孟幼青，汪恩國，陳吳健，李艷敏，程 帆，孟敏霞

(1.浙江省植保檢疫與農藥管理總站，浙江 杭州 310020； 2.臨海市農業(yè)技術推廣中心，浙江 臨海 317000； 3.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016； 4.諸暨市農業(yè)農村局，浙江 諸暨 311800)

浙江地處亞熱帶季風氣候區(qū)，柑橘是全省第一大水果，產(chǎn)地主要集中在溫州、麗水、臺州、寧波、衢州、杭州6市的20余個縣(市、區(qū))，全省種植面積8.80萬hm2，年產(chǎn)量180余萬t，年產(chǎn)值超45億元。黃巖蜜橘、臨海(涌泉)蜜橘、象山紅美人、蒼南(馬站)四季柚、溫州甌柑、玉環(huán)文旦、慶元甜橘柚等優(yōu)良品種享譽海內外[1-2]。2000年以來，柑橘黃龍病(Huanglongbing，HLB)在浙江擴散為害，成為制約當?shù)貎?yōu)勢柑橘產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要障礙[2-8]。學者們圍繞柑橘黃龍病已經(jīng)進行了許多研究[3-16]，發(fā)現(xiàn)黃龍病在我國主要通過亞洲柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama，又稱Asian citrus psyllid)作為介體傳染傳播擴散，其病原菌主要為CandidatusLiberibacterasiaticus(CLas)。梳理現(xiàn)有研究：烏天宇等[3]針對亞洲柑橘木虱成蟲和若蟲感染HLB的獲菌效率，Grafton-Cardwell等[4]針對亞洲柑橘木虱的生物學防治，陳夢瑤等[6]針對長鏈非編碼RNA(lncRNA)在亞洲柑橘木虱與CLas上的互作效率驗證等做了較細研究；但仍缺乏關于亞洲柑橘木虱的CLas陽性大范圍分布變化及其擴散感染規(guī)律的研究。為了更好地探清介體昆蟲亞洲柑橘木虱上CLas的陽性分布特性和月(年)度變化規(guī)律，明確其CLas陽性分布區(qū)域和適宜治蟲防病的窗口期，筆者于2002—2019年針對浙江柑橘果園的分布情況，對全省重點果園的亞洲柑橘木虱進行采樣檢測，通過熒光定量PCR技術，對CLas陽性分布特性、CLas陽性率消長軌跡等進行研究，以期為提升柑橘黃龍病的監(jiān)測預警防控水平提供科學依據(jù)，助力浙江省優(yōu)勢柑橘產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 亞洲柑橘木虱CLas采樣方法

針對浙江省柑橘種植的分布情況，突出重點產(chǎn)區(qū)重點果園，于2002—2019年對溫州、臺州、麗水、寧波和金華等5市的蒼南、泰順、瑞安、龍灣、甌海、永嘉、樂清、玉環(huán)、溫嶺、路橋、椒江、黃巖、臨海、仙居、三門、青田、蓮都、縉云、云和、龍泉、寧海、象山、永康、金東等24個縣(市、區(qū))發(fā)生亞洲柑橘木虱的柑橘果園，采用定園定期和不定園不定期相結合的方式進行采樣。在果園中，以梅花式確定柑橘樹若干株，原則上每株依東南西北中5個方位采集亞洲柑橘木虱成蟲，一般每園采集蟲量控制在50～100頭，定檢30～45頭。黃龍病樣品每果園采樣100株，每株按東南西北中采5葉為1樣品。

1.2 亞洲柑橘木虱CLas檢測方法

1.2.1 樣品前處理

樣品制備所使用的工具——剪刀、鑷子、研缽等，均經(jīng)121 ℃ 30 min高壓蒸汽滅菌處理。處理完不同樣品后，工具均使用70%乙醇溶液擦拭2次，以避免樣品間的交叉污染。

待測柑橘組織樣品(葉片)處理：撕取葉片中脈，放于消毒滅菌研缽中，加入液氮研成粉末，取約200 mg粉末裝入1.5 mL離心管中，用于提取DNA。

亞洲柑橘木虱樣品處理：挑取單頭木虱，清水漂洗干凈后，放入1.5 mL離心管內，用塑料研磨棒磨碎，加200 μL裂解液，用于提取DNA。

1.2.2 樣品DNA提取

由羅氏公司的全自動核酸提取儀(型號為Roche MagNA Pure96)與試劑盒MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit結合使用完成。

1.2.3 PCR擴增檢測

參照國家標準GB/T 28062—2011中的黃龍病亞洲種實時熒光PCR檢測探針法，使用羅氏公司的Light Cycler 480 II實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR擴增。

1.2.4 標準曲線繪制

根據(jù)GB/T 28062—2011中的黃龍病亞洲種實時熒光PCR檢測引物擴增柑橘黃龍病菌目標基因，目標片段大小為87 bp，通過TA克隆將克隆出的片段保存于T載體中，得到標準陽性樣品。對標準樣品進行10倍梯度(101～106)稀釋，分別進行熒光定量PCR分析，構建標準曲線。

1.2.5 檢測結果的判定

直接讀取檢測結果，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準，陰性對照和空白對照應無Ct值，并且無擴增曲線；否則，此次檢測視為無效。陽性對照的Ct值應小于28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，否則此次檢測視為無效。

測試樣品的檢測Ct值≥40或者無Ct值并且無擴增曲線，且陰性對照、陽性對照、空白對照結果正常的，判定該樣品為陰性；測試樣品的檢測Ct值≤35，出現(xiàn)典型的擴增曲線，且陰性對照、陽性對照、空白對照結果正常的，判定該樣品為陽性。

1.3 數(shù)據(jù)計算

使用Excel 2020進行數(shù)據(jù)整理。計算亞洲柑橘木虱的Clas攜菌量及其陽性率。

2 結果與分析

2.1 浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性分布特性

如圖1所示，于2014年從甌海、瑞安、樂清、蒼南、永嘉、椒江、路橋、溫嶺、蓮都、青田、云和、金東、永康等地的18個柑橘果園采集亞洲柑橘木虱成蟲，檢測表明，在東西方向上亞洲柑橘木虱的CLas陽性率自東向西逐漸減弱。對亞洲柑橘木虱的CLas攜菌量(y)與果園所處經(jīng)度(x1)進行建模：y=56 046 308.55x1-6 713 626 279.00(n=18，R2=0.509 0，P=0.000 9)。當y=0時，x1=119.80，即理論上浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性分布范圍主要為119.80°E以東的柑橘果園。于2017—2019年從地處浙西衢江(29.00°N，119.04°E)的果園中采檢樣品300個，亞洲柑橘木虱的CLas攜菌量均為0。由此可見，浙江省亞洲柑橘木虱CLas的陽性分布西緣約為119.80°E。

圖1 浙江省不同經(jīng)度果園內柑橘木虱成蟲CLas攜菌量的變化趨勢Fig.1 Variation of CLas quantity in adult Asian citrus psyllid in Zhejiang orchards from west to east

如圖2所示，于2014年對2000年以后入侵感染黃龍病的樂清、椒江、路橋、溫嶺、臨海、三門、仙居、蓮都、青田、龍泉、永康、寧海、象山等13個縣(市、區(qū))的柑橘果園進行亞洲柑橘木虱成蟲采樣，經(jīng)檢測分析，浙江省亞洲柑橘木虱的CLas陽性分布表現(xiàn)出自南向北逐漸擴散減弱的趨勢。對亞洲柑橘木虱的CLas攜菌量(y)與果園所處緯度(x2)進行建模：y=-85 782 543.81x2+2 503 928 411.0(n=13，R2=0.337 5，P=0.037 3)。當y=0時，x2=29.20，即理論上浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性的分布范圍主要為29.20°N以南的柑橘果園。由此可見，理論上，浙江省亞洲柑橘木虱的CLas陽性分布北緣為29.20°N左右。

2.2 亞洲柑橘木虱CLas陽性率與HLB發(fā)病率的關系

圖2 浙江省不同緯度果園內柑橘木虱成蟲CLas菌量的變化趨勢Fig.2 Variation of CLas quantity in adult Asian citrus psyllid in Zhejiang orchards from north to south

于2002—2003年對浙東南的黃巖、樂清、蓮都等3市(區(qū))的13個柑橘果園采集樣本，檢測其亞洲柑橘木虱CLas陽性率和HLB發(fā)病率，結果如表1所示。對表1的數(shù)據(jù)進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)所調查的果園中亞洲柑橘木虱的CLas陽性率(y1)與HLB發(fā)病率(x3)存在極顯著(P<0.01)的邏輯斯蒂模型(Logistic model)關系，擬合的回歸方程為以上結果表明，柑橘果園HLB病株是亞洲柑橘木虱成蟲吸食帶菌的重要菌源基礎，亞洲柑橘木虱成蟲的CLas陽性率隨果園HLB發(fā)病率上升而提高。

2.3 浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性率消長動態(tài)

2.3.1 月際消長軌跡

于2003年3月至2004年2月選定樂清市湖霧鎮(zhèn)興上村的某柑橘果園逐月采集亞洲柑橘木虱成蟲樣品，檢測其CLas陽性率，從當年3月開始到次年2月結束，每月3次重復，每重復采檢成蟲30頭。如圖3所示，亞洲柑橘木虱CLas陽性率月際變化呈波浪式山峰型結構：第1峰為4月份，即果園內亞洲柑橘木虱種群春峰活動期；第2峰為7月份，即果園夏梢期，此時亞洲柑橘木虱種群處于低谷期，但CLas陽性率相對趨高；第3峰為12月份，為全年性秋后CLas陽性高峰期，此時的亞洲柑橘木虱種群經(jīng)秋繁活動后，到12月形成了越冬性蟲源陽性高峰。從治蟲防病角度來看，春、夏、秋3梢初期為最佳的窗口期，應加強3梢初期的治蟲防病，以免梢期陽性成峰，尤要注意的是12月份，亞洲柑橘木虱蟲口正值越冬性環(huán)境，無法用藥防控，若不提前防控，即使當時用藥，效果也不甚理想。

表1 浙東南13個柑橘果園的亞洲柑橘木虱CLas陽性率與HLB發(fā)病率

圖3 浙南果園亞洲柑橘木虱CLas陽性率的月際變化Fig.3 Monthly variation of CLas positive rate in orchard of southern Zhejiang

圖4 浙江省內果園亞洲柑橘木虱CLas陽性率的年際變化Fig.4 Annual variation of CLas positive rate in Zhejiang orchards

2.3.2 年限消長軌跡

3 討論

3.1 浙江省亞洲柑橘木虱CLas攜菌量分布呈現(xiàn)由南而北、自東向西雙向遞弱趨勢

對浙江省亞洲柑橘木虱CLas攜菌量與果園經(jīng)緯度的關系進行分析，結果顯示，自東向西、由南而北，其CLas攜菌量逐漸減弱，且攜菌量與經(jīng)緯度分別呈線性關系。推算發(fā)現(xiàn)，浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性分布范圍為：北至29.20°N，西至119.80°E左右。這與王曉亮等[16]在浙江、福建、江西、湖北、湖南、廣東、廣西、海南、重慶、四川、貴州、云南等地開展亞洲柑橘木虱專項調查確認的北界29°29′N基本一致。但本研究從CLas攜菌量上進行推測，首次明確浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性分布西緣在119.80°E左右。

3.2 浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性率與HLB發(fā)病率呈邏輯斯蒂模型變化規(guī)律

對樂清、黃巖、蓮都3市(區(qū))13個果園柑橘木虱CLas陽性率與HLB發(fā)病率的關系進行測定，發(fā)現(xiàn)亞洲柑橘木虱CLas陽性率隨HLB發(fā)病率增加而上升，并呈邏輯斯蒂變化規(guī)律，HLB發(fā)病嚴重的柑橘果園，亞洲柑橘木虱CLas陽性率亦高。

3.3 浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性率在月際間呈3峰型、年際間呈2次曲線變化規(guī)律

對樂清市湖霧鎮(zhèn)興上村某柑橘果園逐月采樣檢測發(fā)現(xiàn)，其CLas陽性率月際間表現(xiàn)為山峰型波浪式變化結構，峰期分別為4、7、12月，分別對應亞洲柑橘木虱種群春繁活動，盛夏低谷相對陽性率高峰和秋后越冬蟲源高峰，其陽性率分別為43.33%、60.00%、63.33%，有逐峰逐浪升高的趨勢。余繼華等[11]認為，冬季和春季為亞洲柑橘木虱防治的最佳窗口期，但其只考慮了CLas陽性成峰，忽略了昆蟲的越冬特性。本研究從治蟲防病實際需求的角度分析，認為春、夏、秋3梢初期為最佳窗口期。加強3梢初期的治蟲防病，既可提高持續(xù)控制亞洲柑橘木虱的效果，又可嚴防各梢期亞洲柑橘木虱CLas陽性率成峰，料想對柑橘果園HLB的整體防治效果具有更大意義。

以2001年為起始年，根據(jù)年際間亞洲柑橘木虱CLas陽性率的變化趨勢推算，理論上2010年浙江省亞洲柑橘木虱CLas陽性率處于最高值，然后趨于緩降，并預計2021年將進入新的周期性變化軌道。此變化規(guī)律，既是亞洲柑橘木虱種群自身行為活動的結果，也是堅持人為持續(xù)治蟲防病和浙江省柑橘黃龍病整體檢疫防控共同效應的成果。