王蟬娟 徐成龍, 馬 俊 那定勛 張飲江,

(1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院, 上海 201306; 2.水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心, 上海 201306)

福壽螺(Pomacea canaliculataLam)別名大瓶螺、蘋果螺, 屬于中腹足目瓶螺科。原產(chǎn)南美洲亞馬遜河流域, 因其蛋白質(zhì)含量豐富, 營養(yǎng)成分高,20世紀(jì)80年代被作為一種水生經(jīng)濟(jì)動物引入我國南方[1], 后因過度盲目養(yǎng)殖, 腥味太濃、食味不佳等原因被大量棄于田野, 并通過水渠河道迅速擴(kuò)散到稻田等水生環(huán)境。由于其繁殖力、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng), 食性雜, 缺乏天敵等多個原因, 現(xiàn)今福壽螺已在我國南方許多地區(qū)暴發(fā)成災(zāi), 對入侵地的生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)作物及多種水生植物構(gòu)成重大威脅[2]。此外, 福壽螺是引起人類嗜酸性腦膜炎的廣州管圓線蟲的中間宿主[3], 對人類的健康具有間接的潛在危害。2000年IUCN外來入侵物種專家委員會將福壽螺列為世界100種惡性外來入侵物種之一[4], 2003年3月, 國家環(huán)?？偩謱⒏勐萘腥胧着肭种袊?6種外來物種“黑名單”[5]。目前, 福壽螺防治方法主要包括化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治等[6], 不同方法各存有不足, 其中生物控制技術(shù)因具有長效、經(jīng)濟(jì)、對非靶細(xì)胞更生態(tài)安全等優(yōu)點(diǎn), 成為當(dāng)前控螺領(lǐng)域的研究熱點(diǎn), 但有關(guān)植物源毒殺劑的提取制備和針對福壽螺的毒殺效果研究相對較少, 且未能深入探討其毒殺作用機(jī)質(zhì)[7,8]。

研究表明蓖麻籽具有劇毒, 主要有毒成分為蓖麻堿和蓖麻毒素即是“蓖麻毒蛋白”[9]。其中, 蓖麻毒蛋白是毒性最強(qiáng)的植物毒蛋白之一, 具有很強(qiáng)的殺蟲、殺菌作用, 進(jìn)入動物體內(nèi)會被動物體自身所分解, 不會在生物鏈中富集, 且不會產(chǎn)生耐藥性[9,10]。蓖麻堿是一種毒性較低的生物堿, 能引起嘔吐和各種毒性反應(yīng), 可導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷、驚厥、低血壓和死亡等[11]。高倩圓等[12]研究蓖麻提取物對南方根結(jié)線蟲活動影響時, 發(fā)現(xiàn)蓖麻水提液(蓖麻毒蛋白和蓖麻堿)對線蟲具有較強(qiáng)毒殺能力, 目前關(guān)于蓖麻提取液對福壽螺毒殺作用的研究尚未見報道。

本文以入侵物種福壽螺為研究對象, 探究不同濃度梯度(0、0.5、1.5、3.0、4.5和6.0 g/L)蓖麻籽提取液對其滅殺效果, 并通過測定分析福壽螺肝臟組織生理生化指標(biāo)變化, 探究蓖麻籽提取液對其毒殺作用機(jī)制, 旨在為現(xiàn)有的福壽螺生物防治, 提供一種創(chuàng)新高效和生態(tài)安全的生物控制技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的福壽螺采集自上海海洋大學(xué)鏡湖,為避免福壽螺對實(shí)驗(yàn)條件產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 采集的福壽螺在玻璃缸(60 cm×40 cm×45 cm)中以湖水和去氯自來水(1∶1配比)馴養(yǎng)72h, 以小白菜(1 kg)作為食物來源。在馴養(yǎng)后, 從玻璃缸中選擇行為表現(xiàn)最佳的福壽螺若干, 作為實(shí)驗(yàn)螺。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在塑料飼養(yǎng)缸(17.2 cm×13.5 cm×12.5 cm)中開展實(shí)驗(yàn), 每個實(shí)驗(yàn)組及對照組分別放置10只實(shí)驗(yàn)螺。實(shí)驗(yàn)所用蓖麻籽采購于亳州康美大藥行。

蓖麻籽提取液制備本實(shí)驗(yàn)采用生物浸泡法[13], 蓖麻籽烘干, 粉碎機(jī)粉碎得蓖麻粉, 稱取6.0 g蓖麻粉, 于1 L去氯水中, 人工攪拌混勻, 在室溫下靜置24h, 用兩層紗布過濾3次, 得蓖麻籽粗提取液,4℃冰箱保存, 備用。

福壽螺浸殺試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)每組塑料飼養(yǎng)缸設(shè)置同等水量為1 L, 蓖麻籽粉粗提取液分別稀釋成0.5、1.5、3.0、4.5和6.0 g/L的濃度梯度, 以去氯水作空白對照組, 隨機(jī)挑選前期馴養(yǎng)的10只福壽螺(2.12±0.18) g放入不同濃度梯度的塑料飼養(yǎng)缸中,塑料飼養(yǎng)缸上放置打孔蓋, 防止螺沿內(nèi)壁爬出, 每組處理設(shè)置3個平行, 實(shí)驗(yàn)在室溫(25±2)℃條件下進(jìn)行。采用腹水法和針刺法(不銹針)[14,15], 分別在24h、48h、72h、96h和120h鑒定實(shí)驗(yàn)組和對照組中福壽螺的死亡情況, 為避免水體污染, 及時清除排泄物和死螺。

1.3 生理指標(biāo)測定

生理生化指標(biāo)過氧化氫(CAT)、蛋白定量(TP)和丙二醛(MDA)測試盒購自南京建成生物工程研究所, 所用試劑均為分析純, 用水為去氯自來水, 實(shí)驗(yàn)在室溫(25±2)℃條件下進(jìn)行。

采用浸螺方法進(jìn)行毒力測定, 用Origin8.6軟件建立毒力回歸方程, 估算福壽螺在72h的LC25、LC50、LC75提取液濃度值, 實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方法同上。隨機(jī)選取8只福壽螺置于亞致死濃度1.58(LC25)、3.82(LC50)和6.05 g/L(LC75)下48h, 對照組在相同條件下保持在等量的去氯水中, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行。

實(shí)驗(yàn)組和對照組中隨機(jī)選取5只福壽螺, 用去氯水反復(fù)沖洗螺體數(shù)次, 后快速取出其肝臟組織,用4℃生理鹽水(0.9%)沖洗3次, 濾紙干燥, 稱取1.5 g,冰水浴條件下置于研缽中, 按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水), 手動研磨制成10%勻漿液, 轉(zhuǎn)速2500 r/min下離心15min, 取上清液置4℃冰箱, 用于肝胰腺組織生理指標(biāo)的測定。

蛋白質(zhì)含量(TP)蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測定[16]。取前期制備的10%肝胰腺離心上清液, 用生理鹽水稀釋成濃度為1%的肝胰腺勻漿液,按照蛋白質(zhì)定量測試盒說明書, 分別在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中加入相應(yīng)樣品及試劑, 混勻, 靜置10min, 波長595 nm, 光徑1 cm, 雙蒸水調(diào)零, 測定各管吸光度值。結(jié)果按照公式(1)進(jìn)行計算, 數(shù)值以g prot/L表示。

丙二醛(MDA)含量丙二醛含量用TBA法測定[17]。取前期制備的10%肝胰腺離心上清液, 按照丙二醛測試盒說明書分別在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中加入相應(yīng)樣品及試劑, 混勻, 離心管蓋上蓋, 用針在蓋上扎一小孔, 95℃水浴40min, 取出后流水冷卻, 然后3500 r/min離心10min, 取上清液,532 nm處, 1 cm光徑, 蒸餾水調(diào)零, 測定各管吸光度值。結(jié)果按照公式(2)進(jìn)行計算, 數(shù)值以nmol/mL表示。

過氧化氫酶(CAT)含量過氧化氫酶含量用可見光法測定[18]。取前期制備的10%肝胰腺離心上清液, 用生理鹽水稀釋成濃度為1%的肝胰腺勻漿液, 按照過氧化氫酶測試盒說明書, 分別在對照管和測定管中加入相應(yīng)樣品及試劑, 混勻, 波長405 nm, 光徑0.5 cm, 雙蒸水調(diào)零, 測定各管吸光度值。結(jié)果按照公式(3)進(jìn)行計算, 數(shù)值以U/mg prot表示。

式中, 271*為斜率的倒數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)處理, 在SPSS 23.0軟件中進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 比較不同濃度處理對福壽螺毒殺效果的差異性,P＜0.0.5表明具有顯著差異, 并進(jìn)行不同生理生化指標(biāo)間相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 福壽螺浸殺效果

如圖1所示, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24h, 在5個濃度梯度下實(shí)驗(yàn)組與對照組福壽螺均無死亡現(xiàn)象; 在48h后, 蓖麻籽提取液濃度為6 g/L的處理組中福壽螺出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 死亡率為11%; 在72h后, 與對照組相比, 各實(shí)驗(yàn)組福壽螺死亡率明顯增加, 除0.5和1.5 g/L蓖麻籽提取液濃度下死亡率相同外, 其他各組存在明顯差異(P＜0.05); 在96h后, 各實(shí)驗(yàn)組福壽螺死亡率差異顯著(P＜0.05), 且4.5和6 g/L蓖麻籽提取液濃度下的死亡率均達(dá)到最高為100%; 在120h后, 對照組福壽螺開始死亡, 死亡率為10%, 蓖麻籽提取液濃度為0.5、1.5、3.0和4.5 g/L的實(shí)驗(yàn)組, 福壽螺死亡率較96h明顯增大, 死亡率最低達(dá)到80%?？傮w而言, 蓖麻籽提取液的滅螺活性, 在24h后表現(xiàn)為隨著時間的延長, 福壽螺死亡率呈逐漸上升趨勢, 死亡率與濃度呈正相關(guān), 且在蓖麻籽提取液滅螺72h時, 呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P＜0.01)。

2.2 福壽螺肝胰腺組織中生理指標(biāo)變化

蛋白定量(TP)如圖2所示, 福壽螺在亞致死濃度1.58(LC25)、3.82(LC50)和6.05 g/L(LC75)條件下, 相比對照組, 可溶性蛋白分別降低了49.24%、53.78%和28.40%。在LC25和LC50處理?xiàng)l件下肝胰腺組織中可溶性蛋白含量隨蓖麻籽提取液濃度變化而變化, 兩者之間降低量在0.05水平上差異顯著。LC75相比LC25和LC50條件處理下, 可溶性蛋白含量反而增加, 且差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同濃度提取液處理下福壽螺隨時間的死亡情況Fig.1 Mortality of snails with different concentrations of extract over time

過氧化氫酶(CAT)如圖3所示, 福壽螺肝臟內(nèi)CAT活性總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。在提取液濃度為LC25(1.58 g/L)時, 福壽螺肝臟CAT酶活性增加了61.2%, 與對照組相比差異顯著(P＜0.05); 而在提取液濃度為LC50(3.82 g/L)時,CAT酶活性降低了1.66%, 與對照組無明顯性差異(P＞0.05); 在LC75(6.05 g/L)時CAT酶活性降低幅度最大達(dá)到87.53%, 與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。

丙二醛(MDA)如圖4所示, 與對照組相比較, 福壽螺在1.58 g/L濃度組處理下, 丙二醛含量低于對照組, 這表明機(jī)體內(nèi)的抗氧化機(jī)制被激活, 機(jī)體內(nèi)的酶活性開始發(fā)揮作用保護(hù)組織免受自由基攻擊。在濃度組3.82和6.05 g/L處理下, 丙二醛含量高于對照組, 且濃度6.05 g/L處理下丙二醛含量顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 理化指標(biāo)相關(guān)性分析

圖2 不同提取液致死濃度處理下蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Protein content of different lethal concentration of extract

圖3 不同提取液致死濃度處理下CAT活性含量變化Fig.3 CAT activity content under different lethal concentration of extract

生命體基本的過程通過生理生化活動實(shí)現(xiàn), 通過測定肝臟組織生理生化指標(biāo)揭示福壽螺受到外界環(huán)境脅迫時機(jī)體內(nèi)部應(yīng)激反應(yīng), 為進(jìn)一步探究生理生化指標(biāo)間關(guān)系, 深入了解蓖麻籽提取液滅螺機(jī)理, 對肝臟生理生化指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。由表1可知, 蛋白質(zhì)含量與CAT活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 但相關(guān)性并不顯著(P＞0.05); 蛋白質(zhì)含量與MDA含量呈正相關(guān), 相關(guān)性也不明顯(P＞0.05); CAT酶活性與MDA呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。

圖4 不同提取液致死濃度處理下MDA含量變化Fig.4 MDA content in different lethal concentration of extract

表1 生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.1 The correlation analysis of physiological and biochemical indexes

3 討論

3.1 福壽螺浸殺效果

福壽螺由于其具有的厚螺殼, 對自身起到良好的屏障作用, 能夠有效幫助福壽螺躲避敵害[19]。毒殺液不僅對福壽螺起到致死作用, 對其行為也會產(chǎn)生影響, 研究蓖麻籽提取液毒殺福壽螺效果, 當(dāng)福壽螺遇到脅迫環(huán)境時, 表現(xiàn)出逃避、緊閉螺魘等行為, 躲避藥物浸入體內(nèi), 延緩藥劑到達(dá)靶標(biāo)部位時間[20]。研究表現(xiàn)出, 在蓖麻籽提取液處理的前24h,其各組福壽螺均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 很大程度上是由于福壽螺自身的調(diào)節(jié)功能, 及生物學(xué)特性對不良環(huán)境的反應(yīng)所致。這與Xiao等[3]研究加拿大一支黃花對福壽螺的滅螺活性中福壽螺在石油醚提取物處理下死亡率變化曲線相似。

3.2 福壽螺肝胰腺組織中生理指標(biāo)變化

肝胰臟是消化和解毒器官, 在許多代謝過程和動物能量消耗中起主要作用, 這種組織是敏感的,容易受到殺蟲劑和水中污染物的傷害, 因此, 器官經(jīng)常被用來監(jiān)測毒物。本研究對蓖麻籽提取液處理下福壽螺肝胰腺組織的蛋白質(zhì)總量、CAT酶活性和MDA含量變化進(jìn)行了測定。

蛋白質(zhì)是有機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,由于碳水化合物在福壽螺體內(nèi)的含量是有限的, 當(dāng)福壽螺抵抗外界脅迫環(huán)境, 體內(nèi)供給能量不足時,蛋白質(zhì)可作為能量需求的替代能源, 肝臟將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖, 以確保體內(nèi)恒定的葡萄糖供應(yīng)[21]。對比對照組, 福壽螺體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05), 這與Shen等[3]研究的加拿大一枝黃花提取物對福壽螺滅螺活性研究結(jié)果一致, 其研究表明隨著石油醚提取物劑量的增加, 肝臟組織中可溶性蛋白逐漸降低, 另外, 結(jié)果的差異性存在于: 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在6.05 g/L(LC75)處理下, 雖然蛋白質(zhì)含量相比對照組明顯降低, 但隨蓖麻籽提取液濃度增大蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先減后增的趨勢, 相比LC25和LC50處理, 蛋白質(zhì)含量反而增加, 這可能是由于蓖麻籽中主要有毒成分蓖麻毒蛋白進(jìn)入螺體, 導(dǎo)致測試蛋白質(zhì)含量增加所致。蓖麻毒蛋白是一種植物性的蛋白, 其結(jié)構(gòu)由A(效應(yīng)鏈)和B(效應(yīng)鏈)兩條肽鏈組成, B鏈可以與細(xì)胞膜表面的糖蛋白相結(jié)合, 幫助游離的鏈或整個蓖麻毒蛋白分子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部, 與核蛋白體60-S亞基發(fā)生作用, 抑制氨基酸t(yī)-RNA與核蛋白酶的結(jié)合作用, 使得核酸的延伸因子減少, 從而使得核糖核酸發(fā)生失活, 抑制蛋白質(zhì)的合成, 導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡, 在進(jìn)入動物體內(nèi)后被動物體自身機(jī)體分解[9], 因此, 蓖麻毒蛋白有可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量增加及螺死亡的主要原因, 進(jìn)一步地,將進(jìn)行相關(guān)性的研究。

過氧化氫酶(CAT)是一種在動植物體內(nèi)廣泛存在的末端氧化酶, 它的功能是對體內(nèi)過氧化氫進(jìn)行催化, 防止膜質(zhì)過氧化等, 其中最重要的功能是參與活性氧化代謝過程[22]。在活性氧化過程中,CAT酶可以使H2O2發(fā)生歧化生成水和氧分子。在環(huán)境脅迫情況下, 生物體內(nèi)活性氧大量增加, 從而導(dǎo)致體內(nèi)自由基增多, 使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化過程,破壞細(xì)胞膜, CAT酶參與生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng),在清除超氧自由基、H2O2、過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外大量研究表明, CAT酶活性受毒物劑量的影響,當(dāng)濃度較低時, 毒物對代謝具有一定的促進(jìn)作用[23]。在亞致死濃度組處理下, CAT酶的活性呈先上升后下降趨勢, 這個結(jié)果和李燮陽等[22]研究的阿維菌素脅迫下黃河鯉鰓組織中CAT酶的活性變化趨勢一致, CAT酶的活性含量變化情況在一定程度上反映了機(jī)體的損害程度。

MDA是脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物, 是反映有機(jī)體氧化損傷最具代表性的指標(biāo)之一[24], 它能與DNA和蛋白質(zhì)等分子發(fā)生反應(yīng), 丙二醛含量的增加表示肝臟組織存在氧化損傷或生理損傷[3]。由上可知, 隨著提取液濃度的增加, 提取液中有毒成分破壞了機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶機(jī)制, 降低了體內(nèi)酶的活性,使得機(jī)體內(nèi)的超氧自由基無法被清除, 導(dǎo)致大量脂質(zhì)過氧化物降解, 從而使得機(jī)體內(nèi)的丙二醛含量增加[25]。這與王元春等[25]研究X射線對仔鼠大腦枕葉皮層結(jié)構(gòu)及大腦的影響中隨著照射劑量的增大丙二醛含量一樣。

3.3 理化指標(biāo)相關(guān)性分析

如上所述, 蛋白質(zhì)作為一種替代供給能源, 維持機(jī)體正常生理代謝, CAT酶作為清除自由基作用的抗氧化劑, 當(dāng)機(jī)體自由基的脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)時,會消耗大量的CAT酶, 使得CAT酶含量下降。機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低時意味著機(jī)體受到外界脅迫壓力大, 則作為酶防御系統(tǒng)的CAT酶活性會相應(yīng)地降低, 原理上蛋白質(zhì)含量應(yīng)該與CAT酶活性呈正相關(guān)關(guān)系, 但實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 這與上述的分析相對應(yīng), 可能由于蓖麻籽提取液中蓖麻毒蛋白成分被福壽螺攝入, 導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量會隨著提取液濃度的增加而增加, 但受外界脅迫作用蛋白質(zhì)總量會低于對照組。MDA作為脂質(zhì)過氧化過程的代謝產(chǎn)物, 機(jī)體中自由基的多少與MDA呈正相關(guān), 當(dāng)福壽螺肝胰腺組織中CAT酶活性降低時, 丙二醛含量則增加, 二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 這與趙虹等[26]研究急性期腦梗死患者血漿丙二醛與過氧化氫酶活性檢測臨床對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 腦梗死急性期治療前的MDA值升高, CAT酶活性降低, 治療后MDA值降低, CAT酶活性升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)和MDA呈正相關(guān)關(guān)系, 這與羅麗瓊等[27]研究低緯高原地區(qū)UV-B輻射對報春花丙二醛、蛋白質(zhì)含量的影響結(jié)果相反, 丙二醛植物抵抗UV-B輻射損傷能力越弱, 葉片丙二醛含量就越高, 可溶性蛋白質(zhì)含量也就越低, 原因可能與蓖麻籽提取液中蓖麻毒蛋白成分有關(guān), 與本研究中的蛋白質(zhì)含量變化相對應(yīng)。

4 結(jié)論

(1)蓖麻籽提取液毒殺福壽螺起效慢, 48h時最高濃度6 g/L處理組表現(xiàn)出11%的死亡率, 72h后福壽螺的死亡率表現(xiàn)出隨時間延長、濃度升高而增大, 且每一濃度處理組下福壽螺死亡率隨時間延長差異極顯著(P＜0.01)。(2)福壽螺受外界環(huán)境脅迫時機(jī)體內(nèi)的應(yīng)答反應(yīng), 表現(xiàn)出肝臟組織中蛋白質(zhì)含量下降, 低濃度提取液促進(jìn)CAT酶活性, 高濃度抑制其活性, MDA含量隨肝臟組織脂質(zhì)過氧化物的降解而增加。當(dāng)然, 進(jìn)一步地將更加深入地研究蓖麻籽提取液對福壽螺的毒殺效果的主要作用成分。(3)生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析表明, MDA含量與CAT酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05), 蛋白質(zhì)含量與MDA呈現(xiàn)正相關(guān)但不顯著(P＞0.05), 與CAT酶活活性表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)但不顯著(P＞0.05), 進(jìn)一步揭示了福壽螺在外界環(huán)境脅迫時機(jī)體內(nèi)部的應(yīng)激反應(yīng)。蓖麻籽材料來源廣泛, 作為生物源毒殺液表現(xiàn)出環(huán)境友好性, 制備綠色生態(tài)的蓖麻籽提取液毒殺福壽螺, 效果可行。