馮 康，李愛民,，吳曉磊，高曉冬，李子杰,*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122;2.新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)(集團(tuán))有限公司，北京 102206)

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.)原產(chǎn)于南美海拔3 500 m以上的安第斯山區(qū)，是葉子橢圓、根莖形似小圓蘿卜的十字花科獨(dú)行菜屬一年生草本植物，又稱印加蘿卜。瑪咖營養(yǎng)成分豐富，因在秘魯具有悠久的栽種歷史，所以有“秘魯人參”“南美人參”的美譽(yù)。我國于2003年引種成功，如今在云南和新疆等地已形成了一定規(guī)模的種植產(chǎn)業(yè)。瑪咖多糖的提取工藝有多種，包括熱水浸提、超聲波輔助浸提以及微波輔助浸提等。鄭朋朋等[1]采用熱水浸提的方式對(duì)瑪咖多糖的提取率進(jìn)行優(yōu)化，在提取溫度82 ℃下提取率達(dá)到9.6%。郝利民等[2]優(yōu)化熱水浸提瑪咖多糖，提取率達(dá)到了15.9%，但提取溫度高達(dá)100 ℃。研究表明：提取溫度會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生影響，多糖在高溫提取會(huì)發(fā)生部分降解，分子質(zhì)量減少，并且多糖的抗氧化活性也會(huì)下降。浦躍武等[3]等通過比較超聲波、微波和熱水浸提這三種提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲波提取的效果最好，微波次之，熱水浸提效果最差。超聲波輔助熱水浸提可以降低提取溫度、減少提取時(shí)間[4]。

瑪咖多糖具有抗疲勞[5-6]、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫能力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等諸多功效[7-11]，且毒性很小，作為功能性食品有很好的開發(fā)前景。目前對(duì)瑪咖多糖的活性研究多集中在抗疲勞和抗氧化活性方面，對(duì)其降血脂的功效鮮有研究。本研究采用超聲波輔助熱水浸提的方式對(duì)瑪咖多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，降低了提取溫度，減少了提取時(shí)間；同時(shí)本研究利用體外實(shí)驗(yàn)研究其可能的降血脂功效，以期為瑪咖多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料瑪咖使用的是瑪咖根部，采于2017年云南香格里拉地區(qū)，自然晾干直至實(shí)驗(yàn)。

淀粉酶(384 U/mL)、糖化酶(300 U/mL)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；考來烯胺，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇為分析純，苯酚為試劑純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鄰二氮菲(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)、牛磺膽酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%)、甘氨膽酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、糠醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、胰蛋白酶(250 U/mg)，Adamas試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SB25- 12DTDN型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物有限公司；HL- 2型恒流蠕動(dòng)泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；DEAE- 650M型離子交換柱、HW- 65F型葡聚糖凝膠柱，日本TOSOH株式會(huì)社；BIO- RAD iMark型酶標(biāo)儀，美國伯樂公司;FD- 1000型冷凍干燥機(jī)、N- 1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1瑪咖多糖的提取

1.3.1.1 提取方法

將瑪咖根切塊、打碎成粉，過100目篩，制成瑪咖粉，取50 g瑪咖粉按一定比例與蒸餾水混合，超聲波輔助熱水浸提，過濾得到瑪咖水提物，減壓濃縮至250 mL；在瑪咖水提液中加入2 mL淀粉酶，60 ℃下反應(yīng)3 h后加入2 mL糖化酶，60 ℃下反應(yīng)2 h，100 ℃加熱10 min使酶滅活，離心取上清液；向上清液中加入3倍體積無水乙醇，在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液、4 ℃下醇沉12 h，將沉淀物用蒸餾水復(fù)溶；采用Sevag法對(duì)復(fù)溶液反復(fù)多次操作以去除蛋白；將去除淀粉和蛋白的水提溶液凍干，得到瑪咖粗多糖(maca crude polysaccharides,MCP)。

1.3.1.2 提取率的測定

先用苯酚硫酸法測定總糖含量(以葡萄糖計(jì))，并通過換算因子測定瑪咖多糖的提取率。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取葡萄糖20 mg于100 mL容量瓶用重蒸H2O定容，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL葡萄糖母液至試管中，補(bǔ)加水至2 mL，再依次加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚水溶液和5 mL濃硫酸，振蕩10 min，靜置10 min顯色，于490 nm處測吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度ρ葡(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

換算因子F的計(jì)算見式(1)。

(1)

式(1)中，m1為瑪咖多糖質(zhì)量，mg；ρm為瑪咖多糖的總糖質(zhì)量濃度(以葡萄糖計(jì))，mg/mL;D為稀釋倍數(shù)。

瑪咖多糖提取率計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中，w為瑪咖多糖提取率；m2為瑪咖干粉質(zhì)量，mg；ρm為瑪咖多糖的總糖質(zhì)量濃度(以葡萄糖計(jì))，mg/mL;D為稀釋倍數(shù)；F為換算因子。

1.3.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box- Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平的三元二次響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化瑪咖根多糖的提取工藝。在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼(見表1)，共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，中心實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 瑪咖多糖提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab.1 Response surface methodology factors and levels of maca polysaccharide extraction condition

1.3.2瑪咖多糖的組分分離

取200 mg瑪咖粗多糖，溶于2 mL重蒸H2O，以1 mL/min的洗脫速度通過陰離子交換柱DEAE- 650M分離，先用重蒸H2O洗脫，待中性多糖全部收集之后，再用氯化鈉水溶液濃度梯度(0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L)洗脫。每管中多糖的含量用苯酚硫酸法測定，將含有多糖的試管收集，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到樣品。對(duì)冷凍干燥的樣品再次用葡聚糖凝膠柱(HW- 65F)分離，采用重蒸H2O洗脫達(dá)到脫鹽純化的目的，將含有多糖的樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，得到純化后的多糖樣品。

1.3.3體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

以維生素C(Vc)作為陽性對(duì)照，葡萄糖(Glc)作為陰性對(duì)照進(jìn)行抗氧化活性的對(duì)比。

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性的測定

取0.5 mL不同質(zhì)量濃度(1、2、4、6、8、10 mg/mL)的樣品與0.5 mL DPPH(0.04 mg/mL，溶于無水甲醇)混合，充分振蕩并室溫靜置40 min，在517 nm處測定吸光度。

(3)

式(3)中，A1表示用無水甲醇代替樣品的吸光度，A2表示用無水甲醇代替DPPH溶液的吸光度，A3表示DPPH溶液和樣品混合反應(yīng)后的吸光度。

1.3.3.2 羥自由基清除活性的測定

取0.5 mL不同質(zhì)量濃度(1、2、4、6、8、10 mg/mL)的樣品水溶液與0.5 mL硫酸亞鐵水溶液(6 mmol/L)以及1 mL H2O2(6 mmol/L)混勻，靜置10 min，再加入0.5 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)，混勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光度。

(4)

式(4)中，A4表示不添加樣品的吸光度；A5表示添加樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.3.4體外降血脂活性實(shí)驗(yàn)

瑪咖多糖組分體外降血脂活性測定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法并作適當(dāng)修改[12-13]。分別取1 mL不同濃度的牛磺膽酸鈉和甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)于具塞試管中，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的現(xiàn)配糠醛水溶液，混勻，冰浴5 min，加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的H2SO4水溶液于70 ℃水浴10 min，取出冰浴2 min，在510 nm處測定吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪得膽酸鹽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣液中膽酸鹽的濃度。膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程見圖1，在具塞試管中加入20 mg的多糖粉末，加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶液，充分混勻，37 ℃振蕩消化1 h用來模擬胃消化，然后用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.3，然后加入2 mL 10 mg/mL的胰蛋白酶，混勻后37 ℃孵育1 h來模擬小腸消化。分別加入2 mL 0.5 mmol/L甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c水溶液混勻，37 ℃振蕩1 h，用3 kDa超濾管4 000 r/min離心30 min。如果多糖與膽酸鹽結(jié)合，透過液中為未與多糖結(jié)合的膽酸鹽，測定透過液中的膽酸鹽濃度，即可得出多糖與膽酸鹽的結(jié)合率。取1 mL透過液于具塞試管中，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的現(xiàn)配糠醛水溶液，混勻，冰浴5 min，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的H2SO4水溶液于70 ℃水浴10 min，取出冰浴2 min，在510 nm處測定透過液吸光度。以葡萄糖作為陰性對(duì)照，以考來烯胺為陽性對(duì)照，按考來烯胺的結(jié)合率為100%，計(jì)算各種多糖對(duì)膽酸鈉鹽的結(jié)合率。

圖1 瑪咖多糖膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Procedure for binding ability experiment of maca polysaccharide cholate

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析采用Design-Expert 10軟件。其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示，采用Prism 8.0軟件做數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪咖多糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Zhang等[14]在研究不同溫度對(duì)桑葚多糖結(jié)構(gòu)和功能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)30 ℃提取時(shí)，多糖分子質(zhì)量為536.45 kDa，而90 ℃下分子質(zhì)量只有110.23 kDa，且低溫提取的多糖顯示出比高溫提取更好的抗氧化活性。項(xiàng)浩特等[15]研究了溫度和時(shí)間對(duì)瑪咖多糖提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)在70 ℃以上隨著溫度和時(shí)間的增加，提取率不斷降低。因此，本研究選擇采用超聲波輔助熱水浸提的方式提取多糖，并用響應(yīng)面法優(yōu)化提取率。采用Design-Expert 10 軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，見表2。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)方案，按照1.3.1.1節(jié)的方法提取瑪咖多糖，并用苯酚硫酸法測定多糖含量，提取率見表2。

表2 瑪咖多糖提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of response surface experiment of maca polysaccharide extraction conditions

2.1.2響應(yīng)面模型擬合分析

2.1.3各因素交互作用分析

各因素的交互作用對(duì)瑪咖多糖提取率的等高線與響應(yīng)面見圖2。從等高線可以看出兩個(gè)因素之間的交互作用的強(qiáng)弱，等高線越圓相互作用越弱，等高線橢圓形越明顯，相互作用越強(qiáng)[16]。從響應(yīng)面曲線可以看出各因素對(duì)響應(yīng)值(即瑪咖多糖提取率)的影響程度，曲面越陡，影響程度越大、越平坦，影響程度就越小[17]。從4個(gè)因素相互作用中選出3個(gè)代表性的結(jié)果，對(duì)比圖2(a)與圖2(b)，可以發(fā)現(xiàn)溫度與時(shí)間的交互作用比溫度與超聲功率的交互作用更強(qiáng)，從圖2(c)可以看出料液比對(duì)瑪咖多糖提取率的影響程度比時(shí)間大。

圖2 各因素的交互作用對(duì)瑪咖多糖提取率的影響Fig.2 Interaction of different factors on extraction rate of mace polysaccharide

通過軟件Design-Expert 10分析，得到較佳的提取條件為提取溫度50.23 ℃、超聲功率217.74 W、提取時(shí)間42.35 min、料液比1∶32.34 g/mL，理論提取率為11.86%，考慮到實(shí)際提取的方便性，將各因素的值修正為提取溫度50 ℃、超聲功率220 W、提取時(shí)間42 min，料液比1∶32 g/mL，最后得到的實(shí)際瑪咖多糖提取率為11.0%，與理論預(yù)測值接近。

2.2 瑪咖多糖的組分分離結(jié)果

采用陰離子交換柱DEAE- 650M對(duì)瑪咖多糖各組分進(jìn)行分離，用苯酚硫酸法測定每管中多糖的濃度，見圖3。固定洗脫速度為1 mL/min，先用重蒸H2O洗脫，得到含量最多的中性瑪咖多糖1(maca polysaccharides 1,MPS1)，再用氯化鈉濃度梯度洗脫，在0.1 mol/L NaCl和0.2 mol/L NaCl水溶液下分別分離得到2個(gè)含量較少組分，分別命名為瑪咖多糖2(maca polysaccharides 2,MPS2)和瑪咖多糖3(maca polysaccharides 3,MPS3)。之后，對(duì)MPS1、MPS2和MPS3進(jìn)行再次純化并去除其中的NaCl，如將含有MPS1的試管匯總后冷凍干燥，用1 mL重蒸H2O復(fù)溶，用葡聚糖凝膠柱HW- 65F進(jìn)行再次純化，收集匯總純化后的MPS1，再次冷凍干燥，最后得到MPS1多糖樣品。

圖3 瑪咖粗多糖組分分離Fig.3 Separated fractions of maca crude polysaccharide

2.3 瑪咖多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除效果分析

瑪咖多糖對(duì)DPPH自由基清除率見圖4，由圖4可以看出隨著多糖濃度的增加，3種多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果都呈現(xiàn)出上升的趨勢，其中，MPS1對(duì)DPPH自由基清除效果最佳，在5 mg/mL的濃度下，基本達(dá)到了較佳清除率81.8%。MPS2在超過5 mg/mL后清除效果有明顯的增加，在10 mg/mL的濃度下清除效果也達(dá)到了63.7%。此外，粗多糖MCP在3 mg/mL濃度以下時(shí)清除率低于MPS1，之后清除率與MPS1基本持平，在5 mg/mL的濃度下達(dá)到較佳清除率83.9%，MCP和MPS1的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為2.411 mg/mL和2.339 mg/mL。MCP中MPS1占到絕大部分，MCP的清除率與MPS1類似，說明MPS1組分是起到DPPH自由基清除的主要原因。維生素C在0.001～0.005 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)DPPH自由基清除效果隨著濃度提高急劇提升，從35.8%提高到81.6%，在1 mg/mL質(zhì)量濃度達(dá)到較佳清除率99%，MCP、MPS1和MPS2的清除效果均低于維生素C。

圖4 瑪咖多糖的DPPH自由基清除效果Fig.4 Scavenging effect of DPPH radical of maca polysaccharide

2.3.2羥基自由基清除效果分析

瑪咖多糖對(duì)羥基自由基清除率見圖5，由圖5可以看出MCP、MPS1和MPS2對(duì)羥自由基均有較好的清除效果，隨著多糖濃度的提高，對(duì)羥自由基的清除率也有所提高。其中MCP在10 mg/mL的質(zhì)量濃度下清除率達(dá)到了73.3%，半數(shù)抑制濃度(IC50)為2.388 mg/mL。MPS2在10 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到了76.7%，MPS1的清除效果隨著濃度增大變化不大，在1 mg/mL時(shí)達(dá)到39.8%，高于MCP和MPS2，10 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到56.8%，而MPS3對(duì)羥基自由基沒有清除效果，在各個(gè)濃度下清除率均與陰性對(duì)照組相似。

圖5 瑪咖多糖的羥基自由基清除效果Fig.5 Scavenging effect of hydroxyl radical of maca polysaccharide

2.4 瑪咖多糖體外降血脂活性分析

肝臟內(nèi)的膽固醇降解成膽汁酸排入腸道，其中95%的膽汁酸會(huì)通過重吸收經(jīng)門靜脈返回肝臟，形成結(jié)合膽汁酸并再次排入腸道，此過程為肝腸循環(huán)[18]。膽汁酸對(duì)維持人體內(nèi)膽固醇的平衡起到至關(guān)重要的作用，一旦阻礙了膽汁酸的肝腸循環(huán)，肝臟就會(huì)通過降解更多的膽固醇來彌補(bǔ)膽汁酸的缺失，這就使得血液中的膽固醇流入肝臟，起到了降血脂的作用[19]。而甘氨膽酸和?；悄懰峋鶎儆诮Y(jié)合型初級(jí)膽汁酸，常與鈉離子或鉀離子結(jié)合形成結(jié)合型初級(jí)膽汁酸鹽，這是膽汁酸的主要存在形式。多糖類物質(zhì)降血脂的主要原理是在溶液中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能在小腸中夠吸附住膽汁酸，阻止膽汁酸重吸收。

瑪咖多糖對(duì)2種膽酸鹽的結(jié)合率見圖6，由圖6可以看出，與陰性組對(duì)比，4種多糖對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合均有顯著性，但只有MCP和MPS3對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合有顯著性差異(P<0.05)。以考來烯胺為陽性對(duì)照，MPS3在體外對(duì)2種膽酸鈉鹽的結(jié)合能力最好，對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合率為49.1%，對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合率為32.3%，造成兩種膽酸鈉鹽結(jié)合能力不一致的原因可能與兩種膽酸鈉的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，牛磺膽酸鈉的分子質(zhì)量比甘氨膽酸鈉更大，更易被溶于水后形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的MPS包裹結(jié)合。同時(shí)，橫向比較4種多糖，可以推測MPS3形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可能更加緊密。

圖6 瑪咖多糖對(duì)膽酸鈉鹽的結(jié)合能力Fig.6 Binding capacity of maca polysaccharide toward sodium cholate

3 結(jié) 論

研究采用超聲波輔助熱水浸提的方法，響應(yīng)面優(yōu)化之后得到較佳的提取條件為提取溫度50 ℃、超聲功率220 W、提取時(shí)間42 min，料液比1∶32 g/mL，最后得到的實(shí)際瑪咖多糖提取率為11.0%。MCP、MPS1和 MPS2具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基的較佳清除率分別為83.9%、81.8%和63.7%，對(duì)羥基自由基的較佳清除率分別為73.3%、56.8%和76.7%；MPS3雖然沒有抗氧化活性，但是在體外對(duì)?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率分別達(dá)到了49.1%和32.3%，推測瑪咖多糖可能會(huì)通過吸附結(jié)合膽酸鈉鹽的方式，減少肝腸循環(huán)，從而具有降低血脂的活性。