林能鋒 陳立志 曾 紅＊

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南方海洋研究院 福州 350007)

感染大黃魚的纖毛蟲主要有剌激隱核蟲（Crypotocaryon irritans）、淀粉卵渦鞭蟲和盾纖毛蟲，是對大黃魚人工養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害的一大類病原[1]。 曾有報道， 刺激隱核蟲導(dǎo)致的平均發(fā)病率在30%～100%，局部死亡率也達(dá)到80%[2]。大黃魚魚苗感染淀粉卵渦鞭蟲的死亡率可達(dá)75%～100% ，成魚死亡率50%～70%[3-4]。 盾纖毛蟲被認(rèn)為是一種兼性的機(jī)會性寄生蟲，常造成海水養(yǎng)殖動物的感染，在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)殖魚類造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。 貪食邁阿密蟲（M. avidus）、海洋尾絲蟲（Uronema marinum）和水滴偽康纖蟲（Pseudocohnilembus persalinus）是最常見的感染海水養(yǎng)殖動物的致病盾纖毛蟲。近年來，由盾纖毛蟲感染大黃魚的病例發(fā)生率越來越高。 我們分離并保存了一株感染大黃魚的盾纖毛蟲， 經(jīng)鑒定為貪食邁阿密蟲（M. avidus）。

纖毛蟲受生活環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)濃度梯度刺激的影響，能產(chǎn)生趨向性運(yùn)動[6-7]。 魚類致病纖毛蟲的趨化特性可能與其對魚體的侵染密切相關(guān)[8]。 而目前對于盾纖類纖毛蟲對養(yǎng)殖魚類的趨化性研究尚未見相關(guān)報道。 本研究通過研究貪食邁阿密蟲對4 種海水養(yǎng)殖魚類組織勻漿液的趨化性， 推測其可能的侵染路徑，以加深對盾纖類纖毛蟲致病性的理解。

1 材料和方法

1.1 貪食邁阿密蟲 貪食邁阿密蟲 （M. avidus）為本實驗室保存的分離自患病大黃魚蟲株。 培養(yǎng)方法參照林能鋒等[9]描述的方法，18 ℃培養(yǎng)2～3 d，蟲體培養(yǎng)密度＞5 000 ind/mL。

1.2 魚類組織勻漿的制備 大黃魚、黃姑魚和鱸魚樣品均采自寧德三都澳養(yǎng)殖漁排， 大菱鲆采自市售活體。 魚活體狀態(tài)下刮取體表黏液，加入10 倍量海水，搖勻，為體表黏液樣品。魚體尾靜脈采血，血樣置4 ℃過夜，6 000 r/min、4 ℃離心10 min， 取上清，為魚血清樣品。 其余組織勻漿液的制備如下： 解剖經(jīng)冰浴麻醉的活魚， 切取并稱量相應(yīng)組織樣品于玻璃勻漿器內(nèi)，向其中加入10 倍量的預(yù)冷海水，冰浴勻漿，勻漿液4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，吸取上清放置4 ℃冰箱備用。

1.3 趨化性測試方法 趨化性試驗參考鄒峰等[10]的研究方法。將進(jìn)行趨化試驗的載玻片放置于濕盒中，18 ℃，趨化過程持續(xù)30 min 后進(jìn)行蟲體計數(shù)。 計數(shù)方法為：在液滴中加入體積比為8%的Lugol's 碘液，在光學(xué)顯微鏡（10×10）下計數(shù)液滴范圍內(nèi)的蟲體。試驗重復(fù)5 次。對照組以過濾海水替換組織勻漿液。

1.4 趨化率計算及數(shù)據(jù)分析 趨化率（chemotaxis index，CI）=試驗組織勻漿液中蟲體數(shù)量/蟲體總數(shù)×100%。 試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)差異顯著性分析（成對雙樣本T 檢驗）處理，分別用P＞0.05、0.01＜P＜0.05 和P＜0.01 來表示差異不顯著、差異顯著和差異極顯著。 多重比較分析應(yīng)用SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

貪食邁阿密蟲對大菱鲆不同組織勻漿液的趨化作用不同，貪食邁阿密蟲對眼勻漿液的趨化率最高，對腦脊液的趨化性次之， 對表皮黏液及肌肉勻漿液（與空白海水對照相比）并無明顯的趨化現(xiàn)象。 t 檢驗分析結(jié)果顯示，貪食邁阿密蟲對大菱鲆的眼、腦脊液、腦、腎、鰓、肝的勻漿液表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化性（P＜0.01）；對表皮黏液及肌肉勻漿液并無明顯的趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。 見圖1。

圖1 貪食邁阿密蟲對大菱鲆不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對大黃魚的腦、 眼勻漿液和血清的趨化率高（P＜0.01），表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化作用；對體表黏液及鰓勻漿液的趨化率較低，但差異顯著（P＜0.05）；對肝、肌肉勻漿液的趨化率最低，趨化性差異不顯著（P＞0.05）。 見圖2。

圖2 貪食邁阿密蟲對大黃魚不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對與大黃魚同屬于石首魚科的黃姑魚不同組織勻漿液的趨化試驗結(jié)果見圖3。 貪食邁阿密蟲同樣表現(xiàn)出對黃姑魚腦脊液、腦、眼勻漿液的高趨化性（P＜0.01）；對黃姑魚的肝、腎勻漿液亦表現(xiàn)出較高的趨化率（P＜0.05）；但對肌肉、鰓、黏液勻漿液無明顯趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。

圖3 貪食邁阿密蟲對黃姑魚不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對鱸魚的眼、腦、腦脊液勻漿液表現(xiàn)出極高的趨化率差異（P＜0.01），蟲體表現(xiàn)出對上述組織勻漿液的強(qiáng)烈趨化性；對鱸魚的體表黏液、腎的勻漿液也表現(xiàn)出較高的趨化率（P＜0.01）；而對鱸魚的肌肉、鰓、肝勻漿液無明顯趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。見圖4。

圖4 貪食邁阿密蟲對鱸魚不同生物組織材料的趨化性

比較貪食邁阿密蟲對4 種養(yǎng)殖魚類組織勻漿的趨化性，貪食邁阿密蟲表現(xiàn)出對大菱鲆、大黃魚的組織勻漿趨化性相對高于黃姑魚、鱸魚，尤其是貪食邁阿密蟲對大菱鲆、大黃魚的眼和腦組織的趨化性上，其數(shù)據(jù)結(jié)果都顯著大于黃姑魚和鱸魚， 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行多重比較分析， 結(jié)果表現(xiàn)為極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

貪食邁阿密蟲對4 種養(yǎng)殖魚類： 大菱鲆、 大黃魚、黃姑魚、鱸魚的眼、腦勻漿液及腦脊液表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化效果，而對鰓、肝、黏液、肌肉、腎臟勻漿液的趨化率較低， 顯然貪食邁阿密蟲表現(xiàn)出對本試驗中多種魚類的神經(jīng)組織具有顯著的趨化偏好性，而對各種魚類的內(nèi)臟組織勻漿液的趨化偏好性不明顯。 在由貪食邁阿密蟲導(dǎo)致的大黃魚死亡病例中，可在眼及腦中分離到大量盾纖蟲的存在， 患魚也明顯表現(xiàn)出游泳的無方向性， 這也與患魚的神經(jīng)系統(tǒng)受到侵染有關(guān)。 而對斑馬鯊（Stegostoma fasciatum）[11]及豹鯊（Triakis semifasciata）[12]流行病學(xué)的研究中也證實，貪食邁阿密蟲可引起腦膜腦炎，對魚體的腦、鰓、肝進(jìn)行SSU rRNA 基因的PCR 反應(yīng)，顯示只有腦組織有陽性結(jié)果，從該基因擴(kuò)增出的DNA 序列與貪食邁阿密蟲的DNA 序列完全匹配，這與本試驗中貪食邁阿密蟲對神經(jīng)組織的趨化偏好性結(jié)果相吻合。 由于貪食邁阿密蟲侵染后期感染養(yǎng)殖魚類神經(jīng)系統(tǒng)，造成魚的游泳、攝食等重要生理活動失調(diào)。

在貪食邁阿密蟲對魚類侵染途徑的研究中，發(fā)現(xiàn)盾纖蟲不僅可以通過血液循環(huán)和結(jié)締組織傳播[13-14]，還可以通過神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊液循環(huán)傳播[15]。從本研究的趨化性試驗觀察中得知， 神經(jīng)組織勻漿液與肝、腎、肌肉的勻漿液相比具有更強(qiáng)的趨化誘導(dǎo)性， 從另一方面證實貪食邁阿密蟲對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染強(qiáng)于內(nèi)臟組織器官的感染， 從而導(dǎo)致感染魚類的快速死亡。

貪食邁阿密蟲對大黃魚的血清也具有較高的趨化率，亦可解釋破鱗片、皮膚受損的魚更易受到感染的原因。 從不同魚類組織勻漿對貪食邁阿密蟲的趨化誘導(dǎo)性比較來看， 推測貪食邁阿密蟲對宿主的侵染有一定的選擇性。