徐婧，徐豪明，周有連，彭瑤，趙沖，何杰，黃紅麗，趙海蘭，黃文琪，聶玉強(qiáng)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種以反復(fù)腹痛、腹瀉為特征的炎癥性疾病，常呈慢性，主要包括克羅恩病(Crohn′s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)這兩個類型。IBD的發(fā)病原因復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與遺傳、環(huán)境、免疫和腸道菌群等有關(guān)。隨著微生物-宿主相互作用的深入研究，大量研究表明益生菌或糞菌移植等菌群干預(yù)方法可調(diào)節(jié)宿主腸道菌群、改善腸道屏障功能，進(jìn)而發(fā)揮療效[1-4]。丁酸梭菌是一種以產(chǎn)丁酸為主要特點(diǎn)的專性厭氧菌，其產(chǎn)生的丁酸可直接為結(jié)腸細(xì)胞提供能量，緩解炎癥癥狀[5]。在菌群失調(diào)誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型中，丁酸梭菌可調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，改善屏障功能和黏膜免疫細(xì)胞失調(diào)，促進(jìn)小鼠恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[6]。在炎癥性疾病和自身免疫病中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮重要作用，激活后的NF-κB可轉(zhuǎn)位入核，并顯著上調(diào)如TNF-α、IL-6、IL-1β等眾多促炎因子的表達(dá)，擴(kuò)大機(jī)體炎癥級聯(lián)反應(yīng)。此外，NF-κB抑制劑可明顯減弱腸上皮屏障功能損害[7]。適當(dāng)應(yīng)用抗生素可抑制部分腸道致病菌的過度增長，也有研究證實(shí)糞菌移植前應(yīng)用抗生素可增強(qiáng)移植后菌群的定植。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置有無抗生素清腸預(yù)處理后葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)造模組，并給予丁酸梭菌干預(yù)。通過小鼠體質(zhì)量、疾病活動指數(shù)、屏障改變情況和炎癥因子表達(dá)情況等指標(biāo)，觀察聯(lián)合抗生素預(yù)處理后丁酸梭菌對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎療效的作用，并初步探討丁酸梭菌對于腸黏膜屏障保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Balb/c小鼠購買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號：SCXK[粵]2018-0002)，6～8周齡，體質(zhì)量24～26 g，飼養(yǎng)于廣州市第一人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

丁酸梭菌購于ATCC(ATCC 19398)；DSS購于美國MP biomedical公司；氨芐西林、萬古霉素、新霉素、甲硝唑購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、TB Green Premix Ex TaqⅡ(RR820A)購自日本Takara公司；兔抗鼠NF-κB p65單抗(#8242)、兔抗鼠磷酸化NF-κB p65單抗(#3033)、兔抗鼠IκBα單抗(#4812)和兔抗鼠磷酸化IκBα單抗(#2859)購自美國Cell Signaling TECHNOLOGY公司；兔抗鼠ZO-1多抗(ab216880)、兔抗鼠occludin多抗(ab168986)和兔抗鼠GAPDH單抗(ab181602)購自英國Abcam公司；羊抗兔HRP二抗(S0001)購自Affinity公司；小鼠ACTB內(nèi)參引物購自上海生工公司(B661302-0001)。

1.3 腸炎小鼠模型的建立

進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將30只小鼠隨機(jī)分為5組，具體為空白組(Control)、DSS組(DSS)、抗生素清腸+DSS組(DSS+Antibiotic)、DSS+丁酸梭菌組(DSS+CB)和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組(DSS+Antibiotic+CB)。抗生素清腸方案為：四聯(lián)抗生素(氨芐西林1 g/L、新霉素1 g/L、萬古霉素0.5 g/L、甲硝唑1 g/L)作為飲用水，待自由飲用7 d后更換為正常飲用水3 d，并循環(huán)3次。將3%(w/w)DSS添加到飲用水讓小鼠自由飲用12 d，以構(gòu)建急性結(jié)腸炎模型。每日據(jù)體質(zhì)量下降程度、腹瀉情況及血便情況評分，并按公式DAI=(體質(zhì)量評分+腹瀉評分+血便評分)/3計算DAI分?jǐn)?shù)[8]。所培養(yǎng)出的丁酸梭菌活菌調(diào)整濃度為1×106CFU，于DSS造模期間用于干預(yù)組連續(xù)灌胃；空白組用等量生理鹽水灌胃作為對照。于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，頸椎脫臼法處死小鼠。新鮮結(jié)腸取出后分裝于1.5 mL EP管，并快速放入液氮；取靠近肛門約1 cm的直腸進(jìn)行石蠟包埋切片及HE染色，并進(jìn)行評分[9]。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

沾取丁酸梭菌菌液后于TSA固體培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)，并將該平板置于37 ℃溫箱厭氧孵育24 h。待出現(xiàn)可視菌落后，將其挑出并培養(yǎng)于TSB液體培養(yǎng)基中，繼而轉(zhuǎn)移到37 ℃溫箱厭氧培養(yǎng)14～16 h。待培養(yǎng)管底部出現(xiàn)3～5 mm乳白色沉淀時，將培養(yǎng)管以3 000 rpm/min轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心5 min收集菌體，PBS洗滌菌體3次后，調(diào)整菌液濃度為1×106CFU。

1.5 指標(biāo)檢測方法

1.5.1 RT-QPCR測定促炎因子表達(dá)水平 所用TNF-α、IL-1β因子引物由上海生工有限公司合成，具體序列為：TNF-α上游引物 5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物 5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；IL-1β 上游引物 5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物 5′-CAGTTG-TCTAATGGGAACGTCA-3′。

用Trizol法提取組織總RNA，并據(jù)說明書使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行cDNA的合成。QPCR的反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green Supermix，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，6 μL去離子水和2 μL的cDNA模板(50 ng/μL)。QPCR運(yùn)行程序設(shè)定為95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。確保每次結(jié)果中擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線為單峰，CT值在可信范圍內(nèi)。

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測緊密連接蛋白表達(dá) 將已進(jìn)行石蠟包埋切片的結(jié)腸組織依次進(jìn)行脫蠟、修復(fù)、封閉，繼而由一抗與抗原特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，4°過夜，抗體濃度為ZO-1抗體(1∶200)、Occludin抗體(1∶1 000)；復(fù)溫后孵育二抗40 min，用DAB顯色劑進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞為管腔、隱窩上皮細(xì)胞膜和上皮細(xì)胞連接處呈棕黃色的細(xì)胞。據(jù)切片染色的強(qiáng)度和所判定陽性細(xì)胞百分比分別進(jìn)行評分；兩項相加為最終分?jǐn)?shù)[10]。

1.5.3 Western-blot檢測NF-κB通路表達(dá) 結(jié)腸組織經(jīng)RIPA+PMSF裂解、勻漿后，測蛋白濃度，配制5%、8%聚丙烯凝膠，取總蛋白40 μg上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后孵育一抗，4 ℃過夜，抗體濃度為NF-κB(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)；復(fù)溫后孵育二抗1.5 h；顯像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌可改善結(jié)腸炎大體

由圖1可知，空白組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增加，一般狀況良好。給予DSS造模后，DSS組小鼠于第2天體質(zhì)量下降，并出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)粗糙，以及肉眼血便、大便不成形等結(jié)腸炎表現(xiàn)；給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組小鼠體質(zhì)量及一般狀況較DSS組稍緩解。給予DSS造模后，抗生素清腸+DSS組小鼠體質(zhì)量從第2天起略微下降，自第7天起下降不明顯；但給予丁酸梭菌干預(yù)后，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠體質(zhì)量逐漸增加。

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時，空白組小鼠疾病活動度趨近于0。DSS組小鼠DAI顯著增高(P<0.001)，給予丁酸梭菌干預(yù)后DAI降低。與空白組比較，抗生素清腸+DSS組DAI顯著增加(P<0.001)，而丁酸梭菌干預(yù)可明顯降低其DAI(P<0.01)?？偟膩碚f，抗生素清腸可加強(qiáng)丁酸梭菌降低DAI的效果。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量及末次DAI評分 A：體質(zhì)量；B：末次DAI評分(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 丁酸梭菌改善結(jié)腸炎小鼠腸道病理

由圖2可知，光鏡下空白組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，可見大量杯狀細(xì)胞，黏膜固有層及黏膜下層未見明顯免疫細(xì)胞浸潤。DSS組及抗生素清腸+DSS組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，腺體消失，黏膜固有層及黏膜下層出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤；DSS組嚴(yán)重程度大于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，腺體破損及免疫細(xì)胞浸潤緩解，可見杯狀細(xì)胞；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠結(jié)腸病理程度較DSS+丁酸梭菌組輕。

圖2 各組小鼠結(jié)腸HE染色和病理評分 A：空白組；B：DSS組；C：DSS+抗生素清腸組；D：DSS+丁酸梭菌組；E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組；F：組織病理評分(*P<0.05, ** P<0.01)

據(jù)結(jié)腸黏膜損傷程度和炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評分，可見與空白組相比，DSS組和抗生素清腸+DSS組病理評分顯著升高，且DSS組病理評分高于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組較DSS組病理評分降低(P<0.05)，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組較抗生素清腸+DSS組病理評分均減低(P<0.01)，且后者病理評分較前者下降程度更高。

2.3 丁酸梭菌緩解腸道屏障損傷

ZO-1和occludin是重要的腸道屏障緊密連接蛋白，可間接反映腸屏障損害程度；其表達(dá)程度越高，屏障修復(fù)和抵御外界損傷能力越強(qiáng)[11]。如圖3所示，空白組小鼠結(jié)腸ZO-1表達(dá)顯著，其表達(dá)多位于管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞連接處頂端。與空白組相比，DSS組及抗生素清腸+DSS組ZO-1表達(dá)明顯減少，DSS組ZO-1表達(dá)減少程度重于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組管腔上皮細(xì)胞及隱窩上皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)增強(qiáng)，且抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達(dá)增強(qiáng)最顯著。據(jù)染色強(qiáng)度和炎性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分，可見DSS組和抗生素清腸+DSS組ZO-1表達(dá)評分明顯降低(P<0.001；P<0.05)，而丁酸梭菌干預(yù)組評分均升高(P<0.05)?？股厍迥c+DSS+丁酸梭菌組評分在干預(yù)組中最高。

圖3 各組小鼠結(jié)腸ZO-1免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

如圖4所示，occludin在空白組的管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞連接處頂端均可觀察到表達(dá)，DSS組對比空白組其表達(dá)減少，抗生素清腸+DSS組occludin表達(dá)稍減少。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組occludin表達(dá)增高(P<0.05)，其表達(dá)多位于管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞連接處頂端及少部分胞漿，且抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達(dá)程度增高更明顯。從免疫組化評分來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組評分較空白組明顯降低(P<0.001；P<0.05)，DSS組降低程度更顯著。給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組評分增加(P<0.05)?？股厍迥c+DSS+丁酸梭菌組評分為干預(yù)組中最高。

圖4 各組小鼠結(jié)腸occludin免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

2.4 丁酸梭菌下調(diào)促炎因子表達(dá)

據(jù)圖5可知，與空白組比較，DSS組和抗生素清腸+DSS組促炎因子TNF-α的相對表達(dá)增加，而DSS組增加更為明顯 (P<0.001)。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組TNF-α相對表達(dá)量均下降，DSS+丁酸梭菌組TNF-α表達(dá)下調(diào)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組其TNF-α的相對表達(dá)量最低。促炎因子IL-1β在DSS組的相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，給予丁酸梭菌干預(yù)后的DSS+丁酸梭菌組其表達(dá)顯著下降；但抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS組IL-1β表達(dá)未見明顯升高。

圖5 小鼠結(jié)腸TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量 A： TNF-α；B：IL-1β (*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.5 丁酸梭菌作用與NF-κB通路相關(guān)

如圖6所示，從P65表達(dá)情況來看，DSS組表達(dá)略低于空白組，兩者差異不大；抗生素清腸+DSS組表達(dá)降低較明顯(P<0.001)。DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯低于DSS+抗生素清腸組，且差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。從磷酸化P65表達(dá)情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達(dá)明顯高于空白組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)略升高，且差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。從IκBα表達(dá)情況來看，DSS組表達(dá)低于空白組，其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；抗生素清腸+DSS組表達(dá)略高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)高于DSS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯高于DSS+抗生素清腸組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。從磷酸化IκBα表達(dá)情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達(dá)明顯高于空白組，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯低于DSS+抗生素清腸組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖6 小鼠結(jié)腸NF-κB通路表達(dá)情況 A：Western blot圖；B：各蛋白相對表達(dá)量(*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.6 緊密連接蛋白與NF-κB通路之間的相關(guān)性分析

如圖7所示，將緊密連接蛋白ZO-1和occludin與P65、IκBα及磷酸化的P65、IκBα做相關(guān)性分析顯示，ZO-1與IκBα存在正相關(guān)，occludin與IκBα、P65存在正相關(guān)，其相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)差異；而ZO-1和occludin與磷酸化的P65(ZO-1：P<0.05；occludin：P<0.01)、IκBα(ZO-1：P<0.01)存在負(fù)相關(guān)。

圖7 緊密連接蛋白與NF-κB通路相關(guān)性分析

3 討論

IBD是一種慢性炎癥性疾病。對IBD的傳統(tǒng)治療主要包括水楊酸制劑藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等，雖然可以控制炎癥、調(diào)節(jié)免疫以緩解IBD癥狀，但是存在復(fù)發(fā)率高、緩解率低等缺點(diǎn)。目前，IBD的菌群治療已成為IBD治療十分重要的一部分[12]，而丁酸梭菌屬于益生菌的一種，對IBD的治療也發(fā)揮著作用。利用DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型是IBD的經(jīng)典動物模型。本實(shí)驗(yàn)中，DSS組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質(zhì)量下降、大便形狀改變、排血便等結(jié)腸炎表現(xiàn)；光鏡下見結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜結(jié)構(gòu)紊亂、上皮破損和大量免疫細(xì)胞浸潤，表明結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功。

越來越多的研究表明抗生素清腸準(zhǔn)備對于菌群研究和臨床實(shí)踐具有重要意義，如偽無菌小鼠模型以及糞菌移植前提倡的抗生素腸道準(zhǔn)備[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌干預(yù)可以改善模型組小鼠體質(zhì)量下降，降低疾病活動度，并緩解小鼠腸黏膜損傷和免疫細(xì)胞浸潤；抗生素清腸預(yù)處理后，丁酸梭菌對于體質(zhì)量、疾病活動度和結(jié)腸病理的緩解更顯著?？股厍迥c組小鼠體質(zhì)量變化不明顯可能與萬古霉素的特殊氣味有關(guān)[15-17]。這導(dǎo)致清腸期間小鼠每日飲用水量下降，體質(zhì)量下降明顯，而恢復(fù)正常飲水或含DSS的飲用水后小鼠體質(zhì)量較前上升或較預(yù)期下降不明顯。

腸上皮細(xì)胞和黏液組成的腸黏膜屏障是腸道抵抗外來病原菌的第一道防線[18]。在炎癥發(fā)生時，病原菌可產(chǎn)生大量促炎因子損傷腸黏膜屏障，繼而誘發(fā)擴(kuò)大全身炎癥反應(yīng)。而丁酸梭菌具有產(chǎn)丁酸特性，其產(chǎn)生的丁酸為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量，并具備抗炎作用[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，DSS組小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)明顯降低，而丁酸梭菌干預(yù)可有效升高緊密連接蛋白表達(dá)，緩解腸黏膜屏障損傷。除此之外，與未使用抗生素清腸組比，使用抗生素清腸后的DSS模型組腸屏障損傷較輕，丁酸梭菌緩解效果更明顯。這表明丁酸梭菌活菌能夠減輕腸黏膜屏障損傷，并在抗生素清腸的情況下發(fā)揮更明顯的屏障保護(hù)作用。有研究提出抗生素清潔腸道后再進(jìn)行糞菌移植，可更有利于益生微生物定植于患者腸道，并利用與病原菌的競爭可達(dá)到更好的糞菌移植效果[20]。本實(shí)驗(yàn)中，抗生素清腸預(yù)處理后丁酸梭菌維持腸屏障作用增強(qiáng)，原因可能為由于抗生素清腸去除了大部分共生菌和條件致病菌，更利于丁酸梭菌的定植和釋放丁酸，從而修復(fù)和維持腸上皮屏障。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞中，該二聚體由NFKB1(P50)和RelA(P65)這兩個分子組成，常被IκB抑制并以非活化的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)[21]。當(dāng)受到某些促炎因子或脂多糖刺激后，抑制劑IκB將被磷酸化繼而降解，釋放出NF-κB復(fù)合體入核，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)和介導(dǎo)炎癥和自身免疫病的作用[22-23]。在AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癌模型中，丁酸梭菌及所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以有效減低小鼠NF-κB的表達(dá)[6, 24]，從而緩解癥狀和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。除此之外，在UC患者的結(jié)腸黏膜上皮和黏膜固有層可檢測到NF-κB表達(dá)增加，眾多促炎因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等均可通過增加NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)[25]。與以往研究相符，丁酸梭菌可以降低促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)，磷酸化的P65及IκBα的表達(dá)同樣被下調(diào)；抗生素清腸預(yù)處理后，雖然磷酸化IκBα表達(dá)在丁酸梭菌組被下調(diào)，但是丁酸梭菌下調(diào)磷酸化P65表達(dá)的效果并不明顯。這個現(xiàn)象說明丁酸梭菌可能通過抑制磷酸化IκBα的表達(dá)，恢復(fù)IκBα的作用，從而達(dá)到抑制NF-κB通路及TNF-α、IL-1β表達(dá)、緩解炎癥的效果；而抗生素清腸預(yù)處理對磷酸化P65的改變不符合預(yù)期，可能因?yàn)槠浼訌?qiáng)丁酸梭菌的作用不涉及NF-κB通路，我們還需要進(jìn)一步的NF-κB入核和定位實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)這一結(jié)論。NF-κB的活性形式主要為被磷酸化后由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，而本實(shí)驗(yàn)檢測到總蛋白未磷酸化NF-κB在模型組中表達(dá)略有下調(diào)，丁酸梭菌干預(yù)后其改變不明顯，可能由于所提取的是整個細(xì)胞的總NF-κB，變化無明顯趨勢。此外，在本研究中，緊密連接蛋白表達(dá)與NF-κB和IκBα表達(dá)存在正相關(guān)，而與磷酸化的NF-κB和IκBα表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，說明NF-κB通路可能參與黏膜屏障表達(dá)調(diào)控。但是丁酸梭菌是否通過抑制NF-κB通路進(jìn)而發(fā)揮緩解結(jié)腸炎作用，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，丁酸梭菌可以緩解小鼠大體癥狀及修復(fù)屏障損傷，其機(jī)制可能與NF-κB相關(guān)；抗生素清腸預(yù)處理可以增加其療效，但對NF-κB通路的影響不大。本文仍存在一些不足：①本研究所闡述的可能機(jī)制僅為相關(guān)性。對于丁酸梭菌是否通過直接影響NF-κB起作用及作用方式并不明確，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)加以闡述；②本研究使用的菌株為單一模式菌株，所展現(xiàn)出的作用對宿主可能具有菌株特異性，若要進(jìn)行后續(xù)研究和應(yīng)用需明確菌株?？傊狙芯刻接懥硕∷崴缶鷮τ谀c炎小鼠粘膜屏障和NF-κB通路的改變，并初步探討了丁酸梭菌發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制，但具體直接作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。