馬曉艷，王 文，蘇曉慧，薛 文，陳衛(wèi)東，翟少華，陳榮貴，王永生，夏 俊，秦 菊，努爾麥麥提·阿穆提

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；3.伊犁州動物疾病控制與診斷中心，新疆伊寧 835000；4.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011）

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）又稱牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)疹，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的牛的一種急性、亞急性或慢性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國在《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中將其列為一類傳染病[1]。患病牛是該病的主要傳染源，病毒存在于病牛的皮膚結(jié)節(jié)、肌肉、血液、內(nèi)臟、唾液、鼻腔分泌物及精液中。病?；謴?fù)后常帶毒3 周以上。LSDV 還可以通過蚊子、蒼蠅等節(jié)肢動物機械性傳播，也可通過飲水、飼料或直接接觸而傳播，在蚊蟲活躍時期由其引起的發(fā)病概率會明顯增高[2-3]。

2019 年8 月，新疆伊犁州察布查爾縣、霍城縣、伊寧市陸續(xù)有獸醫(yī)報告發(fā)現(xiàn)，多個場點的牛皮膚、乳頭、睪丸、鼻腔、口腔等部位長有大小不等的疙瘩。臨床排查發(fā)現(xiàn)，累計3 個縣（市）的17個鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生上述情況。初步臨床診斷后，采集特征性病變的牛皮膚結(jié)節(jié)及病死牛組織臟器開展實驗室檢測，并將樣品及時送至中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來動物疫病研究中心診斷，最終確定病原為LSDV。截至8 月13 日，伊犁州畜牧獸醫(yī)部門累計排查活牛67.14 萬頭。共有504 頭牛相繼發(fā)病，并伴有持續(xù)高燒，其中死亡1 頭，發(fā)病率為17.83%（1/2 826），病死率為0.20%（1/504）。發(fā)病牛以母牛居多，不同年齡的牛均有發(fā)病，懷孕病牛未見流產(chǎn)情況。

這是我國首起LSD 疫情，本文介紹了該疫情的診斷及處置情況，以期為LSD 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

高速八維旋轉(zhuǎn)組織研磨儀，購自德國Bertin公司；核酸提取儀NP968，購自西安天隆有限責(zé)任公司；熒光PCR 儀QuantStudio 5，購自ABI 公司；離心機，購自Sigma 公司；生物安全柜，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；冰凍切片機，購自萊卡公司；超薄切片機，購自LKB 公司。

1.2 主要試劑

LSDV 特異性引物、熒光標記探針、陽性/陰性對照，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；DNA 病毒熒光PCR 反應(yīng)液（生產(chǎn)批號YDNA20190401），購自哈爾濱世紀元亨公司；羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號E83），購自法國IDVET 公司。

1.3 樣品采集

采集3 頭發(fā)病牛樣品共58 份，包括皮膚、睪丸、乳頭等部位結(jié)節(jié)和病死牛肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等臟器的12 份病原樣品以及46 份血清樣品。對采集的樣品開展實驗室檢測，同時送至國家外來動物疫病研究中心檢測。

此外，LSD 疫情解封時，按照30%的比例全覆蓋抽樣，采集牛全血樣本833 份及蚊蟲樣品5 袋。其中察布查爾縣共有15 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)和1 個牧業(yè)公司，陽性同群牛2 635 頭，另采集其中2 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的蚊蟲5 袋；伊寧市3 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，陽性同群牛144 頭；霍城縣2 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，陽性同群牛47 頭。3 個疫區(qū)共采樣743 份抗凝血；同時3 個受威脅區(qū)的規(guī)模場及散養(yǎng)戶進行同樣數(shù)量的抽樣監(jiān)測，昭蘇縣采集1 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)4 個村，鞏留縣1 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)5 個村，特克斯縣采集2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，3 個受威脅區(qū)各采集30 份抗凝血共90 份。

1.4 組織病理學(xué)檢查

切取一塊2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm 大小，并經(jīng)病原學(xué)檢測為陽性的樣品，以10%甲醛和95%乙醇固定，經(jīng)各種濃度乙醇脫水2 h；二甲苯透明處理，將透明好的組織塊放入石蠟中包埋；修整蠟塊后切片，將切好的組織蠟片用眼科鑷平鋪在40～45 ℃的水面上；用載玻片撈取后，傾去余水，再置入60～65 ℃恒溫箱內(nèi)烤片，最后進行HE 染色和封片。

1.5 血清學(xué)檢測

通過檢測牛血清中LSD 病毒抗體來判定是否感染。根據(jù)羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒的規(guī)程進行操作，檢測牛血清中LSD 病毒抗體，共檢測牛血清46 份。

1.6 病原學(xué)診斷

將采集的發(fā)病牛皮膚以及睪丸、乳頭、鼻腔等部位結(jié)節(jié)以及病死牛肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等臟器的12 份樣品，在生物安全柜中進行處理、研磨；用磁珠法在核酸提取儀中提取病毒DNA，熒光PCR 方法進行擴增。具體方法：在生物安全柜中處理、研磨后，將研磨液離心吸取上清，提取DNA，使用中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供的LSDV 熒光探針、引物，以及商品化的DNA 病毒熒光PCR 反應(yīng)液，根據(jù)聶福平等[4]建立的LSDVTaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法對提取的DNA開展熒光PCR 擴增。

LSD 疫情解封時，對采集的833 份牛全血樣本及蚊蟲樣品同樣按照上述方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

在伊犁州察布查爾縣、霍城縣的疫點可觀察到：患病牛精神倦怠、消瘦、體溫升高；皮膚出現(xiàn)非常堅硬的丘疹或圓形凸起的結(jié)節(jié)，用手觸碰病牛結(jié)節(jié)，病牛疼痛難忍；除全身皮膚結(jié)節(jié)外，在母牛會陰、乳頭部位，公牛睪丸部位，鼻腔內(nèi)部、嘴唇周邊都能看到大小不等的結(jié)節(jié)（圖1～3）。結(jié)節(jié)直徑約1～7 cm，厚度約1～3 cm。

2.2 剖檢病理變化

圖1 牛腹部兩側(cè)皮膚表面結(jié)節(jié)[5]

圖2 牛大腿外側(cè)皮膚結(jié)節(jié)[5]

圖3 牛乳房表面結(jié)節(jié)

剖檢病死牛發(fā)現(xiàn)，長疙瘩處的臟器皮內(nèi)腫脹，心肌條狀、點狀出血，肝臟、脾臟出血，膽囊脹大充盈、出血，脾臟質(zhì)地變硬，真胃黏膜出血，小腸、大腸黏膜點狀出血，腸系膜淋巴結(jié)出血，頜下淋巴結(jié)腫大，肺臟出血。觀察現(xiàn)場采集的發(fā)病牛皮膚結(jié)節(jié)樣品發(fā)現(xiàn)，皮膚腫脹部位有明顯凸起，皮膚結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)出血，并有膠凍樣病變（圖4～5）。通過臨床癥狀和剖檢病理變化，初步判定為疑似LSD。

圖4 牛結(jié)節(jié)性皮膚塊外側(cè)

圖5 牛結(jié)節(jié)性皮膚塊內(nèi)側(cè)

2.3 皮膚結(jié)節(jié)病理切片觀察

在顯微鏡下觀察皮膚結(jié)節(jié)病理切片發(fā)現(xiàn)，肌肉間結(jié)締組織出現(xiàn)增生性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)可見成纖維細胞和膠原組織，結(jié)節(jié)周圍有結(jié)締組織包囊形成及結(jié)節(jié)周圍有淋巴細胞浸潤（圖6）。此外，還可觀察到表皮毛囊周圍組織間隙淋巴細胞浸潤，毛囊腺體腫脹、空泡化，真皮層肌肉組織壞死，且壞死區(qū)大量淋巴細胞浸潤（圖7）。

2.4 血清學(xué)檢測

用羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA試劑盒，對46 份發(fā)病牛血清進行LSDV 抗體檢測。結(jié)果顯示，16 份樣品LSDV 抗體陽性，陽性檢出率為34.78%。

圖6 病變組織病理橫切片

圖7 病變組織病理縱切片

2.5 病原學(xué)檢測

2.5.1 發(fā)病牛結(jié)節(jié)樣品熒光PCR 檢測 對采集的12 份病原樣品（皮膚、睪丸、鼻腔、乳頭結(jié)節(jié)以及剖檢病死牛的肺臟、淋巴結(jié)等臟器）進行熒光PCR 擴增。結(jié)果（圖8）顯示，所有樣品均為LSDV 核酸陽性。經(jīng)國家外來動物疫病研究中心確診，伊犁州察布查爾縣的部分牛感染LSDV。

圖8 發(fā)病牛樣品LSDV 熒光PCR 擴增結(jié)果

2.5.2 解封后所采集樣品熒光PCR 檢測 參照二類動物疫病防治技術(shù)規(guī)范要求，相關(guān)機構(gòu)對疫區(qū)實施了為期42 d 的疫情封鎖。解封時，在伊寧縣、霍城縣、察布查爾縣選擇疫點、疫區(qū)、受威脅區(qū)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村，開展抽樣監(jiān)測，進行風(fēng)險評估。通過實地察看，按照30%的比例全覆蓋抽樣，采集?？鼓耙唿c周邊活動的蚊蟲樣品共833 份。對上述樣品開展LSDV 熒光PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品檢測均呈陰性（圖9）。

圖9 解封樣品LSDV 熒光PCR 檢測結(jié)果

3 疫情處置

3.1 嚴格處置確診疫情，控制疫情擴散

一是撲殺陽性同群牛，限制同群牛移動（出牧場或出戶），禁止疫情縣活牛調(diào)出，禁止發(fā)病區(qū)域牛進出和流通，疫情發(fā)生前1 個月內(nèi)生產(chǎn)的牛皮需鞣制成皮革方可調(diào)出。二是對疫點、掩埋場點、運輸車輛嚴格清洗消毒。每次裝運前進行消毒，運后再次清洗消毒，用次氯酸鈉，按照由里向外、自上而下、從前到后的順序清除牛糞、飼料等污物，清洗后晾干，再噴霧消毒。三是定期開展流行病學(xué)調(diào)查，查明疫情來源和可能傳播去向，并對出現(xiàn)疑似疫情的周邊區(qū)域等相關(guān)場地進行持續(xù)排查，及時消除疫情隱患。現(xiàn)場查看養(yǎng)殖、防疫、無害化處理等相關(guān)記錄，持續(xù)監(jiān)測，形成流調(diào)報告，并提出相關(guān)防控指導(dǎo)意見和疫情處置措施。四是加強聯(lián)防聯(lián)控，重點排查與哈薩克斯坦交界的相關(guān)縣市，要求牛只遠離邊界草場放牧，發(fā)現(xiàn)病畜及時上報、隔離、消毒，同時采取殺滅昆蟲等措施，防止疫情進一步擴散。五是積極宣傳。組織邊境縣各鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）落實好宣傳等工作，防止出現(xiàn)恐慌，影響社會穩(wěn)定。

3.2 用山羊痘疫苗緊急免疫

為杜絕疫情再次發(fā)生和蔓延，采用國家批準的山羊痘疫苗（按山羊5 倍劑量）對病牛所在的縣及其相鄰縣（市）全部牛只開展免疫，免疫程序按照農(nóng)牧發(fā)〔2019〕26 號文件要求執(zhí)行。在政策允許的前提下，將免疫區(qū)域擴大到與新疆相鄰省份，以確保不發(fā)生新的LSD 疫情。伊犁州3 個市、縣解除封鎖時，于9 月下旬采樣，采集牛樣品、環(huán)境蚊蟲，開展LSD 實時熒光PCR 檢測[4]，發(fā)現(xiàn)所有采集樣品包括蚊蟲全部為陰性（圖9）。后期還要做好LSD 專項監(jiān)測與排查工作（尤其在每年4—10 月），可通過血清學(xué)（ELISA）和病原學(xué)（PCR）檢測，重點對伊犁州及全疆其他縣市調(diào)入調(diào)出的牛群開展監(jiān)測，防止疫情再次發(fā)生。

4 討論

為及時查明此次疫情的感染源，通過察看臨床癥狀、剖檢病理變化以及結(jié)合發(fā)病時間（7 月底至8 月上旬蚊蟲肆虐期），初步判定該疫情為疑似LSD。隨后采集發(fā)病牛的鼻腔、乳頭等部位結(jié)節(jié)和發(fā)病牛血清，開展病原學(xué)、血清學(xué)檢測。熒光PCR 檢測病原樣品發(fā)現(xiàn)LSDV 核酸陽性；羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒檢測發(fā)病牛血清，發(fā)現(xiàn)LSDV 抗體陽性。經(jīng)國家外來動物疫病研究中心檢測，送檢的疑似病料確診為LSDV核酸陽性，這是我國首次確診發(fā)現(xiàn)LSD 病例。

在LSD 流行的非洲等國家，該病的檢測技術(shù)主要有病原分離鑒定、常規(guī)血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測[6]。本文利用靈敏度高、特異性強的熒光PCR 方法開展LSDV 分子生物學(xué)檢測，利用雙抗原夾心ELISA 開展發(fā)病初期血清學(xué)檢測，結(jié)合臨床癥狀、病理變化等輔助手段對LSD 進行快速診斷，并在疫情確診后對疫區(qū)實施了封鎖等一系列處置措施。在疫區(qū)解封后采集樣品開展檢測，發(fā)現(xiàn)所有樣品均呈陰性，說明處置措施得當、有力，有效遏制了該病的傳播，后期持續(xù)臨床監(jiān)測顯示也沒有新的疫情發(fā)生。此外，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定并印發(fā)了《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防控知識手冊》等文件，今后也須盡快制定其他LSD 相關(guān)國家或行業(yè)標準，為檢測、防控、消除LSD 做好技術(shù)支撐。