嚴(yán)雅慧,李淑萍,熱依木古麗·阿布都拉,阿吉艾克拜爾·艾薩*
1中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;2中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所,烏魯木齊 830011
蘆薈為重要的可食用的藥材,是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物,性寒味苦,古方中記載其具有清肝熱、通便、散結(jié)、療癬等作用。蘆薈總共有500多個(gè)品種,其中庫拉索蘆薈(Aloevera(L.) Burm.f.)是最常用的藥用品種,其制品也廣泛應(yīng)用于食品(包含保健食品)、藥品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[1]。近年來,國內(nèi)外蘆薈的研究工作主要集中在品種的對(duì)比分析[2,3]、分離純化[4,5]、質(zhì)譜分析[6,7]、含量測(cè)定[8,9]和藥理作用[10,11]等方面。研究證明,蘆薈的主要活性成分為蒽酮類、蒽醌類和色酮類化合物,此外還有多糖類及糖苷、氨基酸、有機(jī)酸等化學(xué)成分[12,13],具有抑菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏等活性[14-16]。
目前,指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的有效手段。指紋圖譜主要關(guān)注藥材的整體性,建立共有模式,識(shí)別共有峰,能夠客觀、全面揭示藥材中可能的活性成分種類和數(shù)量;而化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)則強(qiáng)調(diào)的是藥材之間差異性,通過對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)信息的整合和校正,進(jìn)一步縮小藥材活性成分的范圍;兩者結(jié)合可實(shí)現(xiàn)藥材的整體描述到個(gè)體分析的過程,可更加準(zhǔn)確、客觀地反映中藥的質(zhì)量差異[17,18]。蘆薈藥材主要藥用成分以蘆薈苷、蘆薈大黃素等化合物為主[19],但功效成分及其含量隨藥材產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、土壤及采摘季節(jié)等因素而不同,給蘆薈藥材品質(zhì)及安全性的評(píng)價(jià)帶來了一定的困難。此外,《中國藥典》(2020版)[20]中蘆薈藥材的含量測(cè)定項(xiàng)目以蘆薈苷含量來制定,指標(biāo)成分單一,難以控制藥材質(zhì)量。因此,在生產(chǎn)和開發(fā)蘆薈藥材相關(guān)制劑之前,對(duì)蘆薈藥材進(jìn)行指紋圖譜和結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別研究是必不可少的。
本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立12批次不同產(chǎn)地的蘆薈藥材的指紋圖譜,并結(jié)合相似度分析、聚類分析、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)研究其化學(xué)組分特征,篩選出能影響藥材質(zhì)量差異的標(biāo)志物,并用相同的方法測(cè)定12批蘆薈藥材中6個(gè)標(biāo)志物(蘆薈新苷D、蘆薈苷A、蘆薈苷B、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苦素和蘆薈大黃素)的含量,旨在從生產(chǎn)源頭確保藥材品質(zhì),為蘆薈藥材質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)完善提供科學(xué)依據(jù)。
美國Water 2695液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器,DAD紫外檢測(cè)器;Empower色譜工作站,四元梯度泵,在線過濾器,柱溫箱);BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);SK7210 HP型超聲波(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。
對(duì)照品:蘆薈苦素(批號(hào):19011601)、蘆薈新苷D(批號(hào):19091701)、蘆薈苷B(批號(hào):19030501)、蘆薈苷A(批號(hào):19030204)、蘆薈大黃素(批號(hào):19010803)、7-O-甲基蘆薈新甙A(批號(hào):19101301)均采購于上海純優(yōu)生物科技有限公司,以上對(duì)照品純度均 ≥ 97.5%。
甲醇和乙腈均為色譜純(Merck公司,Darmstadt,德國);磷酸和甲醇為分析純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);其他所有試劑均為分析純。
12批蘆薈藥材來源于廣東、廣西、海南和四川4個(gè)省份,其中S1、S2、S7來源于四川省,S10~S12來源于廣西省,S3~S5來源于廣東省,S6、S8、S9來源于海南省。經(jīng)中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所劉戈宇研究員鑒定為庫拉索蘆薈Aloevera(L.) Burm.f.的濃縮物。
2.1.1 樣品制備
參照中國藥典方法[25]略微改動(dòng),取蘆薈藥材粉末(過5號(hào)篩)50 mg,精密稱定,精密加入50%甲醇75 mL,稱定重量,超聲處理(40 kH,700 W,25 ℃)20 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇水補(bǔ)足減失的重量,搖勻,分析前過0.45 μm微孔濾膜,備用。
2.1.2 對(duì)照品溶液制備
精密稱取各對(duì)照品適量,精密稱定,置于棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成對(duì)照溶液:蘆薈苦素(316 μg/mL)、蘆薈新苷D(524 μg/mL)、7-O-甲基蘆薈新甙A(228 μg/mL)、蘆薈苷B(508 μg/mL)、蘆薈苷A(506 μg/mL)、蘆薈大黃素(436 μg/mL),精密量取各對(duì)照溶液按一定比例混合配制成不同濃度的6份混合對(duì)照溶液,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜備用,-20 ℃避光保存。
2.1.3 色譜條件
HPLC色譜柱:Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Phenomenex Inc.,CA,USA),流動(dòng)相溶劑A:0.3%(V/V)磷酸水溶液,B:乙腈,C:甲醇,流速是1 mL/min,進(jìn)樣10 μL,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,最佳梯度洗脫如下:0~8 min,88%A+10%B+2%C;8~10 min,74%A+10%B+16%C;10~45 min,58%A+10%B+32%C;45~80 min,55% A+10%B+35%C。
2.2.1 精密度
取編號(hào)S1的樣品,按“2.1.1”項(xiàng)下處理,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄液相色譜圖。以15號(hào)色譜峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.19%,相對(duì)峰面積的RSD<0.89%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.2.2 穩(wěn)定性
取編號(hào)S1的樣品,按“2.1.1”項(xiàng)下處理,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進(jìn)樣,記錄液相色譜圖。以15號(hào)色譜峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.87%,相對(duì)峰面積的RSD<2.67%(n=8),表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.3 重復(fù)性
取編號(hào)S1的樣品,精密稱取6份,按“2.1.1”項(xiàng)下處理,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄液相色譜圖。以15號(hào)色譜峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.42%,相對(duì)峰面積的RSD<2.66%(n=6),表明方法重現(xiàn)性良好。
12批蘆薈藥材按“2.1.1”方法制備,再按“2.1.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄液相色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 A版)》,以S1為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法、時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min建立對(duì)照?qǐng)D譜,用多點(diǎn)校正Mark峰匹配,建立12批蘆薈藥材樣品的指紋圖譜。疊加指紋圖譜、參照?qǐng)D以及共有峰標(biāo)記均見圖1。
圖1 12批蘆薈藥材的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 12 batches of aloe
圖2 蘆薈樣品(a)和混合對(duì)照品溶液(b)HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample (a) of aloe and mixed reference substances (b)注:1:蘆薈苦素;2:蘆薈新苷D;3:7-O-甲基蘆薈新甙A;4:蘆薈苷B;5:蘆薈苷A;6:蘆薈大黃素。Note:1:Aloesin;2:Aloeresin D;3:7-O-Methylaloeresin A;4:Aloin B;5:Aloin A;6:Aloe-emodin.
2.3.1 共有峰的指認(rèn)
從12批蘆薈藥材中標(biāo)定了23個(gè)共有峰,通過與對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)出6個(gè)成分,分別是3號(hào)峰為蘆薈苦素、12號(hào)峰為蘆薈新苷D、13號(hào)峰為7-O-甲基蘆薈新甙A、14號(hào)峰為蘆薈苷B、15號(hào)峰為蘆薈苷A、23號(hào)峰為蘆薈大黃素。蘆薈樣品和混合對(duì)照品的HPLC圖譜見圖2。結(jié)果表明12批蘆薈藥材中23個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0%~0.55%,相對(duì)峰面積RSD為16.54%~97.02%,表明方法穩(wěn)定,但不同產(chǎn)地的蘆薈藥材中成分含量差異較大。
2.3.2 相似度分析
采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 A版)》軟件建立12批蘆薈藥材共有模式的指紋圖譜,其相似度評(píng)價(jià)見表1。除產(chǎn)地是廣西的S10~S12樣品相似度小于0.5外,其余樣品的相似度均>0.93。
表1 12批蘆薈藥材指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)表
圖3 12批蘆薈藥材的聚類分析樹狀圖 Fig.3 Hierarchical cluster analysis plot for 12 batches of aloe
2.4.1 聚類分析
以12批蘆薈藥材中23個(gè)共有峰的峰面積為變量,運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,以組間聯(lián)接平方歐式距離測(cè)度的方式進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖3。由圖3可知,12批蘆薈藥材樣品明顯聚為三類,S1、S2、S7聚為第一類,S10~S12聚為第二類,S3~S6、S8、S9聚為第三類。
2.4.2 主成分分析(PCA)
采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)12批蘆薈藥材中23個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值即方差貢獻(xiàn)率,以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),得到了前4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為87.593%,能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息。從成分載荷矩陣表可以看出,第一主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為39.529%,主要反映色譜峰7~9、11~15、17、18、22的信息;第二主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為26.749%,主要反映色譜峰1、2、4、6、10、16、19、21、23的信息;第三主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為14.833%,主要反映色譜峰3、20的信息;第四主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為6.482%,主要反映色譜峰 5的信息。利用SIMCA 14.1分析軟件繪制主成分得分圖,見圖4。結(jié)果表明12批蘆薈藥材大致可被分為三類,S1、S2、S7在主成分得分圖的中間分為第一類;S10~S12在主成分得分圖的左側(cè)分為第二類,S3~S6、S8、S9在主成分得分圖的右側(cè)分為第三類,其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致,也驗(yàn)證了聚類分析的分類結(jié)果。
圖4 主成分分析得分圖Fig.4 Score scatter plot of PCA
2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)
正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)是常用來處理分類和判別問題的一種非常有效的監(jiān)督分析方法。而OPLS-DA模型的擬合效果評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是累積解釋能力參數(shù)(R2X、R2Y)和預(yù)測(cè)能力參數(shù)(Q2),如果R2X、R2Y和Q2均大于0.5,且數(shù)值越接近于1,則表示模型擬合效果越好[17]。采用SMICA 14.1軟件對(duì)12批蘆薈藥材共有峰進(jìn)行OPLS-DA分析,擬合的模型R2X=0.929,R2Y=0.939,Q2=0.835,均大于0.8,表示擬合的預(yù)測(cè)模型穩(wěn)定、可靠,可用來評(píng)價(jià)蘆薈藥材指紋圖譜的模式識(shí)別方法,其得分散點(diǎn)圖見圖5。由圖5可知,廣西和四川產(chǎn)區(qū)的樣品各自聚為一類;廣東和海南產(chǎn)區(qū)的樣品聚為一類,說明這兩個(gè)產(chǎn)區(qū)藥材的化學(xué)成分相似性很高。以變量投影重要性(VIP)值大于1為依據(jù),篩選對(duì)分組結(jié)果產(chǎn)生較大影響的色譜峰,結(jié)果見圖6。由圖6可知,VIP值大于1的色譜峰從大到小分別為12號(hào)峰(蘆薈新苷D,VIP值為2.982 3)、15號(hào)峰(蘆薈苷A,VIP值為1.971 5)、13號(hào)峰(7-O-甲基蘆薈新甙A,VIP值為1.691 5)、14號(hào)峰(蘆薈苷B,VIP值為1.540 1)、3號(hào)峰(蘆薈苦素,VIP值為1.523 5),表明這5個(gè)化合物是影響蘆薈藥材質(zhì)量差異的標(biāo)志物。
圖5 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.5 Score scatter plot of OPLS-DA
圖6 12批蘆薈藥材OPLS-DA模型中共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in OPLS-DA model of 12 batches of aloe
2.5.1 色譜條件、樣品溶液制備和混合對(duì)照品溶液制備
同“2.1”一致,樣品和混合對(duì)照品見圖2。
2.5.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限
分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下6個(gè)對(duì)照品貯備液適量,混合,加甲醇定容、稀釋,制成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見表2。分別精密吸取對(duì)照品溶液適量,加甲醇稀釋,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以信噪比10∶1、3∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果表明,蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷 B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線在其各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999 5,檢測(cè)限范圍在0.017 4~0.314 0 μg/mL,定量限范圍在0.034 9~0.559 0 μg/mL,結(jié)果見表2。
2.5.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率
精密度試驗(yàn):取樣品(S1),按“2.1.1”方法制備樣品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.69%、0.75%、0.64%、1.22%、0.99%、1.13%(n=6),表明儀器精密度良好。
表2 6個(gè)指標(biāo)成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限
穩(wěn)定性試驗(yàn):取樣品(S1),按“2.1.1”方法制備樣品溶液,置于室溫儲(chǔ)存,按“2.1.3”色譜條件,分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果顯示,蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為1.92%、2.59%、2.73%、2.93%、2.46%、2.15%(n=8),表明蘆薈樣品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
重復(fù)性試驗(yàn):取樣品(S1),精密稱取6份,按“2.1.1”方法制備樣品溶液,按“2.1.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示,蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素平均含量分別為8.42、167.28、18.62、109.60、191.91、24.02 mg/g,含量的RSD分別為0.88%、0.72%、2.13%、1.30%、1.48%、1.95%(n=6),表明方法重現(xiàn)性良好。
加樣回收率試驗(yàn):取樣品(S1)藥材粉末(過5號(hào)篩)25 mg,按照樣品中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含有量與混合對(duì)照品比例1∶1精密加入,后續(xù)處理同“2.1.1”項(xiàng)。按“2.1.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率。蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的平均加樣回收率分別為99.00%、91.45%、97.93%、94.70%、96.41%、95.34%,其RSD值分別為1.16%、0.86%、0.98%、1.13%、1.22%、1.94%(n=6)品的回收率良好,結(jié)果見表3。
表3 加樣回收率結(jié)果(n=6)
續(xù)表3
2.5.4 樣品含量測(cè)定
采用“2.1.3”項(xiàng)下的色譜方法,測(cè)定了12批蘆薈藥材中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含量,每個(gè)樣品做3個(gè)平行,結(jié)果見表4。
由表4可知,廣東、海南和四川產(chǎn)區(qū)的6個(gè)指標(biāo)成分總含量達(dá)到519.87~688.87 mg/g以上,而廣西產(chǎn)區(qū)僅達(dá)到371.31~442.73 mg/g。12批藥材中6個(gè)指標(biāo)成分含量對(duì)比,蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A的相對(duì)含量差異較大,分別為0.55~13.47、7.98~369.88、1.36~25.44 mg/g;蘆薈苷B、A和蘆薈大黃素的含量差異相對(duì)較小,含量分別為65.14~150.08、109.51~263.16、18.30~40.32 mg/g。其中廣西產(chǎn)區(qū)的樣品,蘆薈新苷D的平均含量(9.70 mg/g)遠(yuǎn)低于廣東產(chǎn)區(qū)(293.97 mg/g)、海南產(chǎn)區(qū)(293.57 mg/g)和四川產(chǎn)區(qū)(257.81 mg/g)的平均值,但蘆薈苷B(142.58 mg/g)和A(237.08 mg/g)的平均含量均高于廣東產(chǎn)區(qū)(110.21、195.79 mg/g)、海南產(chǎn)區(qū)(102.80、179.87 mg/g)和四川產(chǎn)區(qū)(97.17、170.48mg/g)的平均值。
本研究比較了熱回流法和超聲法對(duì)特征色譜峰提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲處理提取效率高、時(shí)間短、損失少,易操作。同時(shí)分別考察了提取溶劑(甲醇、乙醇)及濃度、提取時(shí)間和液料比對(duì)蘆薈藥材中6個(gè)指標(biāo)成分提取率的影響,結(jié)果顯示,50%甲醇水溶液75 mL超聲提取20 min為最佳??疾炝艘译?甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水等流動(dòng)相體系。結(jié)果表明,當(dāng)以甲醇-乙腈-0.3%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),各指標(biāo)成分峰型對(duì)稱、分離度較好,運(yùn)行時(shí)間短,效果最佳。比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)(254、280、310、330、360 nm)下各色譜峰的峰形和分離度,結(jié)果顯示,254 nm處6個(gè)指標(biāo)成分吸收強(qiáng)度高,基線平穩(wěn)、分離度良好,故選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
表4 12批蘆薈樣品6個(gè)指標(biāo)成分的含量
12批蘆薈藥材的指紋圖譜共識(shí)別23個(gè)共有峰,從相似度結(jié)果可知,除廣西產(chǎn)區(qū)的相似度低于0.5外,其他均大于0.93,說明市售的蘆薈藥材因產(chǎn)地不同,其化學(xué)成分種類和含量有很大差異。從聚類分析結(jié)果可知,12批蘆薈藥材聚為3類,與主成分分析結(jié)果一致。利用正交偏最小二乘判別法篩選出影響蘆薈藥材質(zhì)量差異的5個(gè)色譜峰,并以相同HPLC法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。因蘆薈大黃素也是蘆薈藥材中主要的生物活性化合物之一[21],固也列入含量測(cè)定的指標(biāo)性成分,其分析結(jié)果可知6個(gè)指標(biāo)成分含量存在較大差異。這種差異可能是由于地理環(huán)境、氣候條件、采收期、土壤及田間管理、種植模式等諸多因素,對(duì)藥材次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致藥材相似度以及含量的差異性[22];其次蘆薈藥材是以濃縮物的性狀呈現(xiàn),其濃縮方式、烘干工藝、取材部位等也會(huì)使藥材的化學(xué)成分有很大差異。
本研究采用定量指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式多元判別方法對(duì)不同產(chǎn)地的蘆薈藥材成分差異進(jìn)行分析,并對(duì)6個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行了含量測(cè)定,可直觀評(píng)價(jià)各產(chǎn)地蘆薈藥材品質(zhì)的一致性,還同時(shí)體現(xiàn)化學(xué)成分的差異性,為蘆薈藥材的質(zhì)量控制和后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)參考。