孫圣福，陳 偉，徐 鴻，徐 聰，藺曉月，邢林林，李玉杰，蘭鄒然，田夫林

（1.山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250100；2.濟南市動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250100）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種豬的高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)為高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血。其病死率高達100%，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。2018年8 月，王清華等[1]首次報道了我國首例非洲豬瘟的確診。2019 年4 月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定生豬屠宰企業(yè)要按照“批批檢、全覆蓋”的原則開展非洲豬瘟檢測[2]。實驗室檢測能力比對是評價和提高實驗室檢測能力和管理水平的重要手段[3-4]。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求，2020 年3 月，山東省動物疫病預防與控制中心組織全省319 家生豬屠宰企業(yè)開展非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對工作。本次檢測能力比對，客觀反映了生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟病毒檢測能力，也發(fā)現(xiàn)了其中存在的問題，對山東省以及其他省份非洲豬瘟防控起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 比對項目、方法

比對項目為非洲豬瘟病毒核酸檢測，檢測方法采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Q-PCR），具體操作按照相應(yīng)檢測試劑盒說明書進行。

1.2 參與企業(yè)

山東省319 家生豬屠宰企業(yè)全部參與本次非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對。

1.3 樣品和試劑

樣品為包含非洲豬瘟病毒基因組的液體樣品，由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心提供并標定，由山東省動物疫病預防與控制中心致盲后重新分組編號。1 595 份樣品分為319 組，每組5 份樣品，包含強陽性、弱陽性和陰性3 個滴度各1 份，其余2 份樣品從樣品庫中隨機抽取。樣品由參加檢測能力比對的屠宰企業(yè)自行領(lǐng)取，并于12 h內(nèi)送至各自實驗室，收到樣品48 h 內(nèi)反饋結(jié)果。

檢測試劑由各參加比對的屠宰企業(yè)自行在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準的或經(jīng)中國動物疫病預防控制中心評價后公布的診斷試劑目錄中購買。

1.4 結(jié)果判定

屠宰企業(yè)盲樣檢測結(jié)果與參考值一致，判定為樣品檢測結(jié)果正確；5 份樣品結(jié)果完全一致，判定為該企業(yè)檢測結(jié)果合格；1 份或1 份以上樣品檢測結(jié)果與參考值不一致，判定為該企業(yè)檢測結(jié)果不合格。

假陽性即為將參考值為陰性的樣品檢測為陽性；假陰性即為將參考值為陽性的樣品檢測為陰性。

2 比對結(jié)果

2.1 總體情況

319 個屠宰企業(yè)中，按時提交檢測結(jié)果的有314 個，結(jié)果反饋率為98.43%。反饋結(jié)果的企業(yè)中，有225 個企業(yè)檢測結(jié)果合格，合格率為71.66%（225/314）。1 570 份樣品中，有1 389 份樣品檢測結(jié)果正確，樣品正確率為88.47%。其中有1 份樣品檢測結(jié)果錯誤的屠宰企業(yè)有43 個，2～4 份樣品檢測結(jié)果錯誤的有44 個，2 個屠宰企業(yè)檢測結(jié)果完全錯誤。詳見表1。

表1 生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對總體結(jié)果

2.2 不同規(guī)模類型屠宰企業(yè)

314 個生豬屠宰企業(yè)中，A 類企業(yè)（屠宰產(chǎn)品可在全國范圍內(nèi)流通）187 家、B 類企業(yè)（屠宰產(chǎn)品僅限省內(nèi)流通）127 家，A 類和B 類屠宰企業(yè)合格率分別為79.14%和60.63%。

表2 不同類型生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測能力比對結(jié)果

2.3 檢測結(jié)果錯誤的屠宰企業(yè)情況

出現(xiàn)結(jié)果錯誤的89 個屠宰企業(yè)中，有9 個（10.11%）出現(xiàn)假陽性，74 個（83.15%）出現(xiàn)假陰性，6 個（6.74%）既有假陽性又有假陰性（表3）。

表3 錯誤屠宰企業(yè)情況

3 分析與討論

3.1 比對總體情況

參加非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對的屠宰企業(yè)有319 家，除了5 家沒有按照規(guī)定反饋結(jié)果外，其余314 家均及時反饋了檢測結(jié)果。其中225 家為合格，占71.66%，尚有89 家屠宰企業(yè)檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤。針對這種情況，山東省畜牧獸醫(yī)局及各市縣畜牧獸醫(yī)主管部門已經(jīng)責令89 家檢測結(jié)果不合格的和5 家未反饋結(jié)果的屠宰企業(yè)進行停產(chǎn)整頓，并展開現(xiàn)場調(diào)查和督導，限定時間內(nèi)達不到檢測要求的取締其生豬屠宰資格。

3.2 不同類型屠宰企業(yè)情況

從結(jié)果看，A 類企業(yè)檢測結(jié)果好于B 類企業(yè)，這也與遼寧省的情況一致[4]。究其原因：A 類屠宰企業(yè)屠宰量大，屠宰流程更規(guī)范，對非洲豬瘟檢測重視程度較B 類企業(yè)高；其產(chǎn)品在全國流通，一旦出現(xiàn)問題將會影響其在全國的銷售，因此更加重視產(chǎn)品質(zhì)量。B 類企業(yè)屠宰量小，產(chǎn)品僅在省內(nèi)流通，部分小型屠宰企業(yè)產(chǎn)品僅在市縣范圍內(nèi)流通，囿于成本考慮，對非洲豬瘟檢測設(shè)施設(shè)備和人員的投入僅能滿足最低要求；而且由于生豬出欄數(shù)量降低和生豬價格上漲，一些B 類屠宰企業(yè)難以生存，也很難增加非洲豬瘟檢測投入。

3.3 出現(xiàn)假陰性原因

檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤的企業(yè)中，存在假陰性結(jié)果的企業(yè)有74 個，占出現(xiàn)錯誤結(jié)果屠宰企業(yè)的83.15%。假陰性即為將真實結(jié)果為陽性的樣品檢測為陰性。經(jīng)調(diào)查分析有以下幾種原因：一是屠宰企業(yè)自身不重視非洲豬瘟檢測，沒有投入足夠的資金、人員，實驗室設(shè)施設(shè)備不完善；二是從事檢測的人員不具備檢測能力，沒有完全掌握儀器設(shè)備的基本操作，試驗操作不規(guī)范，對于檢測結(jié)果也缺乏應(yīng)有的專業(yè)知識和經(jīng)驗，不會判定陰、陽性結(jié)果；三是實驗室設(shè)施設(shè)備不達標，缺乏檢測必備的儀器設(shè)備，多采用免核酸提取的方法進行檢測，采用的熒光定量PCR 儀多為國產(chǎn)儀器，靈敏度不夠；四是試劑運輸和保存不規(guī)范，熒光定量PCR 試劑應(yīng)在低溫環(huán)境下運輸，在-15 ℃以下冷凍保存，而某些屠宰企業(yè)未按照試劑所需溫度、條件運輸和保存，造成試劑敏感性下降；五是實驗室布局不合理，沒有獨立封閉區(qū)域，部分屠宰企業(yè)從生活區(qū)隨意選取房間開展檢測，與檢測無關(guān)的人員自由出入，導致檢測環(huán)境不夠潔凈；六是檢測采用的耗材質(zhì)量不過關(guān)，試驗所用的eppendorf 管、Tip 槍頭等潔凈度不夠，造成核酸降解，選用的PCR 管透明度不夠，無法吸收PCR 擴增產(chǎn)生的光學信號。

3.4 出現(xiàn)假陽性原因

檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤的企業(yè)中，存在假陽性結(jié)果的企業(yè)有9 個，占出現(xiàn)錯誤結(jié)果屠宰企業(yè)的10.11%。假陽性即為將真實結(jié)果為陰性的樣品檢測為陽性。經(jīng)調(diào)查分析有以下幾種原因：一是實驗室布局不合理，配液區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)和擴增檢測區(qū)之間沒有物理隔斷，沒有單向順序，儀器耗材沒有單向流動，擴增過程中產(chǎn)生的核酸累積造成污染；二是實驗室硬件不達標，缺少樣品處理、核酸提取等需要的生物安全柜，所有操作都在開放環(huán)境中進行，造成了環(huán)境污染；三是操作不規(guī)范，操作過程中陽性對照沒有離心直接開蓋，產(chǎn)生氣溶膠造成污染，加樣過程中移液器使用不當造成污染等；四是不消毒或者消毒不徹底，試驗結(jié)束后，未對實驗臺面、儀器設(shè)備進行清潔消毒，或者消毒不規(guī)范，從下游區(qū)域向上游區(qū)域消毒，且采用同樣的抹布擦拭，導致擴增產(chǎn)生的核酸通過抹布帶到上游區(qū)域，對下一次檢測造成污染。

4 建議和對策

4.1 加強對非洲豬瘟檢測的重視

生豬屠宰環(huán)節(jié)開展非洲豬瘟檢測對于非洲豬瘟防控有重要意義。一旦攜帶非洲豬瘟病毒的生豬進入屠宰環(huán)節(jié)而沒有被及時發(fā)現(xiàn)，就會造成整個屠宰場污染。屠宰企業(yè)與養(yǎng)殖場之間存在人員、車輛、工具等的頻繁接觸，存在病毒匯集、擴散的風險[5]。因此，屠宰企業(yè)應(yīng)當加強對非洲豬瘟檢測的投入，如投入足夠資金建設(shè)科學規(guī)范的實驗室，聘請具備相應(yīng)檢測能力的專業(yè)技術(shù)人員，購置精密的儀器設(shè)備，選用合格的檢測試劑和耗材等。

4.2 加強對技術(shù)人員的培訓

非洲豬瘟病毒核酸檢測是一項專業(yè)性較強的技術(shù)工作，需要專業(yè)的技術(shù)人員開展，人員的技術(shù)水平和規(guī)范操作與檢測結(jié)果的正確性成正比。從調(diào)查結(jié)果來看，屠宰企業(yè)檢測人員整體專業(yè)化程度不高，大多未從事過實驗室檢測等專業(yè)技術(shù)操作，未培訓上崗的人員占據(jù)一定比例。針對這種現(xiàn)象，山東省畜牧獸醫(yī)局要求各級動物疫病預防控制機構(gòu)對屠宰企業(yè)檢測技術(shù)人員開展專業(yè)操作技術(shù)培訓，培訓合格后方可上崗。

4.3 加強對實驗室基礎(chǔ)設(shè)施的建設(shè)

實驗室布局不合格，硬件設(shè)備不達標，是導致檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤的重要影響因素之一。針對這種現(xiàn)象，山東省畜牧獸醫(yī)局起草了屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測實驗室管理制度，內(nèi)容包含實驗室位置、布局、儀器設(shè)備、人員要求、實驗室管理、檢測工作要求等要素，指導屠宰企業(yè)開展非洲豬瘟病毒核酸檢測工作。

4.4 加強對屠宰企業(yè)的監(jiān)管

畜牧獸醫(yī)主管部門應(yīng)加強屠宰企業(yè)監(jiān)管，定期對其產(chǎn)品或留存的樣品進行抽檢，以便能及時發(fā)現(xiàn)存在的問題，促進屠宰企業(yè)進行整改，同時引起屠宰企業(yè)的重視，避免其產(chǎn)生僥幸心理。