江楊華，李艷，代國(guó)知，羅麗裴，陳虹亮

(郴州市第一人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，b.血管外科，湖南郴州423000)

沙眼衣原體(Chlamydozoatrachomatis，CT)是引起性傳播疾病的常見病原體之一，據(jù)報(bào)道全球每年約新增1.3億病例[1]。由于該病原體可以通過多種機(jī)制逃避宿主的免疫反應(yīng)[2]，大部分患者呈攜帶感染，表現(xiàn)為無癥狀，感染后常常被忽視，而延誤治療。感染CT的孕婦可以垂直傳染給新生兒，引起沙眼衣原體肺炎。由于大部分孕婦在懷孕期間沒有進(jìn)行常規(guī)篩查和治療，目前這種病原體仍然是引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原體。本研究擬通過調(diào)查分析湖南郴州地區(qū)3個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒沙眼衣原體肺炎的發(fā)病情況、臨床特征、CT的基因型分布以及不同基因型CT的致病力差異，為臨床對(duì)嬰幼兒沙眼衣原體肺炎的診治、預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年2月1日至2020年1月30日間在郴州市第一人民醫(yī)院住院、年齡≤3個(gè)月的肺炎患兒719例，兒童來源分布于郴州地區(qū)各縣市區(qū)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)病年齡≤90 d；(2)符合嬰幼兒感染性肺炎診斷：具有咳嗽、氣促、發(fā)熱、發(fā)紺等呼吸道癥狀；肺部聽診可聞及中細(xì)濕啰音或痰鳴音；具有雙肺浸潤(rùn)影，肺門旁及內(nèi)中帶肺野間質(zhì)條索影、片絮影、斑片影等影像學(xué)改變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性氣道發(fā)育異常、胎糞吸入綜合征、新生兒急性呼吸窘迫綜合征患兒；(2)痰培養(yǎng)為真菌或百日咳的病例；(3)病例資料不全者。重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)一般情況差；(2)拒食或脫水征；(3)意識(shí)障礙；(4)呼吸頻率明顯增快(嬰兒RR>70次/分)；(5)紫紺；(6)呼吸困難(呻吟、鼻翼扇動(dòng)、三凹征)；(7)多肺葉受累或≥2/3 肺受累；(8)胸腔積液；(9)血氧飽和度≤0.92；(10)肺外并發(fā)癥。出現(xiàn)任何一項(xiàng)即診斷重癥肺炎。根據(jù)研究對(duì)象肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中是否檢出CT，將患兒分為CT感染患兒組94例和非CT感染患兒組625例。記錄入院時(shí)嬰兒的臨床、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)表現(xiàn)及出生時(shí)的有關(guān)情況。

1.2儀器及試劑 NP968C核酸提取儀及配套提取試劑(西安天隆公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，ADVIA 2120i全自動(dòng)血液分析儀、BNⅡ全自動(dòng)特定蛋白分析儀(德國(guó)西門子公司)。沙眼衣原體(CT)核酸熒光定量檢測(cè)試劑(湖南圣湘公司)，2×Taq Plus Master Mix(北京康為世紀(jì)公司)，引物由Invitrogen公司合成，C反應(yīng)蛋白(CRP)測(cè)定(散射比濁法)試劑(德國(guó)西門子公司)。

1.3BALF采集 由臨床醫(yī)生采集，即在利多卡因氣道黏膜麻醉下，經(jīng)鼻部、會(huì)厭到達(dá)支氣管各段開口，給予37 ℃生理鹽水0.5～1 mL/kg進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集BALF于無菌容器中送檢。

1.4血液標(biāo)本常規(guī)檢驗(yàn)及BALF標(biāo)本細(xì)胞形態(tài)分析 用散射比濁法在BNⅡ全自動(dòng)特定蛋白分析儀上檢測(cè)CRP，在ADVIA 2120i全自動(dòng)血液分析儀上采用細(xì)胞化學(xué)染色、激光二維技術(shù)和流式細(xì)胞學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。BALF標(biāo)本采用改良版萊特-吉姆薩染色法獲得各分類細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，報(bào)告不同細(xì)胞類型在細(xì)胞總數(shù)中的比例。

1.5CT的初篩 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，按照試劑盒說明書操作，病原體DNA拷貝數(shù)在500 copies/mL以上者定為陽(yáng)性，每次PCR運(yùn)行均包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.6CT分型 CT篩查陽(yáng)性者用巢式PCR擴(kuò)增編碼CT主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)的ompA基因，參照GenBank中基因序列(accession number:gi1938326)設(shè)計(jì)引物。第一步PCR的引物為P1(5′-ATGAAAAAACTCTTGAAATC

G-3′)和P2(5′-CTCAACTGTAACTGCGTATTT-3′)，PCR反應(yīng)體系體積為25 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，150 μg/mL DNA模板2 μL，去離子水8.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第二步PCR采用第一步PCR的產(chǎn)物3 μL作為模板，引物為P3(5′-TGAACCAAGCCTTATGATCGACGGA-3′)和P4(5′-TCTTCGAYTTTAGGTTTAGATTGA-3′)，所有試劑量加倍，最終體積為50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。巢式PCR檢測(cè)陽(yáng)性的產(chǎn)物送廣州睿博公司，在ABI 3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀上進(jìn)行Sanger測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，從而得到CT病原體ompA基因亞型的型別。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。正態(tài)分布的連續(xù)變量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，分類變量以例數(shù)和百分比表示。正態(tài)分布資料兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 719例入組的肺炎患兒中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法初篩到CT陽(yáng)性患者94例，陰性625例。陽(yáng)性樣本擴(kuò)增曲線為典型的“S”型，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，陽(yáng)性CT含量為2.14×106(3.54×105,9.14×106)copies/mL，見圖1。

注：1，強(qiáng)陽(yáng)性CT檢測(cè)樣本；2、3、4、5，4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為4×107、4×106、4×105、4×104 copies/mL。

2.2臨床特征分析 CT感染患兒組與非CT感染患兒組比較，前者通過陰道分娩和犯哮喘的比例顯著高于后者(P<0.05)；前者的產(chǎn)婦年齡顯著低于后者(P<0.01)；而產(chǎn)婦分娩時(shí)胎齡的大小、患兒年齡、犯呼吸急促病的占比在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)中，前者的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于后者(P<0.05)，而CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CT感染患兒組與非CT感染患兒組參數(shù)比較

2.3CT感染患兒與非感染患兒BALF中細(xì)胞構(gòu)成 CT感染患兒組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的比例明顯高于非CT感染患兒組(P<0.01)，見圖2；而中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的比例，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

注：左圖為CT陽(yáng)性樣本，箭頭所示為嗜酸性粒細(xì)胞；右圖為CT陰性樣本。

表2 CT感染患兒組與非感染組BALF中細(xì)胞構(gòu)成比較

2.4CT基因型分布及其與致病力關(guān)系 94例陽(yáng)性樣本用巢式PCR驗(yàn)證，92例為陽(yáng)性，外送測(cè)序均有結(jié)果。經(jīng)Blast比對(duì)，其中90例分型成功，2例失敗。共檢測(cè)到5種不同的CT基因型，分別為基因型D、E、F、G、J，基因型F占比最高，達(dá)50.00%；基因型E次之，為35.87%；基因型J占比最低，為2.17%。輕重癥肺炎患者感染的CT基因型差異無統(tǒng)計(jì)意義(χ2=2.865，P=0.721)。見表3。

表3 沙眼衣原體的基因型分布及致病力差異[n(%)]

3 討論

兒童沙眼衣原體肺炎多發(fā)生于3個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒，是嬰幼兒肺炎常見發(fā)病原因之一。沙眼衣原體肺炎在嬰幼兒中發(fā)病率的高低與產(chǎn)婦的感染率相關(guān)，且存在區(qū)域差異。據(jù)研究報(bào)道，在不到6個(gè)月嬰幼兒中，沙眼衣原體肺炎的發(fā)病率為7%～30%[4-6]，并且隨著年齡的下降，感染率呈上升趨勢(shì)，越貧窮、衛(wèi)生條件越差的地區(qū)感染率越高[7]。本文對(duì)本地區(qū)3個(gè)月內(nèi)有呼吸道癥狀的719例嬰幼兒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，94例CT陽(yáng)性，沙眼衣原體肺炎發(fā)病率為13.07%。

本文發(fā)現(xiàn)CT感染患兒組中嬰幼兒通過陰道分娩的比例遠(yuǎn)高于非CT感染患兒組，說明陰道分娩會(huì)增加?jì)胗變焊腥綜T的概率從而引起沙眼衣原體肺炎。2009年Yu等[8]報(bào)道重慶市母親陰道分娩時(shí)，CT的垂直傳播率高達(dá)66.7%，充分證實(shí)了陰道分娩的高傳染性，這與本文結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，CT感染患兒組其產(chǎn)婦平均年齡明顯小于非CT感染患兒組，可能與年輕產(chǎn)婦性行為較活躍、性伴侶不穩(wěn)定有關(guān)，導(dǎo)致CT感染率增高。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CT感染患兒組外周血中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和BALF中嗜酸性粒細(xì)胞占比，均明顯高于非CT感染患兒組。CT為胞內(nèi)寄生病原體，小兒感染CT后，常常致病緩慢和延后診斷，以致引起哮喘、氣促等呼吸道疾病，引起過敏反應(yīng)而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞增多。2011年印度Mishra等[9]報(bào)道，CT感染的嬰兒中83.3%的患兒有嗜酸性粒細(xì)胞增多癥，嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的增大與CT感染顯著相關(guān)，與本研究結(jié)論一致。

CTompA基因編碼的MOMP被認(rèn)為是引起宿主免疫反應(yīng)的主要靶點(diǎn)，參與CT向宿主的黏附[10]。MOMP含有4個(gè)對(duì)稱間隔的可變結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域的改變可影響?zhàn)じ阶饔?，不同的結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)為不同的血清型(由ompA基因型決定)，因此推測(cè)不同ompA基因型的CT可能會(huì)引起致病程度的差異。本研究對(duì)本地區(qū)引起肺炎的CT的基因亞型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：E和F型為主要亞型，F(xiàn)型占比最高；不同基因亞型的CT對(duì)所致肺炎的嚴(yán)重程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2015年Li等[6]報(bào)道，深圳寶安區(qū)嬰幼兒感染的CT主要為E型，這與本研究稍有不同，這可能與地區(qū)分布差異有關(guān)；而同樣證實(shí)CT致病的嚴(yán)重程度與基因型無關(guān)，與本研究一致。

本文選擇的人群代表性稍有欠缺，CT陽(yáng)性例數(shù)偏少，并且巢式PCR方法檢測(cè)的靈敏度(模板含量約為1×103copies/mL)相對(duì)較低，CT含量低時(shí)不能被檢測(cè)到，這些因素可能導(dǎo)致結(jié)論會(huì)有偏差。

綜上所述，沙眼衣原體肺炎在本地區(qū)3個(gè)月以下嬰幼兒中普遍流行，陰道分娩增加感染率，同時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞增多是CT感染的臨床表現(xiàn)指標(biāo)；本地區(qū)引起嬰幼兒肺炎的CT基因亞型以E和F為主，尚未發(fā)現(xiàn)CT基因亞型與嬰幼兒肺炎嚴(yán)重程度間的關(guān)聯(lián)。