楊 燕 楊再華 峗薇 尚小麗 羅倩 楊茂發(fā)

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550018； 2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550005；3.四川省江油市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 江油 621700；4.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；5.貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；)

云南松(Pinusyunnanensis)隸屬于裸子植物亞門(mén)Gymnospermae松杉目Pinales松科Pinaceae松屬Pinus，常綠針葉喬木，是我國(guó)西南地區(qū)重要的用材林樹(shù)種，也是綠化和更新造林的重要樹(shù)種[1-2]。這一樹(shù)種也不可避免地會(huì)遭到不同昆蟲(chóng)的取食與危害，其中鉆蛀害蟲(chóng)云南木蠹象Pissodesyunnanensis在我國(guó)西南地區(qū)包括云南、貴州、四川等地云南松林區(qū)常有危害。當(dāng)前在貴州省威寧縣針對(duì)云南木蠹象的防治依然以清理被害枝梢燒毀為主，此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工費(fèi)錢(qián)，也不利于水土保持和森林生態(tài)。因此，為探索有效、安全、經(jīng)濟(jì)的防治新方法和新技術(shù)，我們展開(kāi)了天敵昆蟲(chóng)定向寄主選擇行為相關(guān)化學(xué)信號(hào)的研究。

信息化合物在天敵搜尋寄主的過(guò)程中起著重要作用，這些信息化學(xué)物質(zhì)一般來(lái)源于寄主取食的植物、寄主本身或者分泌物，以及一些與寄主相關(guān)的有機(jī)體等[3-13]。天敵在害蟲(chóng)綜合治理和生物防治中占有非常重要的地位，是自然控制害蟲(chóng)種群密度的一個(gè)重要組成部分。該文利用固相微萃取技術(shù)，對(duì)云南木蠹象幼蟲(chóng)危害的云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮和帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)性成分進(jìn)行了萃取、分離和鑒定，以期為探索天敵昆蟲(chóng)與云南木蠹象之間的信息聯(lián)系機(jī)制，天敵寄生蜂定向到該蟲(chóng)的種間化學(xué)信號(hào)，為篩選對(duì)天敵昆蟲(chóng)具有生物活性的引誘劑工作的開(kāi)展，并實(shí)現(xiàn)對(duì)該蟲(chóng)的生態(tài)控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

有云南木蠹象幼蟲(chóng)在其中取食危害的云南松枝條采自貴州省威寧縣秀水鄉(xiāng)華豐村(N26.85，E103.91)云南松林區(qū)，海拔2430m。采集的帶蟲(chóng)云南松枝條，置于恒溫25±1℃的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)幾天供試。

1.2 儀器

美國(guó)安捷倫公司HP6890/5975CGC-MS聯(lián)用儀、手動(dòng)固相微萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)、萃取纖維頭為PDMS100μm萃取頭、TB-4002型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、鐵架臺(tái)、樣品瓶、記時(shí)器。

1.3 固相微萃取

分別稱(chēng)取3g云南木蠹象幼蟲(chóng)取食危害的帶蟲(chóng)云南松樹(shù)皮和帶蟲(chóng)木質(zhì)部，放入50mL樣品瓶中，室溫25℃± 1℃的條件下保持30 min，樣品瓶?jī)?nèi)樣品與頂空中的揮發(fā)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，將裝有100μmPDMS纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器針頭插入樣品瓶，固定固相微萃取裝置的手柄，然后小心推出萃取纖維頭，在室溫條件下頂空萃取45 min，快速移出萃取頭并立即插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行GC-MS測(cè)試，250℃熱解析5 min。

1.4 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃(保留2min)，以5℃.min-1升溫至250℃(保留2 min)，運(yùn)行時(shí)間:45min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.35 psi，載氣流量1.0mL/min；分流進(jìn)樣，分流比20:1，溶劑延遲時(shí)間：0.5 min。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1200V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450amu。

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及結(jié)合核對(duì)Nist 14、Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)和部分標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖，確定揮發(fā)物的成分，并按峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮和帶蟲(chóng)木質(zhì)部氣味揮發(fā)性成分總離子流圖，見(jiàn)圖1，圖2。GC-MS分離鑒定出的樹(shù)皮和木質(zhì)部揮發(fā)性成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1。由表1可知，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分離鑒定出云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮主要揮發(fā)性化合物總共37種，已鑒定的化合物占色譜總餾出峰面積的99.83%，相對(duì)含量最大的是α-蒎烯，相對(duì)含量為74.98%，其次是β- 蒎烯(8.52%)、檸檬烯(7.27%)和莰烯(2.03%)。云南松帶蟲(chóng)木質(zhì)部主要揮發(fā)性化合物總共40種，已鑒定的化合物占色譜總餾出峰面積的93.96%，相對(duì)含量最大的是α-蒎烯，相對(duì)含量為68.40%，其次是反式石竹烯(7.11%)、檸檬烯(5.71%)和β-蒎烯(3.76%)。

圖1 帶蟲(chóng)云南松樹(shù)皮揮發(fā)物總離子流圖

圖2 帶蟲(chóng)云南松木質(zhì)部揮發(fā)物總離子流圖

在云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮所鑒定的化合物中，單萜有14種，相對(duì)含量為95.50%；醇類(lèi)有7種，相對(duì)含量為2.14%；倍半萜有7種，相對(duì)含量為0.99%；酮類(lèi)有4種，相對(duì)含量為0.27%；醚有2種，相對(duì)含量為0.04%；烷烴有1種，相對(duì)含量為0.17%；酯類(lèi)有1種，相對(duì)含量為0.7%；烯烴有1種，相對(duì)含量為0.02%。在云南松帶蟲(chóng)木質(zhì)部所鑒定的化合物中，單萜有13種，相對(duì)含量為80.88%；倍半萜有11種，相對(duì)含量為9.58%；醇類(lèi)有7種，相對(duì)含量為1.02%；酮類(lèi)有5種，相對(duì)含量為1.12%；烷烴有2種，相對(duì)含量為1.04%；酯類(lèi)有1種，相對(duì)含量為0.32%；氧化物有1種。相對(duì)含量為0.09%。在帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)物中，單萜類(lèi)和醇類(lèi)相對(duì)含量較高，在帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)物中，單萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)相對(duì)含量較高。帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)物中，單萜類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)的相對(duì)含量都比帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)物中的相對(duì)含量高，而帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)物中，則是倍半萜、酮類(lèi)和烷烴類(lèi)組分的相對(duì)含量比帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)物中的相對(duì)含量高。

表1 云南木蠹象幼蟲(chóng)危害的云南松揮發(fā)物

序號(hào)化合物分子式相對(duì)分子量帶 蟲(chóng) 樹(shù) 皮 帶 蟲(chóng) 木 質(zhì) 部 保留時(shí)間相對(duì)含量保留時(shí)間相對(duì)含量38十四烷T(mén)etradecaneC14H30198﹣﹣21.870.0739刺伯烯JunipeneC15H2420422.20.23﹣﹣40長(zhǎng)葉烯LongifoleneC15H24204﹣﹣22.20.4141反式-石竹烯trans-CaryophylleneC15H2420422.530.6122.537.1142(E)-β-金合歡烯(E)-β-FameseneC15H2420423.360.0323.340.1643α-葎草烯alpha.-HumuleneC15H2420423.390.0623.390.8744γ- 依蘭油烯 gamma.-MuuroleneC15H24204﹣﹣23.930.0545大根香葉烯D Germacrene DC15H24204﹣﹣24.060.0446α-依蘭油烯alpha.-MuuroleneC15H24204﹣﹣24.510.2247β-沒(méi)藥烯beta.-BisaboleneC15H24204﹣﹣24.660.0248γ- 杜松烯gamma.-CadineneC15H24204﹣﹣24.860.0749δ- 杜松烯delta.-CadineneC15H24204﹣﹣25.060.350石竹烯氧化物Caryophyllene oxideC15H24O220﹣﹣26.530.09

由表1可知，帶蟲(chóng)云南松樹(shù)皮和帶蟲(chóng)云南松木質(zhì)部揮發(fā)性成分在組成和含量上差別很大。帶蟲(chóng)云南松樹(shù)皮和帶蟲(chóng)云南松木質(zhì)部共有27種相同的揮發(fā)性成分，其中萜烯類(lèi)有15種，醇類(lèi)有6種，酮類(lèi)有4種，酯類(lèi)有1種，烷烴類(lèi)有1種。帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)性成分相對(duì)含量中有99.4%與帶蟲(chóng)木質(zhì)部相同；帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)性成分相對(duì)含量中有92.41%與帶蟲(chóng)樹(shù)皮相同。α-小茴香烯、δ- 3-蒈烯、順式- 氧化芳樟醇、諾蒎酮、十四烷、長(zhǎng)葉烯、γ- 依蘭油烯、大根香葉烯D、α-依蘭油烯、β-沒(méi)藥烯、γ- 蓽澄茄烯、δ- 蓽澄茄烯和石竹烯氧化物僅在木質(zhì)部檢測(cè)到。脫氫檜烯、α-水芹烯、鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、α-長(zhǎng)葉蒎烯、長(zhǎng)葉環(huán)烯、刺伯烯等成分僅在樹(shù)皮中檢測(cè)到。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、桉樹(shù)腦在樹(shù)皮中的相對(duì)含量都較在木質(zhì)部的相對(duì)含量高，而反式-石竹烯、對(duì)傘花烴、樟腦、松樟酮、異蒎烷酮、馬鞭草烯酮、龍腦、4-松油醇、對(duì)- 聚傘花素醇、α-松油醇、桃金娘烯醇在樹(shù)皮中的相對(duì)含量都較在木質(zhì)部的相對(duì)含量低。

3 討論

為探索天敵寄生蜂與云南木蠹象幼蟲(chóng)之間的信息聯(lián)系機(jī)制，研究天敵寄生蜂定向到該蟲(chóng)幼蟲(chóng)的種間化學(xué)信號(hào)，本文對(duì)云南木蠹象幼蟲(chóng)危害的云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮和帶蟲(chóng)木質(zhì)部揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，鑒定出帶蟲(chóng)樹(shù)皮37種揮發(fā)性成分，帶蟲(chóng)木質(zhì)部40種揮發(fā)性成分。

云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮含有的37種氣味化合物，與報(bào)道的固相微萃取分離鑒定的健康松皮、受害松皮，徐穎凱等用蒸餾結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離鑒定的松皮、張曉龍用同時(shí)蒸餾萃取法檢測(cè)松樹(shù)皮揮發(fā)物的基本成分相比較[14-16]，分別有21、20、15和17種相同成分。其中，三環(huán)烯、α-蒎烯 、莰烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、乙酸龍腦酯這7種化合物是各種有關(guān)云南松樹(shù)皮揮發(fā)物研究報(bào)道中均被檢測(cè)出的共有成分。

本研究帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對(duì)含量為74.98%，莰烯的相對(duì)含量為2.03%，β-蒎烯的相對(duì)含量為8.52%，β-月桂烯的相對(duì)含量為1.74%，檸檬烯的相對(duì)含量7.27%。在報(bào)道的固相微萃取方法分離鑒定健康樹(shù)皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對(duì)含量為15.945～37.629%，莰烯的相對(duì)含量為0.362～1.069%，β-月桂烯的相對(duì)含量為5.22～47.759%，檸檬烯的相對(duì)含量19.722～39.54%，受害樹(shù)皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對(duì)含量為19.821～59.186%[14]。在徐穎凱等研究中，α-蒎烯的相對(duì)含量為0.13%，莰烯的相對(duì)含量為0.28%，β-蒎烯的相對(duì)含量為27.68%[15]。由此可見(jiàn)，帶蟲(chóng)樹(shù)皮揮發(fā)物中α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯這幾種成分與健康樹(shù)皮的相對(duì)含量差異較大。帶蟲(chóng)樹(shù)皮中α-蒎烯和莰烯的相對(duì)含量都比健康樹(shù)皮和不帶蟲(chóng)的受害樹(shù)皮的相對(duì)含量高，而β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯的相對(duì)含量都比健康樹(shù)皮低。是否是云南木蠹象幼蟲(chóng)取食危害誘導(dǎo)的各成分變化有待進(jìn)一步研究。

云南松帶蟲(chóng)樹(shù)皮氣味化合物，與殷彩霞等用石油醚浸提的松梢韌皮揮發(fā)物基本成分相比較[17]，共有5種成分相同，分別是α-蒎烯 、莰烯、香檜烯、β-蒎烯和β-月桂烯。α-蒎烯都是相對(duì)含量最高的成分。與報(bào)道的固相微萃取方法分離鑒定健康云南松韌皮部揮發(fā)物基本成分相比較[14]，共有17種成分相同，分別是三環(huán)烯、α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、香檜烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-松油烯、對(duì)傘花烴、(E)-羅勒烯、γ-松油烯、α-異松油烯、乙酸龍腦酯、α-古巴烯、刺伯烯、α-葎草烯。其中α-蒎烯和莰烯在帶蟲(chóng)樹(shù)皮中的相對(duì)含量都比健康韌皮部中的相對(duì)含量高，香檜烯、β-月桂烯和α-異松油烯在健康韌皮部中的相對(duì)含量則比帶蟲(chóng)樹(shù)皮中的含量高，健康韌皮部香檜烯相對(duì)含量為0.725～8.914%、β-月桂烯為11.828～19.925%和α-異松油烯1.585～7.409%，帶蟲(chóng)樹(shù)皮中香檜烯為0.21%、β-月桂烯為1.74%和α-異松油烯為0.29%。

云南松帶蟲(chóng)木質(zhì)部含有的40種氣味化合物，與報(bào)道的固相微萃取方法分離鑒定健康云南松木質(zhì)部揮發(fā)物基本成分相比較[14]，有13種成分相同，分別是三環(huán)烯、α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯、對(duì)傘花烴、γ-松油烯、α-異松油烯、乙酸龍腦酯、α-古巴烯、α-葎草烯。其中β-蒎烯、β-月桂烯在健康木質(zhì)部中的相對(duì)含量比在帶蟲(chóng)木質(zhì)部中的高。健康木質(zhì)部中β-蒎烯為10.115%，β-月桂烯為3.614%，帶蟲(chóng)木質(zhì)部中β-蒎烯為3.76%，β-月桂烯為0.37%。

本研究中在帶蟲(chóng)云南松樹(shù)皮揮發(fā)性成分中檢測(cè)到了鄰甲基苯甲醚和百里酚甲醚，徐穎凱等在健康云南松樹(shù)皮中檢測(cè)到的是2-異丙基-5-甲基茴香醚[15]。本文研究云南木蠹象幼蟲(chóng)-云南松復(fù)合體的揮發(fā)性成分，云南木蠹象幼齡幼蟲(chóng)取食危害云南松樹(shù)皮韌皮部，逐漸隨著幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，會(huì)進(jìn)而在云南松枝干木質(zhì)部及髓心取食危害。云南松樹(shù)皮和木質(zhì)部在受到云南松幼蟲(chóng)危害后，除了部分化合物與健康植株的揮發(fā)物組分相同，還產(chǎn)生不同于健康樹(shù)皮和木質(zhì)部的新的揮發(fā)性物質(zhì)，如鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、異蒎烷酮、對(duì)-聚傘花素醇等，且與健康植株相同的成分相對(duì)含量還發(fā)生了顯著變化。

受到蟲(chóng)害后的植物揮發(fā)物成分上表現(xiàn)出來(lái)的質(zhì)和量的差異是植物與天敵長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，能給天敵提供精準(zhǔn)的化學(xué)信號(hào)[18-19]，有研究表明，蟲(chóng)害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物可以引誘植食性昆蟲(chóng)的天敵[20-22]，云南木蠹象幼蟲(chóng)在云南松樹(shù)皮和木質(zhì)部取食危害，天敵寄生蜂是如何精準(zhǔn)定位搜索到它，α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯這幾種成分在云南松樹(shù)皮和木質(zhì)部受害前后相對(duì)含量變化較明顯，這幾種化合物是否是引誘天敵的主要物質(zhì)？亦或是新的揮發(fā)性物質(zhì)，如鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、異蒎烷酮、對(duì)-聚傘花素醇？或是其它幾種或某種化合物共同起作用，仍需通過(guò)電生理和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。