程生輝，劉逸軒，姚帥君，門九章

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

過(guò)敏性紫癜是系統(tǒng)性IgA 免疫復(fù)合物介導(dǎo)的白細(xì)胞破碎性血管炎，臨床特征主要為皮膚非血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)炎、胃腸道出血及腎炎等。發(fā)病機(jī)制為毛細(xì)血管變態(tài)反應(yīng)和血管的自體免疫損傷［1］。門氏保元湯是門九章教授治療過(guò)敏性疾病和自身免疫性疾病的常用方主方，由當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草5 味藥組成，以“扶正培元，標(biāo)本兼顧”組方，針對(duì)過(guò)敏性紫氣陰兩虛、熱瘀互結(jié)的病機(jī)特點(diǎn)，具有清熱解毒、益氣活血等功效，有著良好的臨床效果［2-3］。

整合藥理學(xué)是融合了中藥學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科的交叉學(xué)科，用以研究藥物與機(jī)體的相互作用及作用原理［4］。通過(guò)中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)（TCMIP，http：www.tcmip.cn），本研究對(duì)門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜的機(jī)制進(jìn)行了探究與分析，為闡釋本方分子機(jī)制以及臨床新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分來(lái)源

在整合藥理學(xué)平臺(tái)（http：//www.tcmip.cn/）中的中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)，收集中藥材當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、甘草所含有的化學(xué)成分，建立門氏保元湯的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 候選靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)“整合藥理學(xué)分析工具”采取化學(xué)成分二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，即采用MACCS 分子指紋特征提取方法和Tani-moto 系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法，針對(duì)中藥化學(xué)成分和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進(jìn)行相似性打分，從而獲取高可信度（相似度＞0.8）的中藥候選靶點(diǎn)譜，在平臺(tái)“中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”版塊分別輸入當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草，即可獲得不同的藥物的化學(xué)成分信息，并可提取不同成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息。

整合藥理學(xué)平臺(tái)TCMIP 平臺(tái)依托“人類表型本體數(shù)據(jù)庫(kù)（HPO）”“Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)”“基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）”“治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）”等資源，構(gòu)建疾病和常見(jiàn)臨床表型相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)。在平臺(tái)“疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘”板塊以“allergic purpura”為疾病或癥狀進(jìn)行檢索，提取檢索出來(lái)的所有治療靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘與分析

TCMIP 平臺(tái)整合了蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)（Database of Interacting Protein，DIP）、分子交互數(shù)據(jù)庫(kù)（molecular interaction Database，MINT）人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Protein Reference Database，HPRD）、反應(yīng)途徑數(shù)據(jù)庫(kù)（Reactome Pathway Database，Reactome）等8 個(gè)現(xiàn)有的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建門氏保元湯的潛在作用靶點(diǎn)-過(guò)敏性紫癜疾病靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)網(wǎng)絡(luò)分析模塊，計(jì)算靶點(diǎn)之間的PPI 網(wǎng)絡(luò)特征值，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2 倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶點(diǎn)-疾病基因網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)（hubs）；并且在此基礎(chǔ)上，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取滿足3 個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，而后對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析，選取P 值前20 的通路，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”的多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行可視化分析。

TCMIP 基于基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG），確定藥物靶點(diǎn)所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路。結(jié)合富集計(jì)算，獲得門氏保元湯及其治療過(guò)敏性紫癜關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及其所參與的網(wǎng)絡(luò)通路。按P 值大小取前20 個(gè)GO 及KEGG 分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 門氏保元湯的化學(xué)成分分析及靶標(biāo)預(yù)測(cè)

門氏保元湯共收集化學(xué)成分301 個(gè)，化合物主要為黃酮類、三萜類和有機(jī)酸類等。當(dāng)歸收集到的成分有66 個(gè)，主要為有機(jī)酸類和揮發(fā)油化合物；元參收集到的成分有30 個(gè)，主要為環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷類化合物；金銀花共收集化學(xué)成分47 個(gè)，主要為有機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油類化合物；黃芪共收集化學(xué)成分27 個(gè)，主要為三萜皂苷類、黃酮類化合物；甘草共收集化學(xué)成分131 個(gè)，主要為三萜類、黃酮類化合物。當(dāng)歸的60 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測(cè)出251 個(gè)靶標(biāo)，元參中30 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測(cè)出73 個(gè)靶標(biāo)，金銀花中47 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測(cè)出133 個(gè)靶標(biāo)，黃芪中27 個(gè)成分共預(yù)測(cè)出249 個(gè)靶標(biāo)，甘草中131 個(gè)化學(xué)成分共預(yù)測(cè)出184個(gè)靶標(biāo)。

對(duì)中藥方劑候選靶標(biāo)進(jìn)行功能分析（表1），可見(jiàn)候選靶標(biāo)基因功能涉及輔因子代謝、四氫葉酸互變、一氧化氮合酶合成、肽基-絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)等條目。對(duì)中藥方劑候選靶標(biāo)進(jìn)行通路富集分析（表2），可見(jiàn)涉及通路有四氫蝶呤合成、葉酸和嘌呤代謝、細(xì)胞內(nèi)受體的類泛素化、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等通路。

2.2 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，構(gòu)建了門氏保元湯潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)上述條件共獲得62 個(gè)靶點(diǎn)并篩選出25個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（表5），采用PPI 模塊構(gòu)建了“藥物-疾病核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1），圖中節(jié)點(diǎn)的大小與degree 呈正比。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，門氏保元湯對(duì)過(guò)敏性紫癜的干預(yù)機(jī)制涉及B 細(xì)胞增殖、一氧化氮生物合成過(guò)程、輔因子代謝過(guò)程、血小板聚集、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等多個(gè)條目（表3）。通路富集分析結(jié)果顯示主要集中在NF-κB 信號(hào)通路異常導(dǎo)致免疫缺陷、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 的異常轉(zhuǎn)導(dǎo)以及BRAF 對(duì)RAF 激酶的異常激活等通路（表4）。

2.3 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

表1 門氏保元湯候選靶點(diǎn)功能信息

表2 門氏保元湯候選靶點(diǎn)參與的通路信息

表3 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜靶點(diǎn)生物過(guò)程富集分析

涉及到的通路主要有NF-κB 信號(hào)通路、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 編碼RAF 激酶等通路。從候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)與“藥物-化學(xué)成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），認(rèn)為門氏保元湯對(duì)過(guò)敏性紫癜的干預(yù)作用與血小板代謝、NF-κB 信號(hào)通路以及BRAF 編碼RAF 激酶等有關(guān)。

表4 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜靶點(diǎn)通路富集分析

表5 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜關(guān)鍵靶點(diǎn)

3 討論

圖1 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

門氏保元湯由當(dāng)歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草組成，黃芪多糖可以顯著增加胸腺和脾內(nèi)T 細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)IgG 的生成，從而提高機(jī)體的免疫功能；抑制血小板相關(guān)抗體，減少血小板的損傷與破壞［5］。黃芪甲苷、黃芪黃酮等能使血管的通透性得到改善，使毛細(xì)血管對(duì)損傷的抵抗力增強(qiáng)，使出血的風(fēng)險(xiǎn)得到降低［6］。當(dāng)歸有機(jī)酸具有抑制抗血小板凝聚的作用，當(dāng)歸多糖具有升高血小板和刺激骨髓造血的功能［7］。元參苯丙素苷能減少血管炎癥，元參環(huán)烯醚萜苷能有效抑制血小板聚集［8］。金銀花有機(jī)酸類化合物有抗血小板凝聚和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化損傷的作用［9］。甘草中的甘草皂苷和甘草黃酮類能抑制致炎性因子，有明顯的抗變態(tài)反應(yīng)作用［10］。

圖2 門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜“中藥-成分-核心靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

經(jīng)過(guò)富集分析得出，門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜與NF-κB 信號(hào)通路、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、血小板代謝以及BRAF 編碼RAF 激酶有著密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 是一種由兩個(gè)亞單位（P50 和P65）組成的二聚體［11］。由于NF-κB 參與多種蛋白基因轉(zhuǎn)錄，且與T 細(xì)胞的活化密切相關(guān)［12］。T 細(xì)胞過(guò)度激活是過(guò)敏性紫癜發(fā)病的機(jī)制之一，有研究認(rèn)為黃芪能抑制NF-κB 的活性，從而減少T 細(xì)胞的過(guò)度活化［13］。NO 是具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子，可調(diào)節(jié)血管張力及血流速度，防止血小板黏附和血栓形成［14］。研究表明，黃芪多糖能激活被抑制的AMPK-eNOS 通路，進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［15］。當(dāng)歸能夠?qū)ρ“寰奂a(chǎn)生明顯的抑制作用，也可以提高已聚集血小板的解聚率［16］，從而對(duì)過(guò)敏性紫癜起到一定的治療作用。血小板膜糖蛋白（ITGA2B）是一類與血小板凝聚有關(guān)的蛋白，這類蛋白主要參與出血與凝血過(guò)程，并發(fā)揮著重要的作用。對(duì)于HSP 患兒來(lái)說(shuō)，其自身的血小板聚集功能加強(qiáng)，因而存在血液的高凝狀態(tài)甚至?xí)纬晌⒀?。ITGA2B 含量的增加是導(dǎo)致血小板凝聚、微血栓形成的關(guān)鍵原因［17］。而當(dāng)歸有機(jī)酸、金銀花有機(jī)酸、元參環(huán)烯醚萜苷有抗血小板凝聚的作用，能降低細(xì)胞內(nèi)ITGA2B 的水平，從而對(duì)過(guò)敏性紫癜起到治療作用。有研究報(bào)道，BRAF 基因編碼RAF 家族蛋白激酶，該蛋白在調(diào)節(jié)MAPK-ErK 信號(hào)通路中起重要作用，影響細(xì)胞分裂，分化和分泌；并且影響著腫瘤的產(chǎn)生及進(jìn)展，有著生長(zhǎng)、增殖甚至是凋亡細(xì)胞的作用［18-19］。有研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)活化MAPK/Erk 信號(hào)通路，對(duì)糖尿病血管病變中起到抑制作用［20］，另有研究發(fā)現(xiàn)白芷提取物可能通過(guò)增加NO 和TNF-α 產(chǎn)物，激活MAPK 通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制大腸癌瘤體的增長(zhǎng)［21］。潘耀謙等［22］研究發(fā)現(xiàn)Erk 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)強(qiáng)大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了家兔腦炎原蟲性腦肉芽腫的形成，在腦肉芽腫形成過(guò)程中促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究借助整合藥理學(xué)這一新興學(xué)科理念及技術(shù)，對(duì)門氏保元湯治療過(guò)敏性紫癜的作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，既為該方未來(lái)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，也為過(guò)敏性紫癜的臨床治療提供更加開(kāi)闊的思路。