劉志強(qiáng)，楊尚玉，王博龍

1鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 鶴壁市天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鶴壁 458030；2宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜春 336000

中藥姜黃為姜科植物姜黃CurcumalongaL.的干燥根莖，其氣香特異，味苦、辛，歸脾、肝經(jīng)，有破血行氣，通經(jīng)止痛之功效[1]。姜黃以中藥配伍于方劑，始自《太平惠民和劑局方》的五痹湯，以其理血止痛等效用，治療風(fēng)寒濕邪、客留肌膚等證[2]。后代醫(yī)家多以姜黃為理血藥用治于內(nèi)科痹痛、婦科、骨傷、雜癥等領(lǐng)域。此外，姜黃在伊朗、印度、泰國(guó)等地也常做為民族藥材或保健食品，用以治療皮膚病、感染、精神疾病等[3]。鑒于姜黃能對(duì)多種疾病產(chǎn)生治療作用，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者為研究姜黃的分子藥理機(jī)制做出了不懈努力。Eleonora等[4]綜述了姜黃的現(xiàn)代藥理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其具有改善代謝紊亂、改善慢性疾病、調(diào)節(jié)機(jī)能、抗氧化、保健等作用。Deguchi等[5]發(fā)現(xiàn)姜黃及其主要功效成分姜黃素安全性高，能介導(dǎo)多個(gè)靶點(diǎn)與多條通路發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等作用。中國(guó)對(duì)姜黃的藥理作用研究多集中在其抗腫瘤、抗炎、降血糖及對(duì)心血管系統(tǒng)的影響[6]。

盡管當(dāng)前研究揭示了姜黃的許多藥理機(jī)制，但多局限于對(duì)姜黃單一藥材或其成分的研究，鮮有對(duì)其配伍規(guī)律、復(fù)方協(xié)同藥理機(jī)制進(jìn)行研究者。姜黃做為中醫(yī)方劑組份治療疾病，其功效作用必然受到配伍藥物的相互影響。中醫(yī)藥理論認(rèn)為“藥有個(gè)性之長(zhǎng)，方有合群之妙”，方劑組份君、臣、佐、使功能作用各不相同，《神農(nóng)本草經(jīng)》中有“相須、相使者良，相惡、相反者勿用”等論述[7]。因此，探索姜黃的藥理作用不能僅局限于對(duì)其自身的研究，還應(yīng)對(duì)其組方配伍進(jìn)行整體分析。數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的進(jìn)步為研究中醫(yī)藥配伍關(guān)聯(lián)規(guī)律提供了新的方法，其中Apriori關(guān)聯(lián)算法、廣義規(guī)則歸納(generalized rule induction，GRI)算法為常用的簡(jiǎn)單關(guān)聯(lián)規(guī)則算法，能有效地挖掘出方劑中關(guān)聯(lián)度強(qiáng)的核心藥對(duì)、藥方，既簡(jiǎn)化了方劑成分?jǐn)?shù)量，又不失中醫(yī)配伍之妙，在中藥配伍規(guī)律、核心組方的發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用最為廣泛。例如，唐啟盛[8]等利用廣義規(guī)則歸納(GRI)關(guān)聯(lián)規(guī)則算法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了治療焦慮的傳統(tǒng)中藥核心配方，即柴胡-郁金、酸棗仁-生龍骨等。本研究基于數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘技術(shù)原理，利用GRI算法、Arrowsmith知識(shí)發(fā)現(xiàn)工具、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)等手段，研究中藥姜黃在理血方劑中配伍規(guī)律及其藥理機(jī)制，以期為開發(fā)新一代姜黃產(chǎn)品提供理論支持和技術(shù)線索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源與處理

本研究將《中醫(yī)方劑大詞典》[9]中所有方劑資料構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。按照納入標(biāo)準(zhǔn)，檢索收集符合要求的姜黃方劑。(一)納入標(biāo)準(zhǔn)：①方劑中含有姜黃，且符合理血方劑的概念。理血?jiǎng)?yīng)符合《方劑學(xué)》(第九版)[10]標(biāo)準(zhǔn)且由兩位副高職稱以上中醫(yī)師或中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師認(rèn)定。②為體現(xiàn)姜黃在方劑中的規(guī)律性，應(yīng)排除藥味數(shù)>15的大方或姜黃在方中分量較輕的方劑。③排除外用的方劑。④同方異名者，以首現(xiàn)的古籍為準(zhǔn)。(二)數(shù)據(jù)規(guī)范：按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[11]對(duì)檢索的方劑進(jìn)行藥物名稱規(guī)范統(tǒng)一。如“玄胡索”、“元胡索”統(tǒng)一為“延胡索”，“芎”、“芎窮”統(tǒng)一為“川芎”等。

1.2 關(guān)聯(lián)規(guī)律分析

采用GRI廣義規(guī)則歸納算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)律的挖掘，以SPSS Clementine 12.0軟件中的GRI建模模板進(jìn)行計(jì)算。參數(shù)包括頻次、支持度、置信度、提升。X中藥支持度為含有X中藥方劑數(shù)量與納入方劑總數(shù)的比值；中藥X→中藥Y的置信度為含有中藥X的方劑中包含中藥Y的概率；中藥X→中藥Y的提升為“中藥X→中藥Y置信度”與“中藥Y支持度”的比值。置信度反應(yīng)藥物組合同時(shí)出現(xiàn)的概率，置信度用于表示藥物間聯(lián)系的緊密性，提升度體現(xiàn)了中藥X對(duì)中藥Y在方劑中出現(xiàn)概率的提升能力，三者應(yīng)綜合考量以反應(yīng)姜黃在理血?jiǎng)┲械挠盟幰?guī)律。

1.3 核心配伍靶標(biāo)的數(shù)據(jù)挖掘

利用Arrowsmith知識(shí)發(fā)現(xiàn)工具挖掘探索姜黃核心配伍的協(xié)同藥理機(jī)制。在Arrowsmith檢索界面輸入A集合檢索詞為姜黃的拉丁名與中文拼音名(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)，輸入C集合檢索詞為姜黃核心配伍中其他藥物名，例如，當(dāng)歸為(“Angelicasinensis”or“Danggui”)，川芎為(“Ligusticumchuanxiong” or “Chuanxiong”)等。然后使用Arrowsmith工具將A集合和C集合關(guān)聯(lián)，設(shè)置檢索語(yǔ)義為“Genes & Molecular Sequences,and Gene & Protein Names”得到A集合與C集合相關(guān)的集合B，從而發(fā)現(xiàn)姜黃與其配伍藥物的共同相關(guān)靶點(diǎn)、靶蛋白，以此為兩者協(xié)同藥理機(jī)制的基礎(chǔ)靶標(biāo)。

1.4 藥理機(jī)制預(yù)測(cè)

利用STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)和KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)，對(duì)數(shù)據(jù)挖掘得到的姜黃核心組方靶標(biāo)進(jìn)行藥理分子機(jī)制分析。并利用Uniprot、Protein atlas和FunRich3.1.3數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因的組織分布、細(xì)胞分布。綜合以上信息歸納姜黃核心組分的潛在藥理機(jī)制。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)參數(shù)設(shè)置：物種為“Homo sapiens(智人)”，相互作用數(shù)據(jù)來(lái)源為文本挖掘(textmining)、實(shí)驗(yàn)(experiments)、數(shù)據(jù)庫(kù)(databases)，閾值設(shè)為高“high confidence = 0.7”。KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置：物種為“Homo sapiens(智人)”、通路為“KEGG Pathway、KEGG Disease”。

1.5 體外抗腫瘤機(jī)制的藥理測(cè)定

2 結(jié)果

2.1 姜黃方劑的配伍關(guān)聯(lián)規(guī)律

按照納入標(biāo)準(zhǔn)，在《中醫(yī)方劑大詞典》數(shù)據(jù)庫(kù)共挖掘到姜黃理血方劑47首，包含中藥126味。兩味藥組合最常見配伍如表1所示，“姜黃-當(dāng)歸”頻次29、“姜黃-川芎”頻次15、“姜黃-赤芍”頻次14，為排名前三的組合。根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則GRI算法，姜黃配伍3味藥關(guān)聯(lián)規(guī)律如表2、圖1所示，其中“姜黃、川芎→當(dāng)歸”(置信度93.33%、支持度31.91%、提升1.51)組合的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。表示“姜黃、川芎”配伍頻率為31.91%，“姜黃、川芎”出現(xiàn)時(shí)，當(dāng)歸有93.33%概率同時(shí)出現(xiàn)，比當(dāng)歸單獨(dú)出現(xiàn)的概率61.70%(見表1)提升了1.51。說(shuō)明“姜黃-當(dāng)歸-川芎”組方頻次最高，川芎還能提升“姜黃-當(dāng)歸”的出現(xiàn)頻率，該組方很可能是姜黃理血方劑的核心配伍?！敖S、赤芍→當(dāng)歸”和“姜黃、蒲黃→赤芍”組合的頻次、關(guān)聯(lián)性位居第二、第三，也是姜黃理血方劑的較好配伍形式。

表1 姜黃配伍2味藥組合頻次表

續(xù)表1(Cotinued Tab.2)

表2 姜黃配伍3味藥關(guān)聯(lián)規(guī)律

2.2 “姜黃-當(dāng)歸-川芎”配伍的靶蛋白預(yù)測(cè)

通過(guò)GRI關(guān)聯(lián)算法分析，發(fā)現(xiàn)“姜黃-當(dāng)歸-川芎”是姜黃理血方劑的核心配伍。下一步運(yùn)用Arrowsmith工具將姜黃(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)文獻(xiàn)集合與當(dāng)歸(“Angelicasinensis”or“Danggui”)文獻(xiàn)集合關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)“姜黃-當(dāng)歸”靶點(diǎn)條目227個(gè)，關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)0.95以上條目33個(gè)。姜黃(“Curcumalonga” or “Jianghuang”)文獻(xiàn)集合與川芎(“Ligusticumchuanxiong”or“Chuanxiong” )文獻(xiàn)集合關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)“姜黃-當(dāng)歸”靶點(diǎn)條目175個(gè)，關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)0.95以上條目22個(gè)。如圖2、表3所示，“姜黃-當(dāng)歸-川芎”關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)大于0.95共同靶點(diǎn)13個(gè)。13個(gè)靶點(diǎn)涉及相關(guān)家族基因27個(gè)。

圖1 散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter diagram

圖2 靶點(diǎn)數(shù)量韋恩圖 (score ≥ 0.95)Fig.2 Venn diagram of number of targets (score ≥ 0.95)

2.3 靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)與組織分布

如圖3所示，將13個(gè)潛在靶點(diǎn)(27個(gè)基因)進(jìn)行PPI(Protein-protein interaction network)網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建了27個(gè)基因、88條相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件cytoHubba插件預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)Hub基因，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的平均度值為6.52，平均最短距離為51.03×10-2，平均介數(shù)4.09×10-2，其中AKT1、PIK3CA、RELA、NFKB1、MAPK14、VEGFA的三個(gè)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)超過(guò)了平均值，是PPI網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)，可能是“姜黃-當(dāng)歸-川芎”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的Hub基因。

表3 “姜黃-當(dāng)歸-川芎”的共同靶點(diǎn)(關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)大于0.95)

利用Uniprot、Protein atlas和FunRich3.1.3數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶基因的細(xì)胞分布、組織分布情況，結(jié)果如圖4、表4所示，靶基因在組織的分布大多表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、血小板等免疫細(xì)胞，而在其他器官的表達(dá)并不均勻。在細(xì)胞分布則有質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、外泌等各種形式。

2.5 KEGG通路分析

利用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)，將“姜黃-當(dāng)歸-川芎”的13個(gè)潛在靶點(diǎn)(27個(gè)基因)進(jìn)行KEGG通路富集，其中P-value<0.01的前四十條通路結(jié)果如圖5所示：8條通路與癌癥相關(guān)；12條通路與感染和炎癥相關(guān)；8條通路為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；5條通路與神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)；5條通路參與了一般生物過(guò)程；還有2條通路與其他疾病相關(guān)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)參數(shù)

綜上，四十條通路可簡(jiǎn)要?dú)w納為圖6～8所示，推測(cè)“姜黃-當(dāng)歸-川芎”可能具有通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、MAPK、Toll-like receptor、T cell receptor、EGFR、VEGFR、Apoptosis、HIF-1等信號(hào)通路，發(fā)揮增強(qiáng)免疫力、抗炎、改善微循環(huán)、保護(hù)腦神經(jīng)以及抗腫瘤、抗腫瘤血管生成等潛在藥理作用。

2.6 組方A549細(xì)胞的抑制率

利用5 g姜黃，5 g川芎和5 g當(dāng)歸制成粉末，將300 mL水煎至150 mL，過(guò)濾除去殘留物，然后加入300mL水中，最后濃縮至150 mL(相當(dāng)于中藥100 mg/mL)。我們使用MTT測(cè)定法定量了A549細(xì)胞的抑制率和增殖。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為六組(每組3孔)。第1組至第5組中分別添加100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的草藥提取物100 μL，對(duì)照組則添加100 μL DMSO。在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h后，我們通過(guò)每孔添加20 μL MTT(5 mg/L)除去。溫育4 h后，用DMSO終止反應(yīng)。最后，通過(guò)酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)量每孔的吸光度。抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)/ OD對(duì)照)×100%。結(jié)果顯示在表5和圖9中?！敖S-川芎-當(dāng)歸”配方可以劑量和時(shí)間依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 組織分布Fig.4 Tissue organ location

圖5 通路富集Fig.5 Pathway enrichment

圖6 調(diào)控血管生成Fig.6 Regulating angiogenesis

圖7 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)Fig.7 Regulate immune response

圖8 抗腫瘤Fig.8 Antitumor

表5 不同濃度組方對(duì)A549細(xì)胞的抑制率

圖9 不同濃度組方對(duì)A549細(xì)胞抑制率的影響Fig.9 Effect of formula with different concentrations on the inhibition ratio of A549 cells

2.7 靶蛋白p-EGFR、p-PI3K、p-Akt、VEGF和HIF-1α體外測(cè)定的體外表達(dá)

通過(guò)Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的生物信息學(xué)免疫組織化學(xué)分析表明，在正常肺組織中PI3K、EGFR未表達(dá)，AKT低表達(dá)，但在肺癌組織樣品中PI3K、EGFR、AKT明顯表達(dá)(見圖10)?；赪estern blotting檢測(cè)了p-EGFR、p-PI3K和p-Akt在A549肺癌細(xì)胞的表達(dá)(見圖11)。將人類A549細(xì)胞分為四組(每組3孔)：對(duì)照，小劑量(6.25 mg/mL)、中等劑量(12.5 mg/mL)、高劑量(25 mg/mL)。證明“姜黃-川芎-當(dāng)歸”配方可以明顯抑制培養(yǎng)基中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt的表達(dá)。孵育24 h后，我們通過(guò)Elisa分析檢測(cè)了VEGF、HIF-1α的表達(dá)?！敖S-川芎-當(dāng)歸”配方可顯著抑制各劑量組的VEGF、HIF-1α的表達(dá)(見表6)。

3 討論

理血?jiǎng)┦且活惥哂姓{(diào)暢血行、散除瘀血、涼血止痛等效果的中醫(yī)方劑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用以治療外傷腫痛、婦科炎癥、心腦血管疾病、腫瘤癌癥等。本研究發(fā)現(xiàn)的姜黃核心配伍“姜黃-當(dāng)歸-川芎”中川芎屬于活血化瘀藥，而當(dāng)歸屬于活血補(bǔ)血藥。姜黃與川芎、當(dāng)歸配伍具有較好的中醫(yī)配伍理論依據(jù)。川芎為血中氣藥，兼有行氣止痛之效，氣行則血暢，故能增強(qiáng)姜黃、當(dāng)歸活血化瘀之力[12]。當(dāng)歸為補(bǔ)血圣藥，能祛瘀生新，與姜黃、川芎配伍祛邪扶正、攻補(bǔ)兼施[13]。古代經(jīng)典名方“四物湯”便有當(dāng)歸配伍川芎的用法。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸與川芎配伍后治療血瘀大鼠比單獨(dú)當(dāng)歸、單獨(dú)川芎療效更佳。Deng等[15]總結(jié)通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘古今名方，發(fā)現(xiàn)姜黃具有治療腦病的作用，并且最善與活血化瘀藥當(dāng)歸、川芎等配伍，于本研究數(shù)據(jù)挖掘結(jié)論基本一致。綜上，說(shuō)明當(dāng)歸、川芎與姜黃具有協(xié)同增效的配伍依據(jù)，但后續(xù)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析姜黃與當(dāng)歸、川芎增效機(jī)制。

本研究首先通過(guò)Arrowsmith知識(shí)發(fā)現(xiàn)工具，發(fā)現(xiàn)了“姜黃-當(dāng)歸-川芎”能聯(lián)合作用于AKT、TLR4、caspase-3、PI3K、mTOR、p38 MAPK、VEGF、iNOS、Nrf2、BDNF、NF-κB、Bcl-2、Bax等13個(gè)靶點(diǎn)，涉及相關(guān)基因27個(gè)。PPI與通路富集顯示“姜黃-當(dāng)歸-川芎”能通過(guò)AKT1、PIK3CA、RELA、NFKB1、MAPK14、VEGFA等Hub基因，參與調(diào)控PI3K/Akt、MAPK、Toll-like receptor、T cell receptor、EGFR、VEGF、Apoptosis、HIF-1等信號(hào)通路，預(yù)測(cè)其可能具有增強(qiáng)免疫力、抗炎、改善微循環(huán)、保護(hù)腦神經(jīng)以及抗腫瘤、抗腫瘤血管生成等潛在藥理作用。

圖10 PI3K、Akt、EGFR在肺癌組織中過(guò)表達(dá)Fig.10 PI3K, Akt, EGFR is overexpressed in lung cancer tissues

表6 組方對(duì)A549細(xì)胞VEGF和HIF-1α表達(dá)的影響

Liu等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃能抑制AKT/mTOR途徑而導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3細(xì)胞凋亡。Ashrafizadeh等[17]發(fā)現(xiàn)姜黃通過(guò)靶向Nrf2信號(hào)通路具有多種作用，包括抗氧化劑，抗菌，抗腫瘤和抗炎作用。此外，有研究表明川芎和當(dāng)歸也可以發(fā)揮抗腫瘤作用，Shen等[18]使用RT-qPCR和Western blotting分析表明，川芎能顯著降低Akt的表達(dá)和活性，增加caspase-3的活性，并且還顯示出對(duì)多種類型的癌癥具有抗腫瘤作用。當(dāng)歸可以通過(guò)抑制mTOR蛋白誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡，并可以顯著延長(zhǎng)癌癥患者的生存率[19]。當(dāng)歸還影響多種凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2和caspase-3的表達(dá)并促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的凋亡，因此已被證明是一種有前途的乳腺癌治療劑[20]。另外，“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方可能具有抗腫瘤血管生成作用。有ELISA分析表明，姜黃能抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的分泌，進(jìn)一步抑制了腫瘤血管生成[21]。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸可以通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路并下調(diào)HIF-1α和VEGF的表達(dá)來(lái)預(yù)防癌細(xì)胞的增殖和血管生成。這些研究表明“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方可發(fā)揮抗腫瘤作用。我們的結(jié)果與上述研究基本一致。

此外，本研究推測(cè)“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方還可以顯示抗炎，保護(hù)腦神經(jīng)的作用以及改善微循環(huán)的作用。Zhu等[23]使用免疫組織化學(xué)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和蛋白質(zhì)印跡，證明姜黃能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路減輕實(shí)驗(yàn)性顱腦損傷的急性炎癥損傷。有研究表明當(dāng)歸可以上調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)，具有抗炎和鎮(zhèn)痛的藥理作用[24]。川芎能通過(guò)抑制p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路，使炎癥性細(xì)胞因子和粘附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)降低。這些研究證實(shí)了“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方抗炎作用的假設(shè)。Wu等[25]發(fā)現(xiàn)姜黃可以通過(guò)上調(diào)caspase 3和Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)并促進(jìn)PI3K/AKT途徑的活化而對(duì)缺血性腦損傷發(fā)揮有益作用。Hurley等[26]研究表明姜黃能導(dǎo)致海馬BDNF劑量依賴性增加，具有保護(hù)腦神經(jīng)作用。Cheng等[27]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸可通過(guò)下調(diào)caspase 3和上調(diào)p-p38 MAPK，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A)來(lái)保護(hù)患者免受腦梗塞并改善神經(jīng)系統(tǒng)損害。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯可以有效地通過(guò)PI3K/Akt/iNOS途徑保護(hù)胰島微血管的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。我們的結(jié)果與以上研究一致，證明了“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方保護(hù)腦神經(jīng)和改善微循環(huán)的藥理作用。

圖11 通過(guò)Western blotting在A549細(xì)胞中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt的表達(dá)Fig.11 The expression of p-EGFR, p-PI3K and p-Akt in A549 cells by Western blotting注：A：對(duì)照組：B：小劑量；C：中劑量；D：高劑量Note: A: Control; B:Small-dose; C: Medium-dose; D: High-dose

最后，本研究使用MTT、Elisa和Western blotting實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方可以抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖并下調(diào)A549細(xì)胞中p-EGFR、p-PI3K、p-Akt、VEGF和HIF-1α的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)表明“姜黃-當(dāng)歸-川芎”配方在體外確實(shí)具有抗癌和抗腫瘤血管生成作用，證明數(shù)據(jù)挖掘信息可靠有效、可以預(yù)測(cè)中藥的某些藥理機(jī)制。本研究結(jié)果為中醫(yī)藥的發(fā)展和藥理作用機(jī)理研究提供了方法參考。