張建業(yè)，張衛(wèi)華，韓 俊，陳 東

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA)是一種常見的膝關(guān)節(jié)疾病，多見于老年患者。OA的主要特征包括軟骨退變、關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥和軟骨下骨重建[1]。OA的病因尚不清楚，但最近研究表明，炎性細(xì)胞因子參與了OA的發(fā)生和發(fā)展。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在OA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]。IL-1β的釋放促進(jìn)了多種炎性介質(zhì)和分解代謝因子，如一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生和釋放，這些炎性介質(zhì)和分解代謝因子可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞外基質(zhì)降解[3-4]。因此，抑制IL-1β和IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是治療OA的有效策略。β-arrestin2是arrestin家族成員之一，在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)。研究表明，β-arrestin2通過降低炎性介質(zhì)的表達(dá)，參與抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活[5]。雖然甾體類和非甾體類抗炎藥可用于治療OA，但是其不良反應(yīng)嚴(yán)重，療效欠佳[6]。因此，具有多種抗炎作用和低毒作用的植物性天然治療藥物越來越受到人們的關(guān)注。丹參酮ⅡA(Tan ⅡA)是丹參酮的主要活性成分，其水溶性衍生物可抑制內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]。此外，Tan ⅡA通過下調(diào)促炎癥因子的產(chǎn)生減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[8]，提示Tan ⅡA在炎癥性疾病治療中起潛在作用。然而，Tan ⅡA對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥及軟骨基質(zhì)降解的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探究Tan ⅡA通過調(diào)節(jié)β-arrestin2對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥及軟骨基質(zhì)降解的影響，進(jìn)一步明確Tan ⅡA對(duì)OA大鼠的影響，以期為明確Tan ⅡA在OA中的作用機(jī)制提供新的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Tan ⅡA購自成都普利斯生物科技有限公司；RIPA裂解液和特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(BeyoECL Star)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一氧化氮(NO)測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；collagen Ⅱ、p65和基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；β-arrestin2、iNOS、Aggrecan和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)抗體購自美國Abcam公司；基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、COX-2和p-p65抗體購自美國Cell Signaling Technology；GAPDH抗體和二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠PGE2酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；軟骨染色液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)軟骨細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于96孔板中，5×103個(gè)/孔，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后IL-1β(10 ng/ml)處理細(xì)胞12 h(IL-1β組)，對(duì)照組大鼠添加磷酸緩沖鹽溶液。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有不同濃度Tan ⅡA(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L，分別作為A、B、C、D、E組)的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向每孔細(xì)胞內(nèi)加入CCK-8溶液10 μl，37℃條件下孵育3 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。細(xì)胞活力=[(實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450)/(對(duì)照組-空白組)]×100%，OD450為450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.4Western blot檢測(cè) 收集大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r/min 4℃條件下離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取樣本蛋白25 μg于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，隨后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入一抗iNOS(1︰2000)、COX-2(1︰5000)、MMP1(1︰1000)、MMP3(1︰5000)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13，1︰2000)、Ⅱ型膠原(1︰1500)、Aggrecan(1︰1000)、β-arrestin2(1︰2000)、p-p65(1︰5000)、p65(1︰3000)和GAPDH(1︰10000)稀釋液，4℃條件下過夜孵育。TBST清洗后，加入二抗(1︰5000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

1.5ELISA檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為4×105個(gè)/ml，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照“1.3”中步驟，向細(xì)胞中分別添加IL-1β(10 ng/ml)和Tan ⅡA(25 μmol/L和50 μmol/L)，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)上清液中PGE2含量。

1.6NO含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為4×105個(gè)/ml，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照“1.3”中步驟，向細(xì)胞中分別添加IL-1β(10 ng/ml)和Tan ⅡA(25 μmol/L和50 μmol/L)，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)NO測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)上清液中NO含量。

1.7OA大鼠模型的建立及給藥處理 24只10周齡雄性SD大鼠購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2016-0011，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，晝夜交替，提供充足飲水及飼料。待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和Tan ⅡA組，每組8只。模型組和Tan ⅡA組采用改良Hulth法[9]建立膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)，于大鼠左髕骨上方正中做一切口，切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶。對(duì)照組大鼠進(jìn)行相同手術(shù)操作，但不切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶。術(shù)后連續(xù)3 d予青霉素20萬單位肌內(nèi)注射預(yù)防感染。術(shù)后1周，Tan ⅡA組大鼠予Tan ⅡA 0.5 mg/kg灌胃[10]，對(duì)照組和模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，均連續(xù)4周。

1.7.1組織取材：末次灌胃24 h后，3%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠。無菌條件下打開膝關(guān)節(jié)腔，刀片矢狀位切取股骨內(nèi)側(cè)髁及脛骨平臺(tái)約3 mm厚關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，于10%多聚甲醛中固定，隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7.2HE染色及Mankin評(píng)分：10%多聚甲醛固定軟骨標(biāo)本48 h，20%EDTA脫鈣4周。常規(guī)石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。Mankin法[11]評(píng)估軟骨組織病理學(xué)變化。

1.7.3甲苯胺藍(lán)染色：10%多聚甲醛固定軟骨標(biāo)本48 h，20%EDTA脫鈣4周。常規(guī)石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，軟骨染色液浸染30 min。自來水洗2 min后，丙酮分化軟骨細(xì)胞呈紫藍(lán)色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1Tan ⅡA對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響 Tan ⅡA在6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L濃度下對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力無明顯影響(P>0.05)，Tan ⅡA在100.00 μmol/L濃度下可抑制大鼠軟骨細(xì)胞活力(P<0.05)，見表1。因此后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Tan ⅡA使用濃度為25.00 μmol/L和50.00 μmol/L。與對(duì)照組相比，IL-1β可顯著降低軟骨細(xì)胞活力(P<0.05)，與IL-1β組相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈劑量依賴性升高軟骨細(xì)胞活力(P<0.05)。見表2。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

表2 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

2.2Tan ⅡA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞NO、PGE2、iNOS和COX-2表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β顯著升高大鼠軟骨細(xì)胞中NO、PGE2、iNOS和COX-2的表達(dá)(P<0.05)；與IL-1β組相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈劑量依賴性降低大鼠軟骨細(xì)胞中NO、PGE2、iNOS和COX-2的表達(dá)(P<0.05)。見圖1和表3。

表3 丹參酮ⅡA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞NO、PGE2、iNOS和COX-2表達(dá)的影響

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響 iNOS為一氧化氮合酶，COX-2為環(huán)氧化酶-2；IL-1β組僅予白細(xì)胞介素-1β處理，C、D組分別予25.00、50.00 μmol/L丹參酮ⅡA處理

2.3Tan ⅡA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞MMPs表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β可顯著升高大鼠軟骨細(xì)胞中MMP1、MMP3和MMP13的表達(dá)(P<0.05)；與IL-1β組相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈劑量依賴性降低大鼠軟骨細(xì)胞中MMP1、MMP3和MMP13的表達(dá)(P<0.05)。見圖2和表4。

表4 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

圖2 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響 對(duì)照組予白細(xì)胞介素-1β+磷酸緩沖鹽溶液處理，IL-1β組僅予白細(xì)胞介素-1β處理，C、D組分別予25.00、50.00 μmol/L丹參酮ⅡA處理；MMP1為基質(zhì)金屬蛋白酶1，MMP3為基質(zhì)金屬蛋白酶3，MMP13為基質(zhì)金屬蛋白酶13

2.4Tan ⅡA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β可顯著降低Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達(dá)(P<0.05)；與IL-1β組相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈劑量依賴性升高Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達(dá)(P<0.05)。見圖3和表5。

表5 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan的影響

圖3 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan的影響 對(duì)照組予白細(xì)胞介素-1β+磷酸緩沖鹽溶液處理，IL-1β組僅予白細(xì)胞介素-1β處理，C、D組分別予25.00、50.00 μmol/L丹參酮ⅡA處理

2.5Tan ⅡA對(duì)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞β-arrestin2和NF-κB通路的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β可顯著降低β-arrestin2的表達(dá)，升高p-p65/p65的表達(dá)(P<0.05)；與IL-1β組相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈劑量依賴性升高β-arrestin2的表達(dá)和劑量依賴性降低p-p65/p65的表達(dá)(P<0.05)。見圖4和表6。

表6 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞β-arrestin2和NF-κB通路的影響

圖4 丹參酮ⅡA對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞β-arrestin2和NF-κB通路的影響 對(duì)照組予白細(xì)胞介素-1β+磷酸緩沖鹽溶液處理，IL-1β組僅予白細(xì)胞介素-1β處理，C、D組分別予25.00、50.00 μmol/L丹參酮ⅡA處理

2.6各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)及相關(guān)指標(biāo)變化 對(duì)照組大鼠軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，模型組大鼠軟骨表面明顯粗糙，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂，提示Tan ⅡA可明顯改善OA大鼠軟骨組織病理學(xué)變化。見圖5、圖6。與對(duì)照組相比，模型組大鼠Mankin評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Tan ⅡA組大鼠Mankin評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表7。

表7 各組大鼠關(guān)節(jié)損傷相關(guān)指標(biāo)比較分)

圖5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色所示(標(biāo)尺=50 μm) Tan ⅡA組造模成功后予丹參酮ⅡA 0.5 mg/kg灌胃，模型組造模成功后和對(duì)照組(未造模)予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃

圖6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織甲苯胺藍(lán)染色所示(標(biāo)尺=50 μm) Tan ⅡA組造模成功后予丹參酮ⅡA 0.5 mg/kg灌胃，模型組造模成功后和對(duì)照組(未造模)予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃

3 討論

OA是最常見的退行性關(guān)節(jié)炎，以關(guān)節(jié)功能障礙和身體殘疾為特征。OA的臨床特征包括關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)僵硬和活動(dòng)能力喪失。炎癥反應(yīng)和代謝紊亂對(duì)OA的發(fā)展至關(guān)重要[12]。盡管近年來，我們對(duì)OA的治療取得了極大的進(jìn)步，但自20世紀(jì)中葉以來，OA的患病率已翻了一番[13]。已有研究證明Tan ⅡA在其他疾病中具有抗炎作用[14]，然而Tan ⅡA在OA中的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在探究Tan ⅡA對(duì)OA軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)的作用，以期為OA的治療提供新的科學(xué)資料。

在OA過程中，IL-1β刺激NO、iNOS、PGE2、TNF-α和COX-2等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和分泌，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙[3-4]。MMPs和ADAMTS-5是參與軟骨降解的關(guān)鍵酶[15]。益母草能明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎性因子NO、PGE2和TNF-α的產(chǎn)生，降低iNOS、COX-2、MMP3、MMP13和ADAMTS-5的表達(dá)[16]。研究表明，Tan ⅡA通過促進(jìn)谷胱甘肽二硫化物的分解，誘導(dǎo)谷胱甘肽的再生，參與線粒體凋亡途徑在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2引發(fā)的炎性介質(zhì)的影響[17]。本研究結(jié)果顯示，Tan ⅡA可抑制軟骨細(xì)胞活力，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中NO和PGE2的產(chǎn)生，抑制iNOS、COX-2、MMPs的表達(dá)，表明Tan ⅡA可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及軟骨基質(zhì)降解。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由纖維蛋白組成，包括膠原蛋白、蛋白多糖和透明質(zhì)酸。關(guān)節(jié)軟骨中90%的蛋白多糖是Aggrecan[18]。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，Tan ⅡA也可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的Ⅱ型膠原和Aggrecan的下調(diào)，表明Tan ⅡA可促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)生成，在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

ERK/NF-κB途徑激活可導(dǎo)致COX-2和白細(xì)胞介素-8水平升高，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度炎癥反應(yīng)[19]。IL-1β可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NF-κB通路的激活，大黃素可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活，以改善OA軟骨降解[20]。已有研究表明，Tan ⅡA通過抑制NF-κB通路的激活，抑制成骨細(xì)胞中H2O2水平、活性氧積累和細(xì)胞凋亡，在骨質(zhì)疏松小鼠成骨分化過程中發(fā)揮保護(hù)作用[21]。β-arrestin2是NF-κB通路的上游細(xì)胞因子，敲低β-arrestin2可誘導(dǎo)NF-κB通路的激活，β-arrestin2過表達(dá)則可抑制NF-κB通路的激活[22]。證據(jù)顯示，Tan ⅡA通過上調(diào)β-arrestin2的表達(dá)來抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果顯示，Tan ⅡA可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中β-arrestin2的表達(dá)，抑制NF-κB通路的激活。為進(jìn)一步證實(shí)Tan ⅡA在OA中的作用，我們建立了OA大鼠模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tan ⅡA可明顯改善OA大鼠病情。

綜上，Tan ⅡA通過調(diào)節(jié)β-arrestin2表達(dá)抑制軟骨細(xì)胞炎癥及軟骨基質(zhì)降解，明顯改善OA大鼠病情。該結(jié)果為明確Tan ⅡA在OA中的作用機(jī)制及研發(fā)新的OA治療藥物提供了新的科學(xué)資料。