陸春禮，黃百花，黃寶學(xué)，蒙振畝，農(nóng)愛紅，劉宏梅，李雪珍，譚光明

（1.百色市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西百色 533000；2.田東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西田東 531500；3.德保縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西德保 533700）

德保豬，也稱德保黑豬，因體格健壯、適應(yīng)性好、耐粗飼料、抗病力強(qiáng)、繁殖力高、胴體品質(zhì)好、肉色鮮紅、味美清香，而享譽(yù)區(qū)內(nèi)外。1985 年，德保黑豬入選廣西家畜家禽品種志，與陸川豬、隆林豬、桂中花豬、環(huán)江香豬、巴馬香豬、全州東山豬等并列成為廣西七大地方豬種，2009 年列入廣西壯族自治區(qū)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄。2014 年以來，為給德保黑豬產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供純正的種源，德?？h編制頒布了廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《德保豬》，指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）按照標(biāo)準(zhǔn)做好德保黑豬的保種繁育技術(shù)推廣應(yīng)用工作。2017 年以來，德保黑豬飼養(yǎng)量一直保持快速上升趨勢(shì)，其中2017 年7 068 個(gè)場(chǎng)戶飼養(yǎng)5.053 5 萬頭，2018 年7 089 個(gè)場(chǎng)戶飼養(yǎng)5.208 3 萬頭，2019 年7 138 個(gè)場(chǎng)戶飼養(yǎng)6.012 5 萬頭，2020 年7 215 個(gè)場(chǎng)戶飼養(yǎng)8.061 6 萬頭。為推動(dòng)德保黑豬產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，德保縣加大豬主要疫病的免疫與防控力度。為了解德保黑豬主要疫病的防控和免疫效果，2018—2020 年釆集166 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的病死德保黑豬樣品進(jìn)行非洲豬瘟（ASF）、豬瘟（CSF）、口蹄疫（FMD）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）、豬偽狂犬?。≒R）、豬圓環(huán)病毒?。≒CV-2）、豬支原體?。≒PLO）、豬傳染性胸膜肺炎（PCP）、豬鏈球菌?。⊿S）、豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）等11 種疫病的病原學(xué)PCR 檢測(cè)，2017—2020 年采集臨床健康德保黑豬血清樣品進(jìn)行FMD、CSF、PRRS 等疫病的ELISA 免疫抗體檢測(cè)，以期為德保黑豬針對(duì)性綜合防控措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2018—2020 年，在12 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機(jī)采集166 個(gè)德保黑豬場(chǎng)點(diǎn)（包括規(guī)模場(chǎng)、散養(yǎng)戶）病死豬的淋巴結(jié)、扁桃體和肺臟樣品以及疑似PED 和TGE 豬的病變小腸組織和糞便樣品，共計(jì)300 份，其中2018 年46 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)100 份，2019年54 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)100 份，2020 年66 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)100 份，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)每年3～6 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，每個(gè)場(chǎng)點(diǎn)1～2 份樣品。2017—2019 年，在每年春秋兩防集中免疫1 個(gè)半月后，在德?？h12 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)10 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，1 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)每次采集2 份經(jīng)CSF、FMD 和PRRS 免疫的德保黑豬血清樣品行抗體檢測(cè)，每年240 份，共采集720 份；2020 年隨機(jī)選擇5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)10 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，每個(gè)場(chǎng)點(diǎn)2 份，共采集120 份血清。

1.1.2 試劑 20T、40T、64T 動(dòng)物疫病病毒RNA/DNA 提取試劑盒，西安天隆科技有限公司生產(chǎn)；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Rnasin、DL 2 000 DNA Marker，天根生物科技有限公司生產(chǎn)；50T Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒，TaKaRa公司生產(chǎn)；pH7.4 的PBS 緩沖液、0.5 g/mL 溴化乙錠、6×Loading Buffer、50×TAE，北京世紀(jì)元亨防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖，BIOWEST 公司生產(chǎn)；非洲豬瘟熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，青島立見公司生產(chǎn)；口蹄疫O 型液相阻斷ELISA 試劑盒，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，西班牙海博萊公司生產(chǎn)；豬瘟抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒，西班牙海博萊公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 TissueLyser II 型組織研磨儀，德國QIAGEN 公司生產(chǎn)；NP968-C 型全自動(dòng)核酸提取儀，西安天隆科技有限公司生產(chǎn)；BSC-1000-II-A2 型二級(jí)生物安全柜，蘇州瑞威凈化科技有限公司生產(chǎn)；單道、多道移液器（10、100、200、1 000 μL），艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；LightCycler 96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)；Biometra MyCycler 型PCR 儀，美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)；BioDoc-IT2 凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司生產(chǎn)；DF-C11 型電泳儀、北京東方特力科貿(mào)中心公司生產(chǎn)；LabServ K3 型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Wellwash 型自動(dòng)洗板機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 DNA 和RNA 模板制備 取10 g 病料組織，用手術(shù)剪剪碎，放于滅菌干燥的2 mL EP 管中，加入1 mL 生理鹽水及3 顆經(jīng)滅菌的鋼珠后，放到組織研磨儀搗碎，12 000 r/min 離心2 min，抽取上清200 μL 放入自動(dòng)核酸提取盒中并加入20 μL 蛋白酶K，自動(dòng)抽提30 min。將抽提到的核酸，一部分用于cDNA 合成，一部分作為DNA 模板直接用于DNA 病毒擴(kuò)增。

1.2.2 PCR、RT-PCR 及熒光PCR FMD、CSF、PRRS、PR、PCV-2、PPLO、SS、PED、TGE 檢測(cè)分別采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27528—2011、GB/T 27540—2011、GB/T 35912—2018、GB/T 35911—2018、GB/T 35901—2018、GB/T 35909—2018、GB/T 19915.7—2005、GB/T 36871—2018；PCP 檢測(cè)采用地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T 2310—2016；ASF 檢測(cè)采用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)TaqMan PCR 程序。按照上述標(biāo)準(zhǔn)方法配置PCR、RT-PCR 及熒光PCR 體系，并按相應(yīng)的說明書進(jìn)行模板擴(kuò)增。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物分析 PCR、RT-PCR，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果；使用DL 2 000 DNA Marker 作為分子標(biāo)記，擴(kuò)增出與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)一樣大小的目的片段，判為病原核酸陽性。熒光PCR，按照擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，得出與說明書上一致的S 曲線，且Ct ≤35，判為病原核酸陽性。

1.2.4 抗體檢測(cè) 按照各類疫病相應(yīng)的抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并在酶標(biāo)儀上讀數(shù)和判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示：病死德保黑豬PCV-2 樣品陽性檢出率最高，為68.3%，場(chǎng)點(diǎn)陽性檢出率為81.3%；PRRS、PR、PED、PPLO、SS 等疫病病原的樣品陽性檢出率較低，分別為1.7%、1.0%、1.0%、0.3%、0.3%，場(chǎng)點(diǎn)陽性檢出率分別為3.0%、1.8%、1.8%、0.6%、0.6%；ASF、CSF、FMD、PCP、TGE 等疫病病原均未檢出陽性。病原陽性樣品中，有4 份樣品同時(shí)檢出2 種病原陽性，占檢測(cè)樣品總數(shù)的1.3%，分別為“PCV-2+SS”陽性1 份、“PCV-2+PPLO”陽性1份、“PCV-2+PR”陽性2 份。

表1 2018—2020 年德保黑豬主要疫病病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì) %

2.2 血清抗體檢測(cè)

血清抗體檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：2017—2020年，CSF 抗體陽性率最高，平均為95.8%；FMD、PRRS 抗體陽性率偏低，分別為79.3%、73.2%，且抗體陽性率不穩(wěn)定，變化起伏較大，部分年份低于規(guī)定要求（不低于70%）。

表2 2017—2020 年德保黑豬3 種疫病的血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 德保黑豬疫病防控效果總體較好

近年來，在國家強(qiáng)制免疫政策和各地高度重視落實(shí)各項(xiàng)防控措施的大背景下，德保黑豬主要疫病防控水平穩(wěn)步提高，豬群疫情整體平穩(wěn)。本次檢測(cè)未在病死豬中檢出ASF、CSF、FMD、PCP、TGE 等5 種疫病病原，且PRRS、PR、PED、PPLO、SS 等疫病的病原陽性檢出率也較低，均在1.7%以下，說明這些疫病在德保黑豬群中不斷得到控制和凈化，表明地方政府采取的防控措施取得了明顯效果。這為今后德保縣開展星級(jí)無規(guī)定疫病凈化工作奠定了基礎(chǔ)。

3.2 PCV-2 感染較為嚴(yán)重

從病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果可以看出，PCV2 在德保黑豬群中流行較為普遍，是德保黑豬發(fā)病死亡的主要病因之一。2000 年有學(xué)者首次報(bào)道國內(nèi)豬群存在PCV-2 感染[1]，隨后發(fā)現(xiàn)國內(nèi)PCV-2 感染相當(dāng)普遍[2]；李金鳳等[3]2017 年對(duì)來自廣西不同地區(qū)的80 份豬肺臟樣品進(jìn)行PCV-2 核酸檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染率為43.8%；李曉紅等[4]2013—2016 年對(duì)采自云南省芒市11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)未接種PCV-2 疫苗的豬血清1 472 份進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果檢出率為44.6%；劉浩等[5]2013 年9 月—2014 年6 月對(duì)陜西省漢中市15 個(gè)規(guī)模場(chǎng)生豬進(jìn)行PCV-2 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品陽性率為75.6%，場(chǎng)群陽性率為100%。在飼養(yǎng)條件差及管理欠佳的豬場(chǎng)，PCV-2 更容易傳播和擴(kuò)散[6-7]。德保黑豬飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)較差、管理落后，這也是德保黑豬極易感染PCV-2 的主要原因。為了減少PCV-2 引起的危害，建議規(guī)模豬場(chǎng)根據(jù)實(shí)際情況使用PCV-2滅活疫苗進(jìn)行免疫，并主動(dòng)開展跟蹤監(jiān)測(cè)，對(duì)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果呈陽性的，立即采取隔離或淘汰措施，逐步降低自然感染率；同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，控制良好的飼養(yǎng)環(huán)境，以降低患病風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 多種病原混合感染依然存在

病原學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有4 份樣品同時(shí)檢出2 種病原，主要是PCV-2 與其他病原混合感染。施開創(chuàng)等[8]檢測(cè)了694 份采自廣西地區(qū)的豬組織樣品，發(fā)現(xiàn)2 種病原混合感染率為35.1%，3 種病原混合感染率為4.0%；崔新格等[9]對(duì)2017—2018 年河南省255 份病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PED 分別與豬冠狀病毒（PDCoV）、TGE 的混合感染率為14.1%、2.4%，3 種病原混合感染率為2.0%。上述研究表明，豬群中的多病原混合感染較為普遍，這也是引起豬群發(fā)病和死亡的重要原因。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，PCV-2 多為隱性感染，很少表現(xiàn)臨床病癥。本次檢測(cè)的樣品均來自病死豬群，PCV-2 檢出率較高，暗示導(dǎo)致豬群發(fā)病死亡的還有其他病原的混合感染。為防止生豬發(fā)生混合感染，應(yīng)制定科學(xué)合理的綜合防控措施。

3.4 部分疫病免疫質(zhì)量不穩(wěn)定

本次血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CSF 免疫效果較好，免疫抗體陽性率平均為95.8%，但FMD、PRRS 免疫效果不理想，不同年份的抗體陽性率變化起伏較大，部分年份低于規(guī)定要求（70%）。譚光明等[11]研究德?？h生豬FMD、CSF、PRRS 3 種疫苗不同免疫程序的應(yīng)用效果，認(rèn)為疫苗免疫效果不均衡主要原因有幾方面：一是有不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)采用的免疫程序不一樣；二是德?？h部分動(dòng)物防疫員習(xí)慣將免疫與閹割同時(shí)進(jìn)行，從而導(dǎo)致機(jī)體疫苗應(yīng)答效果不佳；三是存在一些免疫抑制病。司興奎等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 感染確實(shí)可以影響FMD、PRRS 疫苗的免疫效果。因此，推測(cè)PCV-2 感染可能是德保黑豬FMD、PRRS抗體陽性率較低且不平衡主要原因。

4 結(jié)論

檢測(cè)認(rèn)為：德保黑豬主要疫病防控效果較好，除PCV-2 感染外，其他疫病得到有效控制；PCV-2感染是導(dǎo)致德保黑豬發(fā)病死亡的主要病因之一，也是導(dǎo)致FMD、PRRS 免疫水平不穩(wěn)定的主要因素，需要重點(diǎn)加強(qiáng)控制。