譚亞婷，左安建，何彥儀，羅雨薇，胡世俊，閆曉慧*

1西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224

飛機(jī)草(ChromolaenaodorataL.)又名香澤蘭，是一種多年生草本，屬于菊科(Compositae)澤蘭屬(Eupatorium)[1]。原產(chǎn)地為中、南美洲，現(xiàn)分布地區(qū)有非洲、大洋洲、亞洲和西太平洋群島大部分熱帶及亞熱帶地區(qū)[2]。通過有性生殖與無性生殖方式進(jìn)行繁殖，其瘦果能借助冠毛隨風(fēng)長距離傳播[3]?？煞置诨形镔|(zhì)來抑制其周圍其他植物的生長，對(duì)生物多樣性造成極大的破壞[4]。因此，飛機(jī)草被列為世界各國重要檢疫性雜草之一[5]，飛機(jī)草主要化學(xué)成分有黃酮、萜類、生物堿等物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等生物活性[6-8]。在我國民間作為一種全草入藥且多外用的中草藥，其性溫，味道微酸，可用于跌打腫痛、瘡瘍腫毒、皮炎和外傷止血，還具有驅(qū)蟲、殺蟲的作用[9]。

核桃(JuglansregiaL.)的種植在云南省脫貧攻堅(jiān)和美麗鄉(xiāng)村建設(shè)中發(fā)揮巨大的作用[10]，但近年來云南核桃種植地區(qū)的病害流行嚴(yán)重影響核桃的品質(zhì)和產(chǎn)量，給種植戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[11,12]，傳統(tǒng)化學(xué)防治存在環(huán)境污染、人畜安全、農(nóng)藥殘留等安全隱患。隨著“綠色食品”概念的加強(qiáng)[13]，人們意識(shí)到對(duì)食品安全與人類健康息息相關(guān)[14]，不斷從植物中尋找具有生物活性的抗菌物質(zhì)，開發(fā)對(duì)作物安全、高效、低毒、低殘留，對(duì)人體安全的新型植物源農(nóng)藥[15]。因此，有效利用入侵植物的資源優(yōu)勢(shì)也是控制其危害的方法之一[16]。本研究以入侵植物飛機(jī)草地上部分為材料，分離并鑒定化合物10個(gè)，其中,化合物2和8均首次從飛機(jī)草中獲得，抑菌活性成分集中于乙酸乙酯萃取物柱層析餾分2中，因此，進(jìn)一步對(duì)該部分分離得到的化合物進(jìn)行抑菌活性研究。為利用入侵植物飛機(jī)草，使其變廢為寶，達(dá)到減少環(huán)境破壞的目的，具有一定的社會(huì)、生態(tài)及經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)為核桃真菌病害的綠色防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：DFY-C快速開蓋萬能高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；LT502電子天平(常熟市大量儀器有限責(zé)任公司)；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；DL-1萬用電爐(天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)；正相色譜硅膠(青島海洋化工廠)；MCI小孔樹脂、40～70 μm葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司)；反相色譜硅膠(德國默克公司)；ZF-6三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；Bruker DRX-500核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；WPL-230BE恒溫電熱培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；無菌超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰工廠)；自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)。

試劑：工業(yè)純硫酸、分析純乙醇(云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司)；工業(yè)純乙醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、丙酮經(jīng)重蒸后使用(昆明鍇泰納工貿(mào)有限公司)；氘代氯仿、氘代丙酮、氘代甲醇(美國Cam- bridge Isotope Laboratories 公司)；水為實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水。

1.2 材料與菌種

飛機(jī)草地上部分于2011年8月采自云南紅河，由西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定為ChromolaenaodorataL.，植物標(biāo)本存放于西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。植物材料3.7 kg風(fēng)干粉碎，按料液比1∶3加入95%乙醇，加熱回流提取4 h，共5次，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收溶劑，得提取物520 g，4 ℃下冷藏用于后期研究。

供試菌種為葉點(diǎn)霉(Phyllostictasp.)、炭疽菌(Colletotrichumsp.)、殼二孢(Ascochytasp.)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissp.)，由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳玉惠教授提供，病原菌系從云南臨滄、大理、楚雄、曲靖、保山和昭通等縣(市)核桃主栽地區(qū)的398份感病核桃病葉和果實(shí)分離得到，用PDA培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 分離與鑒定

蒸餾水溶解粗提物，依次用等量石油醚、乙酸乙酯萃取三次，過濾，減壓濃縮得石油醚浸膏(114.38 g)、乙酸乙酯浸膏(145.78 g)，水萃取浸膏(167.32 g)。乙酸乙酯浸膏以石油醚/丙酮系統(tǒng)硅膠柱層析，濕法裝柱，干法上樣，依次用10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1梯度洗脫，濃縮得Fr.1(9.78 g)、Fr.2(8.69 g)、Fr.3(5.86 g)、Fr.4(7.56 g)、Fr.5(6.97 g)、Fr.6(10.62 g)。Fr.1經(jīng)MCI色譜柱甲醇-水(10%→95%)分離，60%～70%部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(丙酮)純化得無色透明塊狀結(jié)晶、白色粉末，為化合物1(683 mg)、2(592 mg)，剩余部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得白色粉末，為化合物3(168 mg)。Fr.2經(jīng)MCI色譜柱甲醇-水(25%→100%)分離，其中25%-55%部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(甲醇)純化得白色粉末，為化合物4(98 mg)；70%部分經(jīng)重結(jié)晶析出白色針狀結(jié)晶，為化合物5(76 mg)，采用硅膠柱色譜分離70%部分，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，洗脫梯度為30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1，5∶1部分經(jīng)重結(jié)晶析出白色片狀結(jié)晶，為化合物6(42 mg)；70%～90%部分采用葡萄糖凝膠色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得到白色片狀結(jié)晶，為化合物7(56 mg)。Fr.4經(jīng)MCI色譜柱甲醇-水(20%→100%)分離，采用硅膠柱色譜分離60%部分，石油醚/氯仿/甲醇作為洗脫劑，洗脫梯度為62.5∶62.5∶1、30∶30∶1、15∶15∶1、8∶8∶1、4∶4∶1、2∶2∶1，62.5∶62.5∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(甲醇)淋洗后經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚/乙酸乙酯作洗脫劑，洗脫梯度為10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1，5∶1部分經(jīng)重結(jié)晶析出黃色顆粒結(jié)晶，化合物8(426 mg)；30∶30∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(甲醇)純化得到無色透明結(jié)晶，為化合物9(354 mg)；15∶15∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得到黃色粉末，為化合物10(656 mg)。

采用1H NMR、13C NMR、MS等光譜學(xué)方法，各化合物在TLC中比移值以及表現(xiàn)出的物理化學(xué)特征等對(duì)所得單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并參照文獻(xiàn)，確定以上化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4 飛機(jī)草粗提物抑菌活性檢測(cè)

分別稱取0.50 g供試植物乙醇提取物、不同萃取物、乙酸乙酯柱層析餾分溶解于分析DMSO溶液中，超聲輔助溶解制成100 mg/mL的粗提物母液。采用菌絲生長速率法對(duì)供試核桃病原真菌的抑制率進(jìn)行測(cè)定。在無菌操作條件下，于50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基中加入飛機(jī)草粗提物母液，稀釋為1 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)以含等體積的DMSO溶劑的培養(yǎng)基的作為對(duì)照，含50 μg/mL苯醚甲環(huán)唑-DMSO溶液的培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照，用直徑為4 mm打孔器在菌落邊緣生長一致的部分打取菌餅，將菌餅(有菌絲的面朝下)轉(zhuǎn)接于含藥平板中央，每個(gè)處理共5個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。采用十字交叉法每2天對(duì)各處理菌落生長直徑進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照菌落長滿至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)結(jié)束測(cè)定，根據(jù)下列公式計(jì)算抑菌率：

對(duì)照純生長量(mm)=

對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑

(1)

處理純生長量(mm)=組菌落直徑-菌餅直徑

(2)

(3)

1.5 飛機(jī)草化學(xué)成分毒力測(cè)定

分別稱取3種化合物0.10 g，加入分析純DMSO溶液，超聲輔助溶解制成10 mg/mL的化合物母液。采用梯度法稀釋法分別在150 mL的PDA培養(yǎng)基中于50～60 ℃時(shí)加入0.75、1.50、2.25、3.00 mL化合物母液，稀釋成濃度為50、100、150、200 μg/mL的4個(gè)濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，以加入等梯度的等體積DMSO為對(duì)照，每個(gè)處理共5個(gè)重復(fù)，接種與培養(yǎng)方式同“1.4”。參照陳麗華室內(nèi)離體抑菌活性測(cè)定方法[17]，以藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x)，抑菌活性概率值為縱坐標(biāo)(y)，采用數(shù)據(jù)軟件繪制毒力曲線，求得毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算EC50，對(duì)不同植物粗提物的毒力大小進(jìn)行比較。

1.6 數(shù)據(jù)處理

以上數(shù)據(jù)均采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件(One-way ANOVA，Duncan post hoc test，P<0.05)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色透明塊狀結(jié)晶；ESI-MS:m/z345 [M+H]+得出化合物分子量為344，可判定該化合物分子式為C19H20O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.38(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.94 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.33(1H，d，H-8)，5.34(1H，dd，J=2.8，13.4 Hz，H-2)，3.94，3.86，3.83，3.82(各3H，s，4×OCH3)，3.02(1H，dd，J=13.4，16.7 Hz，H-3α)，2.75(1H，dd，J=2.9，16.7 Hz，H-3β)L13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.2(C-2)，45.4(C-3)，189.6(C-4)，154.3(C-5)，137.5(C-6)，159.5(C-7)，96.4(C-8)，160.0(C-9)，109.2(C-10)，130.7(C-1′)，127.7(C-2′，6′)，114.3(C-3′，5′)，159.8(C-4′)，61.7，61.4，56.1，55.4(4×OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的已知化合物一致，因此鑒定為5，6，7，4′-四甲氧基黃烷酮。

化合物2白色無定形粉末；ESI-MS:m/z317 [M+H]+得出化合物分子量為316，可判定該化合物分子式為C17H16O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.02(1H，s，5-OH)，7.04(H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.93(2H，d，J=2.1，8.3 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)，6.06(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.04(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，5.32(1H，dd，J=3.0，13.0 Hz，H-2)，3.91(3H，s，OCH3)，3.80(3H，s，OCH3)，3.07(1H，dd，J=13.0，17.2 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=3.1，17.2 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，43.2(C-3)，196.0(C-4)，164.1(C-5)，95.1(C-6)，168.0(C-7)，94.3(C-8)，162.9(C-9)，103.2(C-10)，131.5(C-1′)，112.7(C-2′)，145.9(C-3′)，145.0(C-4′)，110.7(C-5′)，118.2(C-6′)，56.1，55.7(2×OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的已知化合物一致，圣草素-7，4′-二甲醚。

化合物3白色粉末；ESI-MS:m/z317 [M+H]+得出化合物分子量為316，可判定該化合物分子式為C17H16O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.19(1H，s，5-OH)，7.37(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，H-6′)，6.95(2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，H-5′)，6.11(1H，s，H-8)，5.34(1H，dd，J=2.9，13.1 Hz，H-2)，3.94(3H，s，6-OCH3)，3.83(3H,s ，4′-OCH3)，3.09(1H，dd，J=13.1，17.2 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=3.0，17.2 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.1(C-2)，43.2(C-3)，196.9(C-4)，154.4(C-5)，128.3(C-6)，157.5(C-7)，94.6(C-8)，158.7(C-9)，103.1(C-10)，130.2(C-1′))，127.7(C-2′，6′)，114.2(C-3′，5′)，160.1(C-4′)，61.0(6-OCH3)，55.4(4′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的已知化合物一致，判定該化合物為5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基二氫黃酮。

化合物4白色絮狀粉末；ESI-MS:m/z303 [M+H]+得出化合物分子量為302，可判定該化合物分子式為C16H14O6。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.51(2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，H-6′)，6.99(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，H-5′)，5.99(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，5.95(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，5.12(1H，d，J=11.3，H-2)，4.68(1H，d，J=11.6，H-3)，3.83(3H，s，4′-OCH3);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：84.1(C-2)，73.1(C-3)，198.2(C-4)，165.0(C-5)，97.1(C-6)，167.7(C-7)，96.0(C-8)，164.1(C-9)，101.5(C-10)，130.2(C-2′，6′)，114.4(C-3′，5′)，55.6(4′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]的已知化合物一致，判定該化合物為二氫山柰素。

化合物5白色針狀結(jié)晶；ESI-MS:m/z287 [M+H]+得出化合物分子量為286，可判定該化合物分子式為C16H14O5。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.37(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，H-6′)，6.95(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，H-5′)，5.97(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.99(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.37(1H，dd，J=3.0，13.1 Hz，H-2)，3.10(1H，dd，J=13.1，17.2 Hz，H-3α)，2.79(1H，dd，J=3.0，17.0 Hz，H-3β)，3.83(3H，s，4′-OCH3)，12.05(1H，s，5-OH);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，43.1(C-3)，196.1(C-4)，164.4(C-5)，96.7(C-6)，164.3(C-7)，95.4(C-8)，164.4(C-9)，103.3(C-10)，130.3(C-1′)，127.8(C-2′，6′)，114.3(C-3′，-5′)，160.1(C-4′)，55.4(4′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[22]的已知化合物一致，因此鑒定為異野櫻素。

化合物6白色片狀結(jié)晶，ESI-MS:m/z331 [M+H]+得出化合物分子量為330，可判定該化合物分子式為C18H18O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.33(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.87(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.34(1H，s，H-8)，5.33(1H，dd，J=2.8，13.4 Hz，H-2)，3.94，3.86，3.82(各3H，s，3×OCH3)，3.02(1H，dd，J=13.4，16.7 Hz，H-3α)，2.76(1H，dd，J=2.9，16.7 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.2(C-2)，45.3(C-3)，189.8(C-4)，154.3(C-5)，137.5(C-6)，158.6(C-7)，96.4(C-8)，159.9(C-9)，109.1(C-10)，130.7(C-1′)，128.0(C-2′，6′)，115.7(C-3′，5′)，156.2(C-4′)，61.7，61.4，56.2(3×OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的已知化合物一致，因此鑒定為4′-羥基-5，6，7-三甲氧基黃烷酮。

化合物7白色片狀結(jié)晶；ESI-MS:m/z37 ([M+H]+得出化合物分子量為374，可判定該化合物分子式為C20H22O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.25(2H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.94(2H，dd，J=2.2，8.8 Hz，H-6′)，6.90(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，5.34(1H，dd，J=2.7，13.4 Hz，H-2)，3.04(1H，dd，J=13.5，16.7 Hz，H-3α)，2.77(1H，dd，J=2.8，16.7 Hz，H-3β)，3.87，3.82，3.94，3.92，3.90(各3H，s，5×OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.5(C-2)，45.5(C-3)，189.3(C-4)，154.3(C-5)，137.6(C-6)，159.8(C-7)，96.4(C-8)，159.5(C-9)，109.2(C-10)，131.1(C-1′)，109.4(C-2′)，149.3(C-3′)，149.5(C-4′)，111.2(C-5′)，118.9(C-6′)，61.7，61.4，56.2，56.0，56.0(5×OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]的已知化合物一致，判定該化合物為5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃烷酮。

化合物8黃色顆粒結(jié)晶；ESI-MS:m/z359 [M+H]+得出化合物分子量為358，可判定該化合物分子式為C19H18O7。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.48(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，7.39(1H，s，H-2′)，7.06(1H，s，H-6)，7.05(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.56(1H，s，H-3)，3.93，3.91，3.85，3.84(各3H，s，4×OCH3);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：164.0(C-2)，106.9(C-3)，179.6(C-4)，153.3(C-5)，97.9(C-6)，160.0(C-7)，141.8(C-8)，156.1(C-9)，112.6(C-10)，124.9(C-1′)，113.0(C-2′)，148.8(C-3′)，152.4(C-4′)，113.8(C-5′)，119.7(C-6′)，62.6，61.8，57.0，56.5(4×OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的已知化合物一致，判定該化合物為3′-羥基-5，7，8，4′-四甲氧基黃烷酮。

化合物9無色透明針狀結(jié)晶；ESI-MS:m/z301 [M+H]+得出化合物分子量為300，可判定該化合物分子式為C16H12O6。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.56(1H，dd，J=2.3，8.5 Hz，H-2′)，7.49(1H，d，J=2.3 Hz，H-6′)，7.13(1H，d，J=8.6 Hz，H-3′)，6.64(1H，s，H-3)，6.55(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.25(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.94(3H，s，4′-OCH3)，2.86(1H，s，5-OH);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：163.3(C-2)，104.6(C-3)，183.0(C-4)，99.7(C-6)，164.9(C-7)，94.7(C-8)，158.8(C-9)，104.6(C-10)，124.8(C-1′)，119.7(C-2′)，112.4(C-3′)，151.7(C-4′)，147.8(C-5′)，113.6(C-6′)，56.4(4′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的已知化合物一致，判定該化合物為香葉木素。

化合物10黃色粉末；ESI-MS:m/z285 [M-H]-得出化合物分子量為286，可判定該化合物分子式為C15H10O6。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.07(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.1 Hz，H-6);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.0(C-2)，137.1(C-3)，177.4(C-4)，158.3(C-5)，99.3(C-6)，165.6(C-7)，94.4(C-8)，162.5(C-9)，104.5(C-10)，123.7(C-1′)，130.7(C-2′，6′)，116.3(C-3′，5′)，160.6(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的已知化合物一致，判定該化合物為山柰酚。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of the compounds 1-10

2.2 飛機(jī)草粗提物抑菌活性篩選

采用生長速率法測(cè)定了飛機(jī)草不同粗提物對(duì)四株核桃病原菌葉點(diǎn)霉、炭疽菌、殼二孢和擬莖點(diǎn)霉的抑菌活性，結(jié)果見表1。飛機(jī)草乙醇提取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉均表現(xiàn)出一定的抑菌活性抑菌率在45.45%～60.05%，其中,乙酸乙酯萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉的抑菌作用最強(qiáng)，而水萃取物對(duì)葉點(diǎn)霉無抑菌活性。飛機(jī)草各提取物對(duì)炭疽菌和擬莖點(diǎn)霉的抑菌活性均較弱，抑菌率在6.74%～26.97%之間，其中水萃取物對(duì)擬莖點(diǎn)霉無抑菌活性。飛機(jī)草不同提取物對(duì)殼二孢均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率均在50%以上，其中，乙酸乙酯萃取物對(duì)殼二孢的抑菌率高達(dá)79.06%。上述結(jié)果表明，飛機(jī)草對(duì)供試四株核桃病原菌的，抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中。因此，我們進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取物的抑菌成分進(jìn)行了研究。

2.3 飛機(jī)草乙酸乙酯萃取物不同餾分的抑菌篩選

采用硅膠柱層析對(duì)飛機(jī)草乙酸乙酯萃取物進(jìn)行了成分分離，獲得6個(gè)餾分，并對(duì)各個(gè)餾分的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定。由表2可知，不同餾分對(duì)4種核桃病原真菌的抑菌作用表現(xiàn)出明顯差異。餾分1～3均能明顯抑制葉點(diǎn)霉的菌絲生長，餾分4～6對(duì)葉點(diǎn)霉的菌絲生長無影響，餾分2(石油醚∶丙酮=5∶1)部分對(duì)該病原菌菌絲生長抑制效果最強(qiáng)；餾分1-6均能抑制炭疽菌的菌絲生長，其中餾分2部分對(duì)炭疽菌抑菌活性最好；餾分1～3對(duì)殼二孢表現(xiàn)出良好的抑制作用，其中，餾分3的抑菌活性相對(duì)較高，餾分4～6對(duì)殼二孢無抑菌效果；餾分1～5均能對(duì)擬莖點(diǎn)霉表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑菌率在11.22%～58.50%之間，其中餾分2的抑菌率最高，對(duì)菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，而餾分6對(duì)該病原菌無抑菌效果。綜上所述，有效抑制葉點(diǎn)霉、炭疽菌、殼二孢3種病原菌的成分主要集中在餾分2部分，抑制殼二孢的成分主要集中在餾分3部分。

表1 飛機(jī)草不同粗提物對(duì)4種核桃病原菌的抑菌活性

表2 飛機(jī)草乙酸乙酯萃取物不同餾分對(duì)4種核桃病原菌的抑菌活性

2.4 不同化合物對(duì)供試病原菌的抑菌活性

進(jìn)一步以抑菌活性較好的餾分2部分離得到3個(gè)量大的化合物4、5、7為供試化合物，測(cè)定其對(duì)4種核桃病原真菌的抑菌毒力，結(jié)果表明不同化合物對(duì)各病原菌的毒力之間的差別顯著(表3)。其中，3個(gè)化合物對(duì)葉點(diǎn)霉、炭疽菌、殼二孢的抑菌活性強(qiáng)弱依次為：化合物5>化合物4>化合物7，其中抑菌活性最強(qiáng)的化合物5對(duì)上述三種菌的EC50分別為0.154 3、0.202 9、0.268 7 mg/mL，但仍均與陽性對(duì)照差異較大；對(duì)擬莖點(diǎn)霉的抑菌活性最強(qiáng)的仍是化合物5，其次為化合物7和化合物4，EC50分別為0.106 2、0.404 2、0.587 0 mg/mL，其中，化合物5(異野櫻素)對(duì)4種核桃病原菌均表現(xiàn)出較好的抑菌作用，該化合物對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌絲生長抑制作用最強(qiáng)(圖2D-1)。4種菌株在PDA培養(yǎng)基中于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，菌絲長勢(shì)均良好(圖2A～D)。菌絲初期均為白色，菌落中間的顏色在4天后出現(xiàn)變化，6天時(shí)最為明顯，且添加藥劑的菌落顏色較深于對(duì)照。葉點(diǎn)霉菌落中間為淡墨綠色，白色絨毛狀菌絲附于外圍，炭疽菌菌落中間為淡橘紅色，外圍菌絲呈白色，殼二孢菌落中間為墨綠色且占比例較大，外圍僅有一圈白色絨毛狀菌絲，擬莖點(diǎn)霉菌落出現(xiàn)明顯的顏色分圈，苯醚甲環(huán)唑處理后能明顯抑制各病原菌菌絲生長。

表3 3種化合物對(duì)4種核桃病原菌的相對(duì)毒力

圖2 150 μg/mL異野櫻素對(duì)核桃病原菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of 150 μg/mL of isosakuranetin on pathogenic fungi from J.regia注：A～D：葉點(diǎn)霉、炭疽菌、殼二孢，擬莖點(diǎn)霉；1～3：異野櫻素、對(duì)照、陽性對(duì)照。Note:A-D:Phyllosticta sp.,Colletotrichum sp.,Ascochyta sp.,Phomopsis sp.;1-3:Isosakuranetin,control group and positive control group.

3 討論與結(jié)論

本研究為進(jìn)一步探究飛機(jī)草的抑菌活性，對(duì)飛機(jī)草地上部分進(jìn)行系統(tǒng)的分離，從乙酸乙酯層共分離得到10個(gè)化合物，包括6個(gè)二氫黃酮、1個(gè)二氫黃酮醇、2個(gè)黃酮、1個(gè)黃酮醇，其中有化合物2、8首次從飛機(jī)草中分離獲得。研究報(bào)道，黃酮化合物是飛機(jī)草葉片中主要次生代謝物質(zhì)，在飛機(jī)草的防御和競(jìng)爭中具有重要作用，能使飛機(jī)草在入侵過程通過強(qiáng)抗性和強(qiáng)化感活性去突破新天敵和新的競(jìng)爭者的阻礙[25]。因此，推測(cè)黃酮化合物是飛機(jī)草成功入侵的特征成分。植物為抵御來自于環(huán)境或其它生物物種的外來傷害逐漸形成了基于特異性的作用機(jī)制形成的化學(xué)防御物質(zhì)，使其在長期進(jìn)化和自然選擇中占有明顯優(yōu)勢(shì)[26]，植物源活性物質(zhì)可作為抑菌主要成分[27]，對(duì)今后開發(fā)為新型的天然抗菌劑具有重要意義。

目前常用乙醇提取植物中次生代謝，但不同的提取溶劑對(duì)植物抑菌效果具有不同影響[28]。本研究對(duì)飛機(jī)草各粗提物進(jìn)行抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)1 mg/mL乙酸乙酯萃取物對(duì)4種核桃病原真菌的抑制活性高于乙醇提取物、石油醚萃取物、水萃取物，可能是抑制核桃病原菌的活性成分極性與乙酸乙酯極性相似。該萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離劃段得到6個(gè)餾分，比較發(fā)現(xiàn)餾分2部分能夠有效抑制葉點(diǎn)霉、炭疽菌、擬莖點(diǎn)霉病原菌，抑制率分別為67.54%、40.69%、58.50%，抑制殼二孢的成分主要集中在餾分3部分，進(jìn)一步測(cè)定了餾分2部分分離得到的量大的化合物4、5、7對(duì)4種核桃病原真菌的抑菌毒力。化合物4、5對(duì)4株病原菌的整體抑制作用優(yōu)于化合物7，其中，化合物5對(duì)4種核桃病原菌的抑菌活性均較好，其對(duì)各病原菌的EC50分別為擬莖點(diǎn)霉0.106 2 mg/mL、葉點(diǎn)霉0.154 3 mg/mL、炭疽菌0.202 9 mg/mL、殼二孢0.268 7 mg/mL，該結(jié)果與已報(bào)道的A環(huán)的5-OH、7-OH為重要抗菌活性基團(tuán)相吻合[23]。此外，化合物結(jié)構(gòu)中的甲氧基存在，也是其抑菌的活性基團(tuán)，研究報(bào)道該類化合物可有效抑制菌膠包炭疽菌，且抑菌效果隨濃度的增加而增強(qiáng)[29]。黃酮類化合物因其具有較高的抑菌活性，很早就被應(yīng)用于抑菌治療[30]。

綜上所述，飛機(jī)草乙醇提取物中抑核桃病原菌的活性成分集中于乙酸乙酯層，而異野櫻素是該萃取層的主要活性物質(zhì)。飛機(jī)草富含黃酮化學(xué)成分，黃酮類抑菌活性顯著[39]。今后可進(jìn)一步圍繞黃酮類成分進(jìn)行抑菌先導(dǎo)化合物的開發(fā)，為飛機(jī)草的治理和綜合利用奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)為新型殺菌劑提供理論依據(jù)。

致謝：感謝西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳玉惠教授提供供試菌種。