得到廣泛應用[10-13]。課題組前期在玉米第8染色體上發(fā)掘了玉米抗灰斑病主效QTL[14]。本研究以自交系J51為受體、T32為供體構建第8染色體單片段代換系，并對獲得的代換系進行玉米灰斑病抗性鑒定，以期為抗灰斑病玉米種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高抗灰斑病自交系T32為供體、高感灰斑病自交系J51為受體，利用連續(xù)回交、自交和SSR標記輔助選擇相結合的方法，篩選出以J51為背景的染色體單片段代換系群體，以此群體為試驗材料。

前期群體構建于2013—2017年在海南省貴州南繁基地(海南省樂東縣九所互通)、貴州大學教學試驗地(貴陽)和云南省德宏州芒市3地進行。染色體片段代換系構建過程如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗設計

本研究采用自然接菌的方法，于2018、2019年將篩選出來的回交導入系種植于云南省芒市：勐嘎鎮(zhèn)勐嘎村(海拔1 400 m)和江東鄉(xiāng)李子坪村(海拔1 844 m)，兩地環(huán)境多雨寡照，氣溫和濕度非常適合灰斑病的發(fā)生，屬于玉米灰斑病的重發(fā)區(qū)[15]。田間種植采用隨機區(qū)組設計，設置2次重復，單行區(qū)，每小區(qū)20株，行距0.75 m，株距0.25 m，每隔10行種植1行感病親本J51作為對照，栽培管理同當?shù)厣a(chǎn)一致。

1.2.2 簡單重復序列標記選擇

選取第8染色體上的145對微衛(wèi)星標記進行親本間的多態(tài)性篩選，將具有多態(tài)性的引物用于代換系的追蹤檢測與供體片段的結構評價。

DNA的制備。于玉米5葉期取樣，參照改進的CTAB法[16]提取玉米基因組總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量合格后即可保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增。反應總體系為10 μL，該體系包括10×Buffer 1.2 μL，左、右引物各1 μL，模板2 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq聚合酶0.1 μL，ddH2O 4.5 μL，最后加入10 μL石蠟油。將配好的體系放入PCR儀中進行擴增，其程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物用30%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 田間玉米病級調(diào)查及其評價

授粉2～3周后，在玉米乳熟期，根據(jù)玉米葉片上的發(fā)病情況可將玉米灰斑病的發(fā)病程度分為5個級別，當感病對照材料J51的發(fā)病程度達到9級及以上，則可視為有效鑒定。分級參照我國葉斑病病級劃分通用標準[17]：1級，病斑比例0～5%，病斑表現(xiàn)為無或少許；3級，病斑比例6%～10%，少量病斑；5級，病斑比例11%～30%，病斑較多；7級，病斑比例31%～70%，有大量的病斑；9級，病斑比例71%～100%，表現(xiàn)為葉片枯死，葉片上基本全為病斑。

1.2.4 代換片段長度計算

代換片段長度計算參照Young等[18]方法，代換片段的估計長度等于最小長度和最大長度的平均值(圖2)。經(jīng)電泳檢測某一段染色體兩側標記基因型都與供體親本基因型一樣時，即可認為這一段全為供體片段；當其中1個為供體基因型、另1個為受體基因型時，即可認為此片段一半為供體、一半為受體片段。

X為標記；LMIN為代換片段的最小長度；LMAX為代換片段的最大長度；L為代換片段的估計長度。X， Marker; LMIN， Minimum length of substitution segment; LMAX， Maximum length of substitution segment; L， Estimated length of substitution segment.圖2 代換片段長度計算示意圖Fig.2 Schematic diagram of calculating the length of the substitution segment

2 結果與分析

2.1 親本間多態(tài)性標記篩選

從玉米基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org/)中挑選出分布于第8染色體上間距相等的145對SSR引物，用于親本間的多態(tài)性篩選。共篩選出65對在兩親本間具有多態(tài)性的SSR標記用于群體代換系檢測，其中代換系供體片段評價選用了29對SSR引物(圖3)。

2.2 染色體片段代換系對玉米灰斑病的抗性鑒定

利用65對多態(tài)性SSR引物對代換系群體進行標記跟蹤，獲得單片段代換系材料23份，通過自然接菌的方式對其進行抗性研究。兩年兩地抗性鑒定試驗中，感病對照親本的發(fā)病程度均達到9級，抗病親本發(fā)病程度均為1級(表1)，符合試驗要求。在23份代換系材料中，H3系和H17系發(fā)病程度較低，兩年病級均值分別為2.85和2.90，H3病級變異范圍1～7，病級標準差為0.80～1.50，H17系病級變異范圍1～3，病級標準差為0～0.60，均表現(xiàn)為抗病。H1系、H7系兩年的病級均值分別為5.90、5.80，H1系病級變異范圍5～7，病級標準差范圍0.98～1.34，H7系病級變異范圍3～9，病級標準差范圍0.98～1.00，表現(xiàn)為中抗；H18系表現(xiàn)感病，病級均值為6.75，病級變異范圍5～9，病級標準差為0～1.2；其余株系表現(xiàn)均為高感。綜上，H3和H17為抗性較好的株系。

2.3 各染色體代換系的供體片段評價

用第8染色體上29個SSR標記對代換系進行遺傳結構分析發(fā)現(xiàn)，代換片段長度在10.40～129.70 cM，平均長度為36.99 cM，導入片段總長為850.67 cM(表2)。其中，H3系在umc1034-csu329處被代換，代換長度為32.13 cM，H17系在umc1034-csu329-bnlg1828-umc1807-umc2354處被代換，代換長度為63.14 cM。兩株系代換位點均在umc1034-csu329處相同，且具有相同抗病等級，由此推測此代換位點可能存在抗性基因。

左為T32，右為J51。T32 was on the left， J51 was on the right.圖3 親本多態(tài)性引物篩選Fig.3 Screening of parent polymorphic primers

表1 染色體片段代換系玉米灰斑病的抗性鑒定

表2 代換片段系的遺傳分析

3 結論與討論

玉米灰斑病遺傳研究較為復雜，由多基因互作調(diào)控[7]，屬于氣傳性病害，易受環(huán)境因素影響[19]，故利用染色體片段代換系遺傳背景簡單的優(yōu)點可以簡化玉米灰斑病的抗性研究。本研究以T32為供體親本、J51為受體親本構建的染色體單片段代換系為材料，通過23個代換系進行玉米灰斑病抗性鑒定，對兩年兩地抗性鑒定結果進行變異范圍和標準差統(tǒng)計，23個染色體片段代換系出現(xiàn)4種表型變異，即抗病(H3系、H17系)、中抗(H1系、H7系)、感病(H18系)、高感(H2系、H4系、H5系、H6系、H8系、H9系、H10系、H11系、H12系、H13系、H14系、H15系、H16系、H19系、H20系、H21系、H22系、H23系)。盡管目前已有大量關于玉米抗灰斑病QTL的報道，在玉米10條染色體上均發(fā)現(xiàn)抗玉米灰斑病的QTL，但并未有抗玉米灰斑病基因被克隆。Zhang等[20]以高抗自交系Y32和高感自交系Q11為親本，利用F2:3家系的表型分析得出bin8.02處存在玉米抗灰斑病QTL，曹國輝[21]通過SSR標記對(掖478×SH1)×掖478的回交導入群體(BC4F4)中的6份抗病植株進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，在bin8.05-8.06區(qū)段檢測到與玉米灰斑病抗性相關的QTL。H3系和H17系均在標記umc1034-csu329處被供體T32代換，表現(xiàn)抗玉米灰斑病，產(chǎn)生抗性變異的原因可能是由于umc1034-csu329段供體片段的插入，推斷該位點(bin8.03)可能存在抗性基因。目前玉米抗灰斑病品種匱乏，抗性代換系的獲得有助于玉米灰斑病的深入研究，對玉米抗灰斑病育種具有重要理論意義和實踐價值。

本試驗所用自交系T32是具有熱帶血緣的Suwan選系材料，不僅對灰斑病表現(xiàn)高抗，還是貴州省多個審定雜交品種的親本，J51是貴州省常用優(yōu)良自交系，適應性強，配合力高。由上述兩親本所產(chǎn)生的代換系對灰斑病的抗性均優(yōu)于感病親本，本研究所獲表型為抗病的H3系和H17系可以作為下一步挖掘基因的重要目標區(qū)域，為基因克隆和功能驗證等相關研究奠定基礎。