唐夢(mèng)旋，陳莉莉，廖寧波,,*，陳 江，程?hào)|慶，吳國平

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330000；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

人源諾如病毒(human norovirus,HuNoV)是全世界非細(xì)菌性腸胃炎的主要病因。HuNoV主要通過糞口途徑感染，而鮮切的綠色蔬菜、草莓和西紅柿等農(nóng)產(chǎn)品及其果汁制品是最常見的、與諾如病毒(norovirus,NoV)暴發(fā)有關(guān)的食品類別[1-2]。鮮榨果(蔬)汁是指以新鮮水果或蔬菜為原料的現(xiàn)榨現(xiàn)飲，即不經(jīng)任何的殺菌處理，供人們直接飲用的非定型包裝飲料。目前，HuNoV的滅活主要依靠加熱、輻射、次氯酸鈉和二氧化鈦處理等傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法，但是這些方法都會(huì)對(duì)食品的生物活性成分產(chǎn)生破壞，最終降低食品的營養(yǎng)和感官價(jià)值[3]。據(jù)報(bào)道，含有類黃酮、多糖和多酚的植物提取物，如石榴提取物、葡萄籽提取物和蔓越莓提取物，可以降低飲料中諾如病毒的感染性[4]。一些天然化合物適合用作安全、健康的抗病毒添加劑。蜂膠是蜜蜂從各種植物中收集的樹脂材料，并與蠟和其他物質(zhì)混合，是一種天然的植物產(chǎn)物，也是常用的食品添加劑成分[5]。蜂膠主要由黃酮類、酚類、芳香酸類、酯類等多種化合物組成，在我國及一些東南亞國家，蜂膠常被添加到果蔬汁中以調(diào)節(jié)口感。據(jù)報(bào)道，蜂膠及其部分活性物質(zhì)可以抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)、甲型和乙型流感病毒、呼腸孤病毒(RV)和艾滋病病毒(HIV)[6]。盡管已有許多關(guān)于蜂膠藥理活性的報(bào)道，但蜂膠對(duì)HuNoV的作用及其機(jī)制尚不清楚，關(guān)于其在果蔬汁中抗諾如病毒的應(yīng)用也鮮有報(bào)道。目前國際上已有許多關(guān)于HuNoV體外培養(yǎng)的探索，并取得了一系列的成果，但HuNoV體外培養(yǎng)體系還不完全穩(wěn)定,無法被廣泛運(yùn)用；因此，對(duì)于抗諾如病毒藥物效果的研究仍然需要通過可培養(yǎng)的HuNoV替代物來完成[7]。選取小鼠諾如病毒(murine norovirus-1,MNV-1)和噬菌體MS2作為HuNoV的替代物。MNV-1是一種可培育的諾如病毒，目前被認(rèn)為是最合適的HuNoV替代物；而MS2在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，感染性實(shí)驗(yàn)比其他替代方法更易進(jìn)行。

本研究擬探討蜂膠水提物(propolis water extract,PWE)和醇提物(propolis ethanol extract,PEE)對(duì)諾如病毒替代物MNV-1和MS2的抑制作用。通過濃度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)對(duì)蜂膠提取物的抗病毒功效進(jìn)行分析；為了進(jìn)一步了解PEE抑制病毒的機(jī)制，在MNV-1感染過程中的不同時(shí)間點(diǎn)，將PEE作用于MNV-1及其縮主細(xì)胞——小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)，測(cè)定病毒的復(fù)制和吸附情況，并利用透射電鏡技術(shù)觀察病毒顆粒的破損情況，進(jìn)一步驗(yàn)證蜂膠提取物的抗病毒機(jī)制；對(duì)蜂膠提取物作為天然添加劑在鮮榨果蔬汁中的抗病毒應(yīng)用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠，浙江江山福賜德蜂業(yè)科技開發(fā)有限公司；噬菌體MS2 (ATCC 15597-B1)、大腸桿菌(ATCC 15597)、MNV-1、小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)，美國典型培養(yǎng)物保藏中心；沒食子酸、D-葡萄糖、蘆丁，均為分析純?cè)噭?，上海索萊寶生物科技有限公司；苯甲酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、柚皮素、α-兒茶素、表兒茶素、喬松素、白楊素、高良姜素、蜂膠黃酮(pinobanksin-3-O-acetate,PB3A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，屬于二氫黃酮)，均為色譜純?cè)噭颇衔髁煞萦邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

3383L70型Thomas-Willey研磨機(jī)，廣州德潤儀器科技有限公司；6000型二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，北京京科瑞達(dá)科技有限公司；JEOL-1400型電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；601型超聲波沖樣機(jī)，美國Gatan公司；JY96-IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀、722S型分光光度計(jì)，上海向帆儀器有限公司；LGJ-10N型冷凍干燥機(jī)，上海錦玟儀器設(shè)備有限公司；BSC-1600IB2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；1384-M型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PEE和PWE的制備

將生蜂膠樣品在-20 ℃冷凍6 h，研磨成均勻的粉末(粒度≤80目)。

PEE的制備：將50 g蜂膠粉溶于150 mL體積分?jǐn)?shù)為96%乙醇中，25 kHz下超聲處理45 min，在室溫下過濾后得到PEE。

PWE的制備：將50 g生蜂膠在研磨機(jī)中粉碎，在80 ℃ 150 mL水中提取12 h，25 kHz下超聲處理45 min，室溫下冷卻過濾后得到PWE[8]。

將粗提取的PEE和PWE溶液以14 000g離心15 min，減壓濃縮上清液后獲得干燥提取物。用體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜(DMSO)溶解PEE，用去離子水溶解PWE，配制質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的PEE和1 000 μg/mL PWE用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并分別以體積分?jǐn)?shù)為5%的DMSO溶液和不含蜂膠的去離子水作為對(duì)照。

1.3.2PEE和PWE的化學(xué)成分鑒定

采用Folin-Ciocalteu比色法計(jì)算提取物中的總酚類化合物含量[9]；采用phenol-sulfuric acid法檢測(cè)可溶性多糖含量[10]；采用比色法測(cè)定總黃酮的含量[11]；采用高效液相色譜(HPLC)分析提取物中酚類物質(zhì)，通過保留時(shí)間和紫外光譜的比較，鑒定蜂膠提取物中的10種酚類化合物，并用標(biāo)準(zhǔn)品曲線進(jìn)行定量 (以mg/g為單位)[12]。

1.3.3蜂膠提取物的抗病毒作用實(shí)驗(yàn)

在濃度相關(guān)性研究中[3-4,13]，用過濾器(孔徑為0.22 μm)將質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的PEE和PWE除菌，并進(jìn)一步無菌稀釋至100、250、500 μg/mL。將等體積的PEE和PWE溶液分別與等體積的MNV-1或MS2混合，使病毒濃度達(dá)到4、8 lgPFU/mL，并在室溫下培養(yǎng)30 min。在時(shí)間相關(guān)性研究中，將質(zhì)量濃度為500 μg/mL的PEE和PWE溶液分別與等體積的MNV-1或MS2混合，分別培養(yǎng)0、10、20、30、40、50、60 min，并將MNV-1和MS2分別與體積分?jǐn)?shù)為5% DMSO和去離子水混合，作為未經(jīng)處理的對(duì)照。培養(yǎng)后，用含有體積分?jǐn)?shù)為10%熱滅活胎牛血清(FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)基(DEME)處理每種混合物，以停止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4MNV-1和MS2的感染性評(píng)估

使用空斑實(shí)驗(yàn)評(píng)估蜂膠提取物處理過的兩種病毒的感染性。MNV-1和MS2的培養(yǎng)方法參照Cheng等[13]報(bào)道。MNV-1在37 ℃下培養(yǎng)5 h后計(jì)數(shù)斑塊，MS2在37 ℃下培養(yǎng)過夜后計(jì)數(shù)斑塊。通過從未處理的對(duì)照組滴度中減去用PEE或PWE處理的樣品的滴度來確定病毒滴度的變化。

1.3.5PEE抑制MNV-1病毒的作用機(jī)制研究

在MNV-1感染RAW264.7細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)，通過添加PEE來測(cè)定病毒在侵染細(xì)胞過程中的復(fù)制和吸附的實(shí)驗(yàn)(time-of-addition experiments),可以初步探索PEE的抗病毒機(jī)制。實(shí)驗(yàn)過程包括前處理[細(xì)胞前處理(pre-RAW264.7)和病毒前處理(pre-MNV-1)]、共同處理(Co-treatment)和后處理(post-treatment)。為了評(píng)價(jià)天然提取物對(duì)病毒吸附的抑制作用，通常采用前處理和共同處理兩個(gè)步驟;為了評(píng)價(jià)天然提取物對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，通常采用后處理來進(jìn)行[14]。

用PEE對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行前處理：采用六孔板培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，向RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液[含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS和1% 雙抗(PS)的DMEM]中加入PEE，使其終質(zhì)量濃度為500 μg/mL。將PEE與細(xì)胞培養(yǎng)液的反應(yīng)體系于37 ℃的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，完全吸除含PEE的細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔中再次加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS和1% PS的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，并向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 μL的MNV-1接種液(病毒終濃度8 lgPFU/mL)。在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中讓MNV-1吸附細(xì)胞1 h后，去除含MNV-1接種物的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔中重新加入1 mL DMEM(含1.5% 瓊脂糖、5% FBS 和0.5% PS)培養(yǎng)基。將六孔培養(yǎng)板在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中培養(yǎng)2 d(42～48 h)后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，計(jì)算空斑數(shù)，并觀察細(xì)胞病變效應(yīng)和空斑形成。對(duì)照組采用滅菌蒸餾水。

用PEE對(duì)MNV-1進(jìn)行前處理：將等體積的PEE與 MNV-1混合，室溫培養(yǎng)40 min后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋中和PEE與病毒的反應(yīng)體系(體系中PEE的終質(zhì)量濃度500 μg/mL，MNV-1終濃度8 lgPFU/mL)。將PEE與病毒的反應(yīng)體系稀釋液(含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)接種到RAW264.7細(xì)胞單層上，在37 ℃溫度下接種1 h，去除含PEE和MNV-1接種物的細(xì)胞培養(yǎng)基。其后步驟按RAW264.7細(xì)胞前處理方法進(jìn)行。

用PEE對(duì)MNV-1和RAW264.7進(jìn)行共同處理：用MNV-1和PEE同時(shí)加入宿主RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%FBS和1% PS的DMEM)中。體系中PEE的終質(zhì)量濃度為500 μg/mL，MNV-1終濃度為8 lgPFU/mL，在37 ℃下混合1 h，去除含PEE和MNV-1接種物的細(xì)胞培養(yǎng)基。其后步驟按RAW264.7細(xì)胞前處理方法進(jìn)行。

用PEE對(duì)MNV-1和RAW264.7進(jìn)行后處理：先用MNV-1(終濃度為8 lgPFU/mL)感染宿主RAW264.7細(xì)胞1 h，再加入PEE(終質(zhì)量濃度為500 μg/mL)在37 ℃處理40 min，去除含PEE和MNV-1接種物的細(xì)胞培養(yǎng)基。其后步驟按RAW264.7細(xì)胞前處理方法進(jìn)行。

1.3.6透射電子顯微鏡成像分析

將3 μL經(jīng)PEE和PWE處理的MS2和MNV-1懸浮液用水稀釋10倍，置于輝光放電碳涂層電磁柵極上，并用3 μL體積分?jǐn)?shù)為3%的醋酸鈾酰水溶液染色1 min。待染色的網(wǎng)格干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡檢測(cè)，以40 000倍的放大倍率拍攝圖像。

1.3.7PEE在果蔬汁中的抗病毒實(shí)驗(yàn)

從浙江省杭州市的一家超市獲得4種果蔬汁(番茄汁，pH值為4.0；生菜汁，pH值為4.1；葡萄汁，pH值為3.3和橙汁，pH值為3.5)。將初始滴度為7 lgPFU/mL的MNV-1和MS2接種于果蔬汁中，與PEE(250 μg/mL)等體積混合，并在室溫下處理30 min。細(xì)胞毒性對(duì)照組僅包括不添加PEE的果汁。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)的平均值。對(duì)于兩組以上數(shù)據(jù)的多重比較，采用單因素方差分析和Fisher最小顯著性差異檢驗(yàn)方法。P<0.05時(shí)，表示數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEE和PWE的化學(xué)成分分析

蜂膠中PEE、PWE的提取率和化學(xué)成分分析結(jié)果見表1。由表1可知：PEE和PWE提取率分別為19.87%和13.11%；PEE中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(151.54±9.74)μg/mg，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(70.05±2.56)μg/mg；PWE中可溶性多糖含量為338.43±7.32 μg/mg，其總酚、總黃酮含量低于PEE。這一組成也證實(shí)了總酚是PEE的主要成分，可溶性多糖是PWE的主要成分。蜂膠提取物中酚類化合物的HPLC分析結(jié)果見表2。表2表明：在PEE的多酚類化合物中，主要化合物為高良姜素(galangin)、蜂膠黃酮(pinobanksin-3-O-acetate)、喬松素(pinocembrin)和白楊素(chrysin)；PWE的總酚、總黃酮含量低于PEE。有研究表明，一些含酚的天然成分，特別是抗黏附酚可以抑制包括細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物在內(nèi)的微生物毒素或腸道病原體的黏附[15]。2010年，Schnitzler等[16]研究了蜂膠化合物對(duì)游離單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)斑塊形成的影響，發(fā)現(xiàn)與未處理的對(duì)照組相比，高良姜素和白楊素分別使游離HSV-1斑塊的形成減少了68.0%和56.4%。

表1 蜂膠提取物的提取率及其主要化學(xué)成分Tab.1 Extraction rate and main chemical components of propolis extract μg /mg

表2 蜂膠提取物中酚類化合物的HPLC分析結(jié)果Tab.2 Results of analysis of phenolic compounds in propolis extract by HPLC mg/g

不同濃度的蜂膠提取物(PEE和PWE)對(duì)宿主細(xì)胞RAW 264.7存活的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。圖1表明，當(dāng)高濃度PEE或PWE添加到宿主細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)RAW 264.7細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。當(dāng)PEE或PWE質(zhì)量濃度小于等于500 μg/mL時(shí)，未觀察到其細(xì)胞毒性作用。因此，在接下來的抗病毒實(shí)驗(yàn)中，空斑實(shí)驗(yàn)所用PEE和PWE的質(zhì)量濃度(≤500 μg/mL)，不會(huì)影響使用宿主細(xì)胞確定抗病毒效果的能力。

*表示PWE與PEE相比差異顯著(P<0.05)。圖1 不同濃度的蜂膠提取物對(duì)宿主細(xì)胞RAW264.7存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of propolis extract on survival rate of RAW264.7 cells

2.2 蜂膠提取物的抗病毒作用分析

2.2.1濃度相關(guān)性分析

研究了蜂膠提取物(PEE和PWE)對(duì)諾如病毒替代物(MNV-1和MS2)的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。當(dāng)MNV-1和MS2起始濃度為低滴度(4 lgPFU/mL)時(shí)，低滴度的PEE(100 μg/mL)作用使MNV-1和MS2的滴度分別下降了2.09 lgPFU/mL和2.66 lgPFU/mL，表現(xiàn)出顯著的病毒抑制效果，但隨著后續(xù)PEE濃度的增加，病毒的減少效果并不顯著，而是一直保持著一個(gè)較低的水平，直到無法檢測(cè)；PWE僅在高濃度500 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出顯著的病毒抑制效果。

*表示PWE或PEE與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖2 不同濃度的蜂膠提取物對(duì)MS2和MNV-1病毒滴度的影響Fig.2 Effects of different concentrations of propolis extracts on virus titer of MS2 and MNV-1

當(dāng)MNV-1和MS2起始濃度為高滴度(18 lgPFU/mL)時(shí)，圖2(a)顯示，當(dāng)用100 μg/mL PEE處理MS2時(shí)，病毒滴度下降了0.77 lgPFU/mL；當(dāng)PEE質(zhì)量濃度增加到500 μg/mL時(shí)，病毒滴度下降了3.75 lgPFU/mL。圖2(b)表明：PEE對(duì)MNV-1的抑制作用更顯著，當(dāng)用100 μg/mL PEE處理MNV-1時(shí)，MNV-1病毒滴度下降了1.32 lgPFU/mL；用500 μg/mL PEE處理MNV-1時(shí)，MNV-1病毒滴度下降了6.93 lgPFU/mL。

使用PWE處理病毒時(shí)，同樣觀察到PWE的抗病毒活性。由圖2可見，質(zhì)量濃度為100、250、500 μg/mL的PWE可有效降低MNV-1和MS2的病毒滴度，且呈濃度相關(guān)性。然而，在實(shí)驗(yàn)中使用3種濃度的PWE處理病毒后，發(fā)現(xiàn)MS2滴度的下降均小于1 lgPFU/mL，說明與PEE抑制病毒的效果相比，PEE比PWE更有效。

與此研究結(jié)果類似，Kwon等[17]的研究表明，蜂膠提取物kaempferol (KF)和p-coumaric acid (p-CA)可能阻止或減少病毒進(jìn)入細(xì)胞，以保護(hù)細(xì)胞免受病毒破壞；Urushisaki等[18]發(fā)現(xiàn)了蜂膠提取物與MDCK細(xì)胞表面之間存在強(qiáng)烈的相互作用；Büfalo等[19]研究了70%乙醇提取PEE對(duì)HEp-2細(xì)胞系中脊髓灰質(zhì)炎病毒1型(PV1)的體外抗病毒活性。

2.2.2時(shí)間相關(guān)性分析

圖3為蜂膠提取物與病毒抑制作用的時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3顯示，質(zhì)量濃度為250 μg/mL的蜂膠提取物與MNV-1和MS2培養(yǎng)0、10、20、40、60 min，病毒滴度與培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)。在對(duì)照組中，磷酸鹽緩沖液(PBS)中MNV-1和MS2的滴度在60 min內(nèi)無變化，而實(shí)驗(yàn)組中，在質(zhì)量濃度為250 μg/mL PEE作用下，病毒量隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯下降。病毒與PEE混合后10 min，MNV-1和MS2的滴度分別下降1.56、1.02 lgPFU/mL；在接下來的30 min內(nèi)，MNV-1的滴度繼續(xù)下降2.62 lgPFU/mL，MS2的滴度繼續(xù)下降2.28 lgPFU/mL；在剩余的20 min培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，MNV-1和MS2的病毒滴度僅略有下降。PWE的抗病毒作用則弱于PEE，經(jīng)質(zhì)量濃度為250 μg/mL PWE處理60 min后，MNV-1和MS2的總滴度分別減少1.56 lgPFU/mL和1.34 lgPFU/mL。因此，PEE在降低MNV-1和MS2滴度方面比PWE更有效。

*表示PWE或PEE與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖3 PEE或PWE處理后MNV-1和MS2病毒滴度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.3 Changes of virus titers of MNV-1 and MS2 with different incubation time after exposure to PEE or PWE

2.3 PEE的抗病毒機(jī)制分析

2.3.1PEE對(duì)病毒吸附與復(fù)制作用的影響

在MNV-1感染RAW264.7細(xì)胞之前，或者同時(shí)與PEE作用，抗病毒效果顯著則說明PEE可能發(fā)揮與宿主細(xì)胞(受體)結(jié)合或直接與病毒顆粒結(jié)合的作用，阻斷病毒顆粒與宿主細(xì)胞的附著或結(jié)合，阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；在MNV-1感染RAW264.7細(xì)胞之后加入PEE，抗病毒效果顯著則說明PEE抑制了病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[20-21]。使用PEE的抗病毒實(shí)驗(yàn)是在沒有細(xì)胞毒性的濃度下進(jìn)行的，即用質(zhì)量濃度為250 μg/mL和500 μg/mL的PEE處理后，RAW264.7細(xì)胞的存活率大于85%。PEE對(duì)MNV-1病毒吸附和復(fù)制的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4顯示：用質(zhì)量濃度為500 μg/mL PEE對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行前處理，與對(duì)照組相比，MNV-1滴度相差3.87 lgPFU/mL；用質(zhì)量濃度為500 μg/ml PEE對(duì)MNV-1進(jìn)行前處理，病毒滴度較對(duì)照組降低5.18 lgPFU/mL。與對(duì)照組相比，質(zhì)量濃度為500 μg/mL PEE共同處理組MNV-1滴度降低了1.74 lgPFU/mL；病毒感染后用質(zhì)量濃度為500 μg/mL PEE處理，MNV-1的滴度比對(duì)照組降低0.37 lgPFU/mL。本研究表明：用PEE對(duì)病毒進(jìn)行前處理表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病毒活性，推測(cè)PEE對(duì)病毒感染的作用機(jī)制可能是PEE與宿主細(xì)胞(受體)結(jié)合，或直接與病毒顆粒結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的黏附或結(jié)合，阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。

2.3.2TEM分析結(jié)果

*表示PEE與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖4 PEE對(duì)MNV-1病毒吸附和復(fù)制的影響Fig.4 Influence of PEE on MNV-1 absorption and replication

為了進(jìn)一步確定PEE的作用方式，在用PBS(不含PEE)和質(zhì)量濃度為500 μg/mL的PEE處理病毒前后，通過TEM觀察低滴度MNV-1的形態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。圖5(a)顯示，處理前，MNV-1病毒顆粒呈球形，約為30～35 nm。用不含PEE 的PBS處理后，MNV-1病毒顆粒的形態(tài)和大小與未處理對(duì)照組無差異。由圖5(b)可知：經(jīng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL PEE處理后，MNV-1病毒顆粒的形態(tài)和大小增大到直徑80～100 nm，表明顆粒變性、增大，部分顆粒破碎；MS2經(jīng)處理后同樣發(fā)現(xiàn)顆粒增大和碎片增多的現(xiàn)象。由于MNV-1的電鏡圖片與MS2相比更具有代表性，因此未附上MS2的掃描電鏡圖。本研究結(jié)果與Coelho等[22]用類黃酮化合物(C-糖基黃酮)處理的HSV和Gilling等[23]用牛至油(Oregano oil)處理的MNV-1的形態(tài)變化相似。這些結(jié)果表明，PEE可能是用使病毒衣殼蛋白變性的方式抑制病毒。

圖5 不存在或存在PEE時(shí)MNV-1的成像分析結(jié)果Fig.5 Imaging analysis of MNV-1 in absence or presence of PEE

2.4 PEE在果蔬汁中的抗病毒活性分析

*表示各實(shí)驗(yàn)組與未添加PEE的對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖6 PEE在鮮榨果蔬汁中的抗病毒活性Fig.6 Antiviral activity of PEE in fresh vegetable and fruit juices

部分綠色蔬菜以及漿果類農(nóng)產(chǎn)品易被病毒附著，因此在鮮榨蔬菜汁和果汁中存在很高的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。雖然一些天然化合物本身可以作為調(diào)味添加劑加入果蔬汁中提升口感，但對(duì)于其在果汁體系中抑制病毒效果的報(bào)道卻很少。單一果汁實(shí)驗(yàn)表明，除了葡萄汁對(duì)病毒的存活有一定的影響，其他鮮榨生菜汁、橙汁和番茄汁本身的成分對(duì)病毒的存活率影響不大。當(dāng)加入PEE后，發(fā)現(xiàn)PEE對(duì)果蔬汁中MS2和MNV-1具有顯著抑制作用，病毒存活率顯著降低。圖6為質(zhì)量濃度250 μg/mL的PEE在4種果蔬汁中的抗病毒活性。圖6顯示，用質(zhì)量濃度為250 μg/mL的PEE處理30 min后，蔬菜汁和果汁中的MS2和MNV-1滴度都有所下降。與未添加PEE的對(duì)照組相比，MS2在生菜汁、番茄汁、葡萄汁和橙汁中的存活率分別下降了39%、27%、19%和30%；而對(duì)于MNV-1，用250 μg/mL PEE處理后，生菜汁、番茄汁、葡萄汁和橙汁中病毒存活率分別降低了59%、36%、20%和36%。由圖6可知，PEE對(duì)MS2和MNV-1具有一定的抑制效果,且相較于MS2，PEE對(duì)MNV-1的抑制作用更顯著。與此研究結(jié)果一致，Randazzo等[24]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過綠茶提取物處理的生菜和菠菜中的MNV和甲型肝炎病毒(HAV)，滴度降低了1.5 lgPFU/mL以上；同樣，Su等[25]發(fā)現(xiàn)，在用1 mg/mL葡萄籽提取物處理1 min后，生菜和胡椒中的MNV和HAV滴度減少量分別為1.23 lgPFU/mL和1.29 lgPFU/mL。由于蜂膠可以較低成本獲得，且蜂膠作為抑制諾如病毒的天然添加劑時(shí)所需添加的劑量并不多，因此，蜂膠提取物的成本能夠控制在一個(gè)合理范圍內(nèi)，具有經(jīng)濟(jì)可行性。PEE在鮮榨果(蔬)汁中的抑制病毒活性應(yīng)用，將有可能為其在果蔬汁鮮榨過程中挑選合適的添加劑提供更多的選擇。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為100、250、500 μg/mL的蜂膠提取物可有效降低MNV-1和MS2的病毒滴度，并呈濃度和時(shí)間相關(guān)性，證明蜂膠提取物PEE和PWE具有一定的抗病毒作用，且PEE能夠比PWE更有效地抑制病毒MNV-1和MS2。time-of-addtion experiments及TEM成像分析表明，PEE可能是以破壞病毒衣殼蛋白的方式抑制病毒。通過對(duì)PEE的化學(xué)成分分析，推測(cè)酚類成分可能是PEE的主要活性成分。PEE也可用作農(nóng)產(chǎn)品的天然添加劑，經(jīng)過30 min PEE處理后，蔬菜汁和果汁的MNV-1和MS2滴度顯著降低。PEE可望作為一種天然的抗病毒添加劑應(yīng)用于鮮切的蔬菜和果汁中。