陳東科，張潔，董家麗

(1. 北京醫(yī)院檢驗科 國家老年醫(yī)學中心 中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院，北京100730；2.沂南縣人民醫(yī)院檢驗科，山東沂南061001;3.滄州市人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，河北滄州276300)

隱球菌病是由新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)感染引起的一種亞急性或慢性真菌病，主要有隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis, CM)和肺隱球菌病(pulmonary cryptococcosis, PC)。CM缺少易與其他病原感染相區(qū)分的臨床癥狀，診斷困難。PC近年來發(fā)病率逐年增長，是僅次于念珠菌、曲霉菌的第三大類肺真菌病，在免疫功能正常和低下者中均可發(fā)生，其臨床表現(xiàn)及影像學均缺乏特異性，易導致誤診和漏診[1]。目前，實驗室檢測方法主要有涂片染色法、培養(yǎng)鑒定法、組織病理檢查等，但是鏡檢結(jié)果判斷主觀性較大且檢出率較低，培養(yǎng)方法的周期長，組織病理活檢有創(chuàng)傷。隱球菌莢膜多糖抗原檢測簡便易操作，其敏感性和特異性均被業(yè)內(nèi)認可。隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑主要有乳膠凝集試驗、酶聯(lián)免疫分析法和側(cè)流免疫層析法等。側(cè)流免疫層析法有更高的敏感性、特異性及快速檢測等優(yōu)點，對隱球菌病的診斷有重要的臨床意義[2-3]。本研究用已知菌株對國產(chǎn)和進口的兩家隱球菌莢膜多糖抗原快檢試劑驗證其性能，旨在為臨床診治隱球菌病推薦更好的方法和檢測試劑。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選用真菌共28屬100株菌，細菌2屬2種。菌株為臨床分離菌株和標準菌株，分離菌株均采用質(zhì)譜和ITS測序雙鑒定進行確認。(1)隱球菌屬9種31株，其中包括18株新型隱球菌[包括15株新型隱球菌和3株新型隱球菌格魯比變種(C.neoformansvar.grubii)]，3株格特隱球菌(C.gattii)，1株土生隱球菌(C.humicola)，1株淺白隱球菌(C.albidus)，1株羅倫特隱球菌(C.laurentii)，1株烏茲別克斯坦隱球菌(C.uzbekistanensis)，4株維多利亞隱球菌(C.victoriae)，1株C.dimennae，1株大隱球菌(C.magnum)；(2)毛孢子菌屬(Trichosporon)16株，其中包括2株阿薩希毛孢子菌(T.asahii)，1株黏液毛孢子菌(T.mucoides)，3株耶氏毛孢子菌(T.jirovecii)，1株真皮毛孢子菌(T.dermatis)，1株蒙得維地亞毛孢子菌(T.montevideense)，1株辜氏毛孢子菌(T.guehoae)，1株皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，3株圓形毛孢子菌(T.montevideense)，2株多哈毛孢子菌(T.dohaense)，1株毛孢子菌(T.coremiiforme)；(3)念珠菌屬(Candida)11株，其中包括3株白念珠菌(C.albicans)，1株近平滑念珠菌(C.parapsilosis)，1株克柔念珠菌(C.krusei)，1株皺落念珠菌(C.rugosa)，1株葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)，1株耳念珠菌(C.auris)，1株都柏林念珠菌(C.dubliniensis)，1株希木龍念珠菌(C.haemulonis)，1株季也蒙念珠菌(C.guilliermondii)；(4)酵母菌24株，其中包括2株釀酒酵母(S.cerevisiae)，1株漢納酵母(H.zeae)，1株小紅酵母(R.minuta)，3株頭狀大孢酵母(M.capitatus)，4株膠紅酵母(R.mucilaginosa)，1株叢梗孢酵母(M.pollinis)，1株馬克思克魯維酵母(K.marxianus)，1株粉狀畢赤酵母(M.faoinosa)，1株庫德里阿茲威畢赤酵母(P.kudriavzevii)，2株異常威克漢姆酵母(W.anomalus)，1株長孢羅德酵母菌(L.elongisporus)，2株費比恩塞伯林德納氏酵母(C.fabianii)，2株鮭魚色擲孢酵母(S.salmonicolor)，1株亞羅酵母屬(Y.keelungensis)，1株布拉特克魯維酵母(K.blattae)；(5)馬拉色菌屬(Malassezia)2株，包括1株球形馬拉色菌(M.globasa)和1株糠秕馬拉色菌(M.furfur)；(6)1株小孢蒲頭霉(M.microspora)；1株無綠藻(Prototheca)；1株小孢蛙糞霉(B.microsporus)；1株海豚鐮刀菌(F.delphinoides)；1株馬爾尼菲籃狀菌(T.marneffei)；1株莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)；1株Diutinaranongensis；1株冠耳霉(C.coronatus)；1株泡狀莫氏黑粉菌(Moesziomycesbullatus)；4株皮炎外瓶霉(E.dermatitidis)； 1株Cutaneotrichosporoncurvatum(曾名Cryptococcuscurvatum)；(7)細菌包括羅氏菌(Rothia)1株，犬咬二氧化碳嗜纖維菌(C.cynodegmi)1株。

標準菌株包括：新型隱球菌ATCC 32045，格特隱球菌ATCC MYA-4560，淺白隱球菌ATCC 60030，羅倫特隱球菌ATCC 60036，季也蒙念珠菌ATCC 6260，白念珠菌ATCC 90029，白念珠菌ATCC 90028，白念珠菌ATCC 14053，克柔念珠菌ATCC 6258，近平滑念珠菌ATCC 22019。

1.2試劑、培養(yǎng)基和儀器 考核試劑：隱球菌莢膜多糖檢測(膠體金法)試劑[批號：200601，丹娜(天津)生物科技股份有限公司]，對比試劑：隱球菌抗原檢測(膠體金免疫層析法)試劑(批號:L106845，美國Immuno Mycologics公司)，SDA瓊脂粉、科瑪嘉瓊脂粉(法國生物梅里埃公司)，SDA平板、科瑪嘉平板為實驗室自制，0.9%滅菌生理鹽水(批號：Y1910245W，華潤雙鶴藥業(yè)公司)；Densicheck Plus電子比濁儀(法國生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1特異性檢測 待檢菌株復蘇后傳代1次，孵育24 h(個別菌株根據(jù)其生長狀況而定)后進行實驗。將SDA平板上生長的菌株用0.9%滅菌生理鹽水配制0.5麥氏濁度單位(0.5 M)菌懸液，檢測試劑的特異性?？己嗽噭z測步驟：吸取80 μL待檢菌液，緩慢加入檢測卡加樣孔中，15～20 min讀取結(jié)果。對比試劑檢測步驟：加1滴樣本稀釋液于1.5 mL Ep管中，再加入40 μL待檢菌液，插入膠體金試紙條，10 min后讀取結(jié)果。使用考核試劑盒自帶的陰性和陽性對照品進行質(zhì)量控制。對有疑問的結(jié)果進行復檢。結(jié)果判讀后記錄結(jié)果，并拍照存檔。采用雙盲方式進行，排除人為因素的干擾。

1.3.2靈敏度檢測 對上述0.5 M陽性的菌液(共31株)，用0.9%滅菌生理鹽水以10倍倍比稀釋，按1∶10、1∶100、1∶1 000的順序進行檢測,直至檢測結(jié)果為陰性，同時取1∶10 000稀釋菌液10 μL均勻涂布于SDA平板進行菌落計數(shù)，對有疑問的結(jié)果進行復檢，記錄結(jié)果并拍照存檔。

1.3.3鉤狀效應(yīng)(HOOK效應(yīng))檢測 將23株0.5 M菌液檢測為陽性的菌株，用0.9%滅菌生理鹽水重新配制2 M和4 M濃度菌液，檢測試劑鉤狀效應(yīng)。記錄結(jié)果并拍照存檔。

1.3.4結(jié)果判讀 測試區(qū)(T線)和質(zhì)控區(qū)(C線)同時出現(xiàn)顯色條帶時為陽性結(jié)果；僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)條帶為陰性結(jié)果；質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)條帶者判為無效，應(yīng)重檢。選擇光線充足的環(huán)境判讀結(jié)果，對顯色較弱的結(jié)果判讀應(yīng)至少由兩人(或以上)進行復核。該檢測方法(免疫層析法)為定性檢測，只要出現(xiàn)條帶即為陽性，不存在灰區(qū)(即弱陽性結(jié)果)?？己嗽噭┖蛯Ρ仍噭┚鶇⒄找陨吓凶x結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)控結(jié)果 考核試劑盒自帶陰性和陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果良好。

2.2特異性檢測結(jié)果 待測試劑檢測隱球菌屬31株，陽性25株(新型隱球菌和格特隱球菌均為陽性)，陰性6株。16株毛孢子菌，陽性12株，陰性4株。1株Cutaneotrichosporoncurvatum檢測結(jié)果為陽性。4株皮炎外瓶霉檢測結(jié)果均為陰性。11株念珠菌檢測結(jié)果均為陰性。24株酵母菌檢測結(jié)果均為陰性。2株馬拉色菌檢測結(jié)果均為陰性。小孢蒲頭霉、無綠藻、小孢蛙糞霉、海豚鐮刀菌、馬爾尼菲籃狀菌、莢膜組織胞漿菌、Diutinaranongensis、冠耳霉、羅氏菌、犬咬二氧化碳嗜纖維菌各1株，檢測結(jié)果均為陰性?？己嗽噭z測結(jié)果與對比試劑檢測結(jié)果一致。

2.3靈敏度檢測結(jié)果 隱球菌的最低檢出限為1.0×101CFU/mL；有10株菌(包括6株隱球菌和4株毛孢子菌)的判讀結(jié)果對比試劑低于考核試劑1個稀釋度，見圖1，其他結(jié)果均一致。見表1。

圖1 同稀釋度標本考核試劑(上)陽性而比對試劑(下)陰性

表1 2種試劑的靈敏度檢測結(jié)果

2.4鉤狀效應(yīng)的檢測 選定23株0.5 M菌液陽性的菌株，配制這些菌株2 M和4 M濃度菌液，考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果均未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。

2.5不同類型標本 對同一患者(確診為肺隱球菌病)的血液、尿液和腦脊液，分別用考核試劑和對比試劑進行隱球菌莢膜多糖抗原檢測，結(jié)果顯示血液和尿液結(jié)果呈陽性，腦脊液呈陰性，2個試劑的結(jié)果一致，見圖2。

注：上，尿液；中，血液；下，腦脊液。

3 討論

隱球菌屬(Cryptococcus)有性期隸屬于真菌界，擔子菌門(Basidiomycota)，銀耳綱(Tremellomycetes)，線黑粉菌目(Filobasidiales)，線黑粉菌科(Filobasidiaceae);無性期隸屬于半知菌門，芽孢綱，隱球酵母目，隱球酵母科。屬內(nèi)包括17個種和8個變種，新型隱球菌格魯比變種(C.neoformansvar.grubii)，新型隱球菌新型變種(C.neoformansvar.neoformans)和格特隱球菌(C.gattii)被認為是可感染人類的病原菌。按血清學分為A、B、C、D和AD型5個型。已報道可引起人類疾病的還有淺黃隱球菌(C.luteolus)、淺白隱球菌(C.albidus)、羅倫特隱球菌(C.laurentii)、地生隱球菌(C.terreus)和指甲隱球菌(C.uniguttulatus)等。隱球菌為圓形或卵圓形，菌體直徑一般為2～15 μm，大者可達20 μm，革蘭染色陽性。菌細胞常有出芽，但無真、假菌絲。自然界中的新型隱球菌大多與鴿子(包括其他鳥類)的糞便和鳥糞污染的土壤有關(guān)。格特隱球菌的環(huán)境棲息地最初被確定為桉樹(赤桉)，還有一些其他樹木考慮為污染源[4]。隱球菌可侵犯人和動物，一般為外源性感染，但也可致內(nèi)源性感染，目前尚無可由人傳人、動物傳人、實驗室獲得性感染的證據(jù)，對人類而言，通常是條件致病菌。新型隱球菌首先經(jīng)呼吸道侵入人體，由肺經(jīng)血液播散時可侵犯所有臟器組織，主要侵犯肺、腦及腦膜，引起慢性腦膜炎，也可侵犯皮膚、骨、關(guān)節(jié)和心臟等部位。新型隱球菌病好發(fā)于細胞免疫功能低下者，如艾滋病、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)病、白血病、淋巴瘤、糖尿病、惡性腫瘤、器官移植及接受腫瘤壞死因子抑制劑或大劑量使用糖皮質(zhì)激素者[5]。檢測體液中的隱球菌莢膜多糖抗原，對隱球菌疾病的診斷非常重要[6]。有研究結(jié)果顯示，其對隱球菌病的診斷敏感性和特異性達93%～100%[7]，敏感性遠高于有關(guān)文獻中研究的其他檢測隱球菌的方法：痰培養(yǎng)3.0%，肺泡灌洗液培養(yǎng)36.4%，肺組織病理69.6%，肺組織培養(yǎng)75.0%[8]。

隱球菌莢膜多糖抗原的主要成分是葡萄糖醛酸-甘露聚糖(GXM，占90%～95%，實驗所測抗原)，另含5%半乳甘露聚糖(GalXM)[9-10]。我們選取了隱球菌及與其有近緣關(guān)系的念珠菌和酵母菌。文獻報道可能會引起假陽性的細菌(羅氏菌和犬咬二氧化碳嗜纖維菌)以及可能會引起肺部感染的一些真菌，例如毛孢子菌、馬爾尼菲籃狀菌、莢膜組織胞漿菌等作為檢測對象，實驗結(jié)果顯示：部分毛孢子菌(包括阿薩希毛孢子菌，黏液毛孢子菌，真皮毛孢子菌，蒙得維地亞毛孢子菌，辜氏毛孢子菌，皮瘤毛孢子菌，圓形毛孢子菌，多哈毛孢子菌，T.coremiiforme)可出現(xiàn)陽性結(jié)果，這是由于其也含有GXM，出現(xiàn)了交叉反應(yīng)[11]?？己嗽噭z測有交叉反應(yīng)毛孢子菌的檢出限范圍為2.0×103～1.7×106CFU/mL，高于隱球菌的檢出限范圍(1.0×101～3.0×105CFU/mL)。毛孢子菌感染的病例相對較少，2009年至2016年，在中國醫(yī)院侵襲性真菌監(jiān)測網(wǎng)(CHIFNET)項目中共收集到133株毛孢子菌[12]。在日本，阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)和黏液毛孢子菌(Trichosporonmucoides)被認為是引起夏季型過敏性肺炎的主要病因[1,13]。因此，在懷疑肺部疾病真菌感染(隱球菌莢膜多糖抗原檢測陽性)而針對隱球菌治療無效時，臨床醫(yī)生應(yīng)該考慮到毛孢子菌感染的可能性。另外，Cutaneotrichosporoncurvatum檢測結(jié)果為陽性，是因為其之前被稱為Cryptococcuscurvatus，是隱球菌屬的一個種，2016年Hofmeyer等[14]已證實，其檢出限為8.0×104CFU/mL。念珠菌、酵母菌、無綠藻、小孢蛙糞霉、海豚鐮刀菌、馬爾尼菲籃狀菌、馬拉色菌、莢膜組織胞漿菌、Diutinaranongensis、冠耳霉、小孢蒲頭霉檢測結(jié)果均為陰性，證明該試劑屬外特異性較好。文獻報道，可能引起假陽性的因素有：犬咬二氧化碳嗜纖維菌菌血癥、惡性腫瘤、羅氏菌屬菌血癥、肥皂及消毒劑、羥乙基淀粉(用于液體復蘇)[15-16]，本次實驗羅氏菌和犬咬二氧化碳嗜纖維菌檢測結(jié)果均為陰性。由實驗結(jié)果可以看出，同一種菌不同菌株相同的菌量靈敏度也會有差異，可能與多糖莢膜抗原載量不均一有關(guān)。本次實驗格特隱球菌最低檢出限為1.0×101CFU/mL，證明待評價試劑有較高的敏感性。雖然考核試劑和對比試劑都是用膠體金包被抗體，但由于生產(chǎn)工藝不同，反應(yīng)結(jié)果的顯色帶的清晰度也不同，在較弱陽性的樣本結(jié)果判讀時可能會出現(xiàn)判讀誤差，這也許是本次比對結(jié)果中有10株菌(包括6株隱球菌和4株毛孢子菌)的判讀結(jié)果呈現(xiàn)考核試劑高于對比試劑一個稀釋度的原因所在。若想減小人為判讀的誤差，可能需要用儀器進行判讀。

可以用于檢測隱球菌莢膜多糖抗原的體液包括血清、腦脊液、肺泡灌洗液、尿液等，除血液和腦脊液之外，用于其他體液的檢測尚未批準[1]。另有文獻指出，肺泡灌洗液隱球菌莢膜多糖檢測敏感性可能會高于血清，可能的原因是：隱球菌在肺部浸潤性生長，隱球菌莢膜多糖較難或早期尚未或較少釋放入血，尤其是小病灶或無全身癥狀患者[17]。本次實驗中對同一患者(確診為肺隱球菌病)的血液、尿液和腦脊液分別用考核試劑和對比試劑進行了隱球菌莢膜多糖抗原檢測，結(jié)果顯示血液和尿液結(jié)果呈陽性反應(yīng)，腦脊液呈陰性反應(yīng)，2個試劑的結(jié)果一致，說明用腦脊液結(jié)果診斷肺隱球菌病可能會漏診，用患者的尿液進行檢測可能是一種補充選擇。也希望廠家能夠多報批一些樣本類型的試劑供臨床選擇。

實驗結(jié)果表明，2種試劑特異性無差異。靈敏度檢測結(jié)果顯示，隱球菌屬內(nèi)、屬外共有10株菌考核試劑的檢測靈敏度較對比試劑高一個稀釋度，其中隱球菌屬內(nèi)有6株菌考核試劑的檢測靈敏度較對比試劑高一個稀釋度(包括2株格特隱球菌，1株新型隱球菌，1株新生隱球菌格魯比變種，1株淺白隱球菌，1株烏茲別克斯坦隱球菌)，占檢測陽性隱球菌的20%(5/25)，提示考核試劑的靈敏度高于比對試劑。在本次實驗所達到的菌液濃度中，均未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。隱球菌莢膜多糖抗原膠體金免疫層析法檢測試劑是性能較高的快速篩查手段，可以為臨床診治隱球菌病提供可靠的初步判定依據(jù)。