李福敏，邵 林，楊艷華，吳明江，趙海云，楊麗芬

(1.大理州食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南 大理 671000；2.昆明學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650214；3.云南警官學(xué)院，云南省刑事科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，毒品分析及禁毒技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223)

西紅花是一種藥食同源性、傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有活血化瘀，涼血解毒、解郁安神之功效，素有“植物黃金”之美譽(yù)[1-2].人工種植是其主要來源，為保證西紅花的質(zhì)量和產(chǎn)量，種植過程中難免的會(huì)出現(xiàn)農(nóng)藥濫用甚至農(nóng)藥殘留超標(biāo)的現(xiàn)象，成為西紅花走向世界的瓶頸.為了西紅花產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，建立西紅花中多農(nóng)藥殘留的快速分析方法顯得尤為重要.

現(xiàn)行《中國藥典》2015版通則2341[3]記載采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)藥材中74種農(nóng)藥殘留的方法，但檢測(cè)的絕大多數(shù)農(nóng)藥為有機(jī)氯類和擬除蟲菊酯類，并且分析時(shí)間較長，超過 40 min.有學(xué)者對(duì)近年藥材農(nóng)藥殘留情況普查發(fā)現(xiàn)：花類藥材農(nóng)藥殘留的檢出率較高、殘留情況較復(fù)雜、部分品種屬藥食同源類[4].目前，國內(nèi)外有關(guān)西紅花中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究鮮有報(bào)道.有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)以氣相色譜法(gas chromatography, GC)最為常見，但分析復(fù)雜樣品時(shí)易受雜質(zhì)和背景噪音的干擾.與GC相比，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometric, GC-MS/MS)具有抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)分析基質(zhì)復(fù)雜的樣品具有一定優(yōu)勢(shì).

本研究在《中國藥典》2015版通則2341方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化QuEChERS[5]前處理方法，利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液校準(zhǔn)，經(jīng)GC-MS/MS采取多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)分析，建立了一種快速、準(zhǔn)確、高效檢測(cè)西紅花中9種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備7693自動(dòng)進(jìn)樣器(美國Agilent公司)；QUINTIX-1CN電子天平(感量 0.1 mg，德國Sartorius公司)；VORTEX 2混勻器(德國IKA公司)；移液器(德國Brand公司)；PURELAB Chorusl Complete 超純水機(jī)(英國ELGA公司)；LT-ET氮吹儀(北京LabTech公司)；TGL 1650高速離心機(jī)(湖南滬康離心機(jī)有限公司)；SB-800DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司).

丙酮(色譜純，美國Fisher公司)；乙腈(HPLC，德國Merck公司)；冰乙酸與氯化鈉(優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無水硫酸鎂與醋酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二胺-N丙基硅烷(PSA)、石墨化碳(GCB)與十八烷基硅烷(C18)(美國Agilent公司).

馬拉硫磷、特丁硫磷、治螟磷、水胺硫磷、三唑磷和乙拌磷(質(zhì)量濃度均為 100 μg/mL，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)；喹硫磷、皮蠅硫磷和溴硫磷(質(zhì)量濃度均為 100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別移取 1.0 mL 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為 10 μg/mL 單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別取 1 mL，10 μg/mL 單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為 1 μg/mL 混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

西紅花基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)：取混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用西紅花空白樣液稀釋成2.0、4.0、6.0、40.0、60.0、100.0 μg/kg，體積為 1 mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液.

丙酮溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：除用丙酮稀釋外，其余操作同西紅花基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制.

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5 ms UI毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He(純度≥99.999%)、流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度 280 ℃；進(jìn)樣體積 1 μL；不分流進(jìn)樣；升溫程序：50 ℃(保持 1 min)，先以 30 ℃/min 升至 130 ℃，再以 5 ℃/min 升至 245 ℃(保持 2 min).EI離子源；電子能量 70 eV；離子源溫度 300 ℃；傳輸線溫度 280 ℃；溶劑延遲 8.0 min；監(jiān)測(cè)模式為MRM.

1.2.3 樣品前處理

將西紅花樣品粉碎成粉末，稱取 2 g(精確到 0.000 1 g)于 50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入 10 mL 含1% HAc的CH3CN溶液，渦旋混勻 30 s.離心管置于冰浴中，加入 1.0 g NaAc、4.0 g 無水MgSO4、0.5 g 無水NaCl及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋好管蓋，超聲提取 5 min 后，以 8 000 r/min 離心 5 min.向預(yù)先裝有 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB和 150 mg MgSO4的 5 mL 聚苯乙烯離心管中加入 1.0 mL 上清液，蓋好管蓋，振蕩 30 s，以 10 000 r/min 離心 5 min，上清液經(jīng)氮吹濃縮至近干后用丙酮定容至 1 mL，經(jīng) 0.22 μm 有機(jī)系濾頭過濾，待測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

正離子模式下，對(duì)混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液在m/z50～410的范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，獲得總離子流色譜圖，結(jié)合NIST標(biāo)準(zhǔn)庫檢索，確定各農(nóng)藥的保留時(shí)間與母離子.再使用子離子掃描方式得到子離子，選取豐度較高、干擾較小的2對(duì)特征離子(其中豐度較高的一對(duì)為定量離子，另一對(duì)為定性離子).在2～40 eV碰撞電壓范圍內(nèi)，利用儀器軟件“設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)助手”優(yōu)化離子對(duì)的碰撞能量，利用儀器軟件“分析實(shí)驗(yàn)助手”確定離子對(duì)的最佳碰撞能量，建立優(yōu)化的MRM方法.經(jīng)優(yōu)化MRM方法測(cè)得農(nóng)藥的保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)與碰撞能量結(jié)果見表1，混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(0.15 μg/mL)的MRM色譜圖見圖1.

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、碰撞能量、校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

續(xù)表1

圖1 西紅花基質(zhì)中9種有機(jī)磷農(nóng)藥混標(biāo)MRM色譜圖

2.2 提取溶劑優(yōu)化

對(duì)提取溶劑的種類進(jìn)行優(yōu)化，比較了正己烷、丙酮、乙腈和1%HAc-乙腈的提取效果.結(jié)果表明：正己烷易揮發(fā)且極性較弱，對(duì)極性較大農(nóng)藥的提取效果不佳；丙酮提取液中色素等雜質(zhì)含量較多，凈化效果差.與其它溶劑相比，乙腈用作提取劑可以更好地避免脂類、蛋白質(zhì)以及其它成分的干擾、回收率更高、重復(fù)性更好[6].基于此，乙腈成為傳統(tǒng)QuEChERS法的提取劑，但用純乙腈對(duì)堿敏感的農(nóng)藥提取時(shí)，回收率不令人滿意.使用1%HAc溶液適當(dāng)?shù)馗淖円译娴乃岫?，能將?duì)堿敏感農(nóng)藥的回收率提高至滿意的程度.因此，采用1%HAc-乙腈溶液作為提取液，同時(shí)用NaAc與HAc配成緩沖溶液以保持pH值為6～7[7].

2.3 超聲提取時(shí)間優(yōu)化

為除去樣品中的水分加入無水MgSO4，為增強(qiáng)鹽析作用加入NaCl.在西紅花樣品中加入1%HAc-乙腈溶液、NaCl及無水MgSO4后，考察不同的超聲提取時(shí)間(3、5、15、25、35 min)對(duì)提取效果的影響.結(jié)果表明：超聲提取時(shí)間對(duì)提取效果影響不明顯，為了提高效率，選擇超聲提取時(shí)間為 5 min.

2.4 吸附劑選擇

西紅花含有色素、糖類、脂肪酸和黃酮類等復(fù)雜成分，用單一吸附劑凈化效果不太明顯.

無水MgSO4能吸附溶液中殘留的水分同時(shí)降低乙腈萃取物的極性并使某些極性基質(zhì)共萃取物沉淀[8].在 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農(nóng)藥添加水平下，考察75、150、225、300 mg 無水MgSO4對(duì)農(nóng)藥回收率影響.結(jié)果表明：當(dāng)無水MgSO4用量大于 150 mg 時(shí)，回收率在70%～110%間的農(nóng)藥種類不再變化，綜合考慮添加 150 mg 無水MgSO4.

PSA是一種弱陰離子交換劑，能去除有機(jī)酸、糖類以及其它能形成氫鍵的成分[6,9].在 150 mg 無水MgSO4、25 mg C18、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農(nóng)藥添加水平下，考察50、100、150、200 mg PSA對(duì)農(nóng)藥回收率的影響.結(jié)果表明：當(dāng)PSA用量為 50 mg 時(shí)，所有農(nóng)藥的回收率均達(dá)到70%以上，隨PSA用量增加，水胺硫磷回收率下降.可能因?yàn)镻SA用量導(dǎo)致提取液呈堿性，水胺硫磷在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定分解.基于此，添加 50 mg PSA.

C18在去除油脂和非極性干擾物方面效果良好[10].在 150 mg 無水MgSO4、50 mg PSA、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農(nóng)藥添加水平下，考察25、50、75、100 mg C18對(duì)農(nóng)藥回收率的影響.結(jié)果表明：C18用量對(duì)回收率影響不明顯，為節(jié)約成本，添加 25 mg C18.

GCB能除去色素特別是葉綠素但需注意的是其能吸附具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥而導(dǎo)致回收率降低[11].在 150 mg 無水MgSO4、50 mg PSA、 25 mg C18與 40.0 μg/kg 農(nóng)藥添加水平下，考察15、25、35、45 mg GCB對(duì)農(nóng)藥回收率的影響.結(jié)果表明：隨GCB用量增加，提取液褪色更明顯，但皮蠅硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、喹硫磷與三唑磷的回收率降低明顯.綜合考慮回收率與提取液凈化效果，添加 25 mg GCB.

通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，選擇 50 mg PSA、25 mg GCB、25 mg C18與 150 mg MgSO4為吸附劑，可以獲得較好的凈化效果.

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

在優(yōu)化的氣相色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)西紅花基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定，以各農(nóng)藥濃度作為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果表明：在2.0～100.0 μg/kg 范圍內(nèi)，9種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.999 6.以信噪比S/N≥3確定檢出限(limit of detection, LOD)，9種農(nóng)藥的LOD為0.5～1.3 μg/kg，相同農(nóng)藥的LOD值低于《中國藥典》2015版通則2341第四法中的LOD值.以信噪比S/N≥10確定定量限(limit of quantification, LOQ)，LOQ為2.0～3.2 μg/kg，結(jié)果見表1.

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜分析中，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，會(huì)對(duì)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性造成影響[12].基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)強(qiáng)度(matrix effect, ME,%)=[(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率)-1]×100[13]，ME<-50%或者M(jìn)E>+50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；-20%

2.7 回收率與精密度

在2 g西紅花空白樣品中，添加水平為4.0、40.0、100.0 μg/kg 的農(nóng)藥混標(biāo)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每一添加水平測(cè)定6次，方法的準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率表示，方法的精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)表示.農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率分別為73.2%～81.1%、81.4%～84.4%和98.9%～103.9%，RSD分別為1.5%～6.1%、0.71%～4.0%和0.64%～1.8%，結(jié)果見表2.結(jié)果表明：該法的準(zhǔn)確度和精密度較好.

表2 西紅花基質(zhì)中9種有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6) %

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)從云南省大理市藥材市場購買的西紅花樣品15批應(yīng)用建立的方法進(jìn)行分析，在1批樣品中檢出特丁硫磷，含量為 35.2 μg/kg.

3 結(jié)語

本研究改進(jìn)了QuEChERS樣品前處理方法，以GC-MS/MS采取MRM模式分析，建立了西紅花中9種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法.與《中國藥典》2015版通則2341第四法相比，本方法優(yōu)勢(shì)明顯：1)方法的LOD值為0.5～1.3 μg/kg，相同農(nóng)藥的LOD值低于藥典方法，方法的LOQ值為2.0～3.2 μg/kg，能完全滿足西紅花限量分析的要求；2)試劑用量少，前處理效率高，節(jié)約成本.西紅花成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，為提高定量分析的準(zhǔn)確性，采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液校正.本研究建立的方法具有簡單、快捷、成本低、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于西紅花中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的檢測(cè).