唐晟凱，錢勝峰，沈冬冬，張彤晴，劉燕山，許飛，王華，李大命

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210017；2.江蘇省高寶邵伯湖漁業(yè)管理委員會(huì)辦公室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

引言

在水體生態(tài)環(huán)境中，水生生物通過(guò)新陳代謝向水體中釋放DNA?！碍h(huán)境DNA 技術(shù)”是環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)的簡(jiǎn)稱，是通過(guò)從環(huán)境介質(zhì)中提取DNA，對(duì)樣本片段進(jìn)行生物測(cè)序，進(jìn)而了解環(huán)境中的生物群落分布情況[1-3]。環(huán)境DNA 技術(shù)最早應(yīng)用于微生物學(xué)研究，近年來(lái)逐步被應(yīng)用于水生生物的監(jiān)測(cè)[4-13]，但目前該技術(shù)在湖泊浮游動(dòng)物物種檢測(cè)方面的應(yīng)用仍然較少。

邵伯湖位于江蘇省揚(yáng)州市，與高郵湖和寶應(yīng)湖共同組成高寶邵伯湖，屬淮河入江水道上的湖泊之一，在漁業(yè)生產(chǎn)、蓄洪、農(nóng)業(yè)灌溉等方面具有重要作用。在2016 年的調(diào)查中，邵伯湖的浮游動(dòng)物共計(jì)有12 科16 屬20 種[14]。該研究運(yùn)用環(huán)境DNA 技術(shù)對(duì)邵伯湖浮游動(dòng)物進(jìn)行資源監(jiān)測(cè)，一方面為邵伯湖漁業(yè)資源與水生生物資源保護(hù)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也探索了在淺水湖泊進(jìn)行浮游動(dòng)物監(jiān)測(cè)的新方法。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)位設(shè)置

在全湖設(shè)置了15 個(gè)采樣點(diǎn)，其中北部敞水區(qū)、中部敞水區(qū)和南部河道區(qū)各設(shè)置了4 個(gè)、5 個(gè)和6個(gè)采樣點(diǎn)。采樣點(diǎn)位置分布見圖1。

1.2 采樣及樣品前處理

樣品采集于2018 年11 月7 日。在每個(gè)采樣點(diǎn)，用無(wú)菌聚丙烯瓶（Thermo；US）采集2 L 表層水（在水面以下約20 cm 處采集），現(xiàn)場(chǎng)用0.8 μm 孔徑的混合纖維濾膜（易基諾；南京）過(guò)濾。過(guò)濾后的濾膜置于-20 ℃冰箱，冷凍保存，直到DNA 提取。

1.3 DNA 提取

使用DNeasy Power Water Kit（QIGEN；Germany）提取濾膜DNA，具體操作如下：將濾膜置于帶有研磨珠的5 mL 離心管內(nèi)，加入1 mL 的55 ℃PW1，均質(zhì)5 min，全部吸取并離心1min；取上清加入200 μL IRS，渦旋混勻后于4 ℃靜置5 min，離心1 min；取上清加入650 μL PW3，混勻后過(guò)MB Spin Column富集DNA；分別加650 μL PW4 和650 μL 乙醇清洗，用100 μL EB 洗脫。使用Nano Drop 2000 測(cè)定DNA濃度和純度，并于-20 ℃冷凍存儲(chǔ)。

圖1 采樣點(diǎn)位置

1.4 PCR 擴(kuò)增

利用線粒體DNA 12S rRNA 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系：總體系50 μL，包含2X Phusion Master Mix with HF Buffer 25 μL（Thermo；US），上下游引物各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O19 μL；擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性10 s，66 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s。以ddH2O 為模板設(shè)置PCR 陰性對(duì)照。PCR 產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測(cè)，PCR 陰性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性。使用AMPure XP（Beckman Coulter; US）磁珠純化PCR產(chǎn)物。

1.5 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent 試劑盒（NEB；US）構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)后，Agilent 2100 檢測(cè)DNA 文庫(kù)質(zhì)量，稀釋DNA 文庫(kù)至100 pmol/L，利用Ion Proton 測(cè)序儀進(jìn)行樣品的二代測(cè)序。二代測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，數(shù)據(jù)分析全部基于ubuntu 14.04 版本下的EcoView 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境DNA 濃度與PCR

環(huán)境DNA 濃度介于17.3 至179.3 ng/μL 之間，平均濃度54.25 ng/μL；DNA 樣本的260/280 介于1.74 至1.93 之間，平均值1.83；DNA 樣本的260/230介于0.98 至2.13 之間，平均值1.54。其中，82 個(gè)樣本（94.44%）的DNA 濃度＞20ng/μL；87 個(gè)樣本（100.00%）的260/280 介于1.8 至2.0 之間，87 個(gè)樣本（94.44%）的260/230 介于1.8 至2.0 之間（圖2）。

圖2 樣本DNA 濃度及260/280

2.2 物種檢測(cè)

該次測(cè)序共獲得邵伯湖1 114 482 條DNA 序列（Reads 數(shù)），DNA 片段長(zhǎng)度約為380 bp。15 個(gè)采樣點(diǎn)均獲得DNA 序列信息測(cè)序數(shù)據(jù)共聚類形成646 個(gè)OTUs，注釋出的浮游動(dòng)物共有68 個(gè)OTUs，隸屬于5 目14 科18 屬22 種（圖3），其中鰓足綱共有26 個(gè)OTUs ，包括1 目6 科7 屬8 種，象鼻溞科、溞科、粗毛溞科、裸腹溞科和仙達(dá)溞科各1 種，薄皮溞科2 種；甲殼綱共有17 個(gè)OTUs，包括2 目2 科3 屬3 種；單巢綱共有25 個(gè)OTUs，包括2 目6科8屬11 種，聚花輪科、三肢輪科、晶囊輪科、疣毛輪科和鼠輪科各1 種，臂尾輪科6 種。在國(guó)內(nèi)外研究工作者的基礎(chǔ)上，根據(jù)浮游動(dòng)物的大小、攝食習(xí)性以及浮游動(dòng)物之間的相互作用，將淡水生態(tài)系統(tǒng)浮游動(dòng)物劃分為原生動(dòng)物濾食者PF、原生動(dòng)物捕食者PC、輪蟲濾食者RF、輪蟲捕食者RC、小型浮游動(dòng)物濾食者SCF、小型浮游動(dòng)物捕食者SCC、中型浮游動(dòng)物濾食者M(jìn)CF、中型浮游動(dòng)物捕食者M(jìn)CC、大型浮游動(dòng)物濾食者LCF 和大型浮游動(dòng)物捕食者LCC 10 個(gè)浮游功能群[15]（表1）。根據(jù)淡水浮游動(dòng)物功能群分類將邵伯湖22 種浮游動(dòng)物分為RF（9 種）、RC（1 種）、SCF（5 種）、SCC（1 種）、MCF（1種）、MCC（2 種）、LCF（1 種）和LCC（2 種），分別占總種類數(shù)的40.91%、4.55%、22.73%、4.55%、4.55%、9.09%、4.55%和9.09%。Reads 數(shù)占比較高的物種為脆弱象鼻溞（47.79%），透明薄皮溞（20.24%），球狀許水蚤（16.10%）等（圖4）。邵伯湖浮游動(dòng)物種類組成見表2。

圖3 邵伯湖浮游動(dòng)物OUTS 數(shù)量圖

表1 淡水浮游動(dòng)物功能群分類

功能群 縮寫 大小/mm 攝食習(xí)性大型浮游動(dòng)物濾食者Large copepods filter feeders LCF ＞1.5 濾食者，以細(xì)菌、藻類、有機(jī)質(zhì)和原生動(dòng)物為食Large copepods carnivore LCC ＞1.5 捕食者，以輪蟲、枝角類、雙翅目昆蟲（搖蚊幼蟲）、寡毛類為食大型浮游動(dòng)物捕食者

表2 邵伯湖浮游動(dòng)物種類組成

圖4 邵伯湖浮游動(dòng)物Reads 數(shù)占比組成圖

2.3 α 多樣性

如表3 所示，各樣點(diǎn)shannon 指數(shù)變化范圍為1.9433～4.8113，最小值出現(xiàn)在YZ-8，最大值出現(xiàn)在YZ-9。YZ-8 的各項(xiàng)指數(shù)均普遍低于其他點(diǎn)位，表明其浮游動(dòng)物多樣性程度較低；YZ-9 的各項(xiàng)指數(shù)均普遍高于其他點(diǎn)位，表明其浮游動(dòng)物多樣性程度較高。

表3 邵伯湖各采樣點(diǎn)位浮游動(dòng)物α 多樣性指數(shù)表

2.4 β 多樣性

如表4 所示，各樣點(diǎn)Bray-Curtis、Hellinger、Unweighted unifrac、Weighted unifrac 的最大值普遍出現(xiàn)在YZ-9 和YZ-11，由于不同群落或某環(huán)境梯度上不同點(diǎn)之間的浮游動(dòng)物共有種越少，β 多樣性越大[15]。YZ-9 和YZ-11 的各項(xiàng)指數(shù)均顯著高于其他點(diǎn)位，與其他點(diǎn)位共有物種較少。

3 討論

3.1 浮游動(dòng)物物種檢測(cè)

該研究監(jiān)測(cè)到浮游動(dòng)物14 科18 屬22 種，其中有16 種注釋到“種”，6 種注釋到“屬”。在2016 年的調(diào)查中，邵伯湖浮游動(dòng)物共計(jì)12 科16 屬20種[14]。與該次調(diào)查結(jié)果相比，粗毛溞、秀體溞屬、中劍水蚤屬、三肢輪屬、晶囊輪屬、臂尾輪屬、龜甲輪屬、多肢輪屬和異尾輪屬相同，兩次調(diào)查均為單巢綱種類最多，其次為鰓足綱，甲殼綱最少；與該次調(diào)查相同種類僅有1 種，為萼花臂尾輪蟲；該次調(diào)查較2016 年的調(diào)查多2 科2 屬2 種。

與2016 年調(diào)查種類上有所差異可能是由于：①調(diào)查點(diǎn)位的設(shè)置不同。該次調(diào)查設(shè)置的點(diǎn)位較均勻地分布于全湖且點(diǎn)位較多，而2016 年調(diào)查設(shè)置的點(diǎn)位多位于岸邊。②調(diào)查的頻次與季節(jié)不同。該次調(diào)查為1 個(gè)頻次，2016 年調(diào)查為1 月、5 月和9月共3 個(gè)頻次。③調(diào)查方法的差異。與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，利用環(huán)境DNA 技術(shù)對(duì)浮游動(dòng)物進(jìn)行鑒定更具客觀性，而運(yùn)用傳統(tǒng)的鏡鑒方法進(jìn)行物種鑒定（如2016 年的調(diào)查）則主觀性更強(qiáng)。當(dāng)然，現(xiàn)階段的環(huán)境DNA 技術(shù)在某些方面仍然存在一些不足[16-22]，因此在現(xiàn)階段的浮游動(dòng)物物種檢測(cè)中，環(huán)境DNA 技術(shù)尚難以完全取代傳統(tǒng)方法。

表4 邵伯湖各采樣點(diǎn)位浮游動(dòng)物β 多樣性指數(shù)

該研究中，薄皮溞sp.，中劍水蚤sp.，擬聚花輪蟲sp.，三肢輪蟲sp.，晶囊輪蟲sp.及臂尾輪蟲sp. 等6 種浮游動(dòng)物的DNA 序列未注釋到“種”的水平，原因可能在于選擇的12S rRNA 標(biāo)志基因保守性較大，對(duì)近緣物種的辨識(shí)度不夠。因此將來(lái)運(yùn)用環(huán)境DNA 技術(shù)對(duì)浮游動(dòng)物進(jìn)行物種檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增引物還需進(jìn)一步優(yōu)化。

3.2 邵伯湖浮游動(dòng)物功能群分布分析

該研究發(fā)現(xiàn)邵伯湖浮游動(dòng)物功能群以輪蟲濾食者RF 的輪蟲為主，大型浮游動(dòng)物幾乎缺失，浮游動(dòng)物顯著小型化，這可能主要是由于近年來(lái)水體魚類資源量下降，大型魚類尤其是肉食性魚類持續(xù)減少，主要以小型魚類為主，而小型魚類對(duì)枝角類和橈足類等浮游動(dòng)物攝食壓力顯著[23]。影響浮游動(dòng)物功能群分布的因素有很多，溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽、浮游植物的上行效應(yīng)、魚類攝食的下行效應(yīng)、種間競(jìng)爭(zhēng)等是影響浮游動(dòng)物生長(zhǎng)的主要因素[24-25]。因此，浮游動(dòng)物的動(dòng)能群的分布，也可以反映出生態(tài)環(huán)境的整體狀況，利用環(huán)境DNA 技術(shù)對(duì)浮游動(dòng)物進(jìn)行調(diào)查，能為水體生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)提供參考。

3.3 邵伯湖浮游動(dòng)物多樣性分析

各樣點(diǎn)Shannon 指數(shù)變化范圍為1.9433-4.8113，最小值出現(xiàn)在YZ-8，最大值出現(xiàn)在YZ-9。YZ-8 的α 多樣性各項(xiàng)指數(shù)均顯著低于其他點(diǎn)位的原因較多，可能是因其處在邵伯湖多個(gè)支流匯集處而導(dǎo)致流速過(guò)大有關(guān)，也可能與該點(diǎn)位的水質(zhì)狀況有關(guān)。其他樣點(diǎn)α 多樣性的各項(xiàng)指數(shù)較為均勻，表明邵伯湖浮游動(dòng)物生態(tài)結(jié)構(gòu)較為均衡和穩(wěn)定。

邵伯湖的β 多樣性的各項(xiàng)指數(shù)顯示最大值均出現(xiàn)在YZ-9 和YZ-11，與其他樣點(diǎn)共有物種較少，YZ-9 和YZ-11 共有物種較少可能與樣點(diǎn)的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽、浮游植物的上行效應(yīng)、魚類攝食的下行效應(yīng)、種間競(jìng)爭(zhēng)等是影響浮游動(dòng)物生長(zhǎng)的主要因素[24-25]。各樣點(diǎn)共有物種較為集中，表明邵伯湖浮游動(dòng)物的生態(tài)結(jié)構(gòu)較為均衡，空間分布上較為均勻。

3.4 環(huán)境DNA 技術(shù)在湖泊浮游動(dòng)物資源監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用前景

環(huán)境DNA 技術(shù)為淡水浮游動(dòng)物資源監(jiān)測(cè)、物種多樣性評(píng)價(jià)等提供了新的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。相比傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法，運(yùn)用環(huán)境DNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)浮游動(dòng)物具有以下主要優(yōu)勢(shì)：不依賴物種鑒定專家，減少了物種鑒定中的主觀差異；靈敏度高，對(duì)較為稀有種類的監(jiān)測(cè)效果較好；可大批量檢測(cè)樣品，比傳統(tǒng)的物種鑒定節(jié)約時(shí)間與人力。但運(yùn)用環(huán)境DNA 技術(shù)進(jìn)行浮游動(dòng)物資源監(jiān)測(cè)仍存在一些局限，如缺乏技術(shù)規(guī)范、少數(shù)近緣物種因序列相似而難以區(qū)分以及無(wú)法反映浮游動(dòng)物的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育階段等生物學(xué)特征等。

因此，在現(xiàn)階段的淡水浮游動(dòng)物資源監(jiān)測(cè)中，可根據(jù)監(jiān)測(cè)任務(wù)的需要，將環(huán)境DNA 技術(shù)與傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法結(jié)合使用。

4 結(jié)論

在應(yīng)用環(huán)境DNA 技術(shù)對(duì)邵伯湖浮游動(dòng)物資源的監(jiān)測(cè)中，共檢出浮游動(dòng)物22 種，邵伯湖浮游動(dòng)物功能群以輪蟲濾食者RF 的輪蟲為主，大型浮游動(dòng)物幾乎缺失，浮游動(dòng)物顯著小型化，預(yù)示了邵伯湖魚類可能正趨于小型化；各樣點(diǎn)浮游動(dòng)物的α 多樣性各項(xiàng)指數(shù)和β 多樣性各項(xiàng)指數(shù)差異較小，表明邵伯湖浮游動(dòng)物的生態(tài)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。環(huán)境DNA 技術(shù)適用于淺水湖泊浮游動(dòng)物群落監(jiān)測(cè)，在現(xiàn)階段的淡水浮游動(dòng)物資源監(jiān)測(cè)中，該技術(shù)宜與傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法結(jié)合使用。