宋淑敏 魏連會 董 艷 石 杰 潘 靜 高 媛

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，大慶 163319)

高血脂是引發(fā)心腦血管疾病的主要誘因，嚴重危害人體健康。根據(jù)資料報道，中國成人血脂異常總體患病率已高達40.4%[1]。他汀類藥物是目前治療高膽固醇血癥的常用藥物。但長期使用降血脂藥物會導(dǎo)致肌痛、肝腎損傷、過敏反應(yīng)等副作用[2]。因此，從天然產(chǎn)物中獲取具有降脂功能的活性物質(zhì)是國內(nèi)外學(xué)者研究的重要課題。食品中某些組分通過結(jié)合膽汁酸(鹽)，并排出體外，阻止膽汁酸的重吸收，可促使血漿及肝臟中的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而使血漿中的膽固醇含量下降，起到降血脂的效果[3]。已有研究表明來源于植物的多肽具有顯著的降血脂作用。Yoshie-Stark等[4]研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆蛋白及其酶解產(chǎn)物對膽汁酸具有一定的束縛作用。Kongo-Dia-Moukala等[5]研究表明玉米蛋白經(jīng)過不同的蛋白酶消化后與膽酸鹽的結(jié)合能力不同，但結(jié)合能力最強的大部分肽的分子質(zhì)量為180～500 u。黃昆[6]研究山杏仁活性多肽濃度對膽酸鹽吸附能力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著多肽濃度的增加，膽酸鹽吸附率逐步增強 。于娜[7]進行了卵黃多肽降血脂活性研究，通過體外降血脂實驗篩選出降血脂較強的組分EYP-4，經(jīng)HSCCC制備分離得到的三個組分，利用納升電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Nano-ESI-Ms/Ms)技術(shù)進行質(zhì)譜分析，3個組分的氨基酸排列順序分別為Lys-Glu-Pro-Ile、His-Ile-Pro-Leu和Lys-Glu-Tyr。由此可見，生物活性肽具有輔助的降血脂功效，蛋白多肽來源及肽段結(jié)構(gòu)決定多肽降脂肽活性的強弱。

漢麻(CannabissativaL.)又稱為工業(yè)大麻，在我國也稱為火麻，是大麻科大麻屬一年生草本植物。漢麻籽含有25%～35%脂肪，20%～25%蛋白質(zhì)，20%～30%碳水化合物，并含有膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等[8，9]。漢麻籽蛋白含有21種氨基酸，其中精氨酸含量高于一般的植物蛋白，漢麻蛋白中的65%為麻仁球蛋白，35%為白蛋白。與大豆蛋白相比，漢麻籽蛋白不含有致敏因子，更易于消化，因此漢麻籽是一種優(yōu)異的蛋白質(zhì)來源[10]。漢麻籽不僅營養(yǎng)價值較高，而且還具有很好的醫(yī)療功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》《日用本草》《本草綱目》等都對漢麻籽的藥效做了介紹，2002年火麻仁(漢麻仁)已列入我國藥食同源目錄中，這些都說明了漢麻籽在功能食品、醫(yī)藥等方面有巨大的應(yīng)用價值[11，12]。李永進等[13]研究了火麻仁蛋白對小鼠抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)功能的影響。叢濤等[14]進行了火麻仁蛋白質(zhì)粉對生長期大鼠營養(yǎng)生理功能的影響研究，結(jié)果表明火麻蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)血糖、血脂和血小板水平,促進腦組織發(fā)育等作用,是一種有益健康的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)資源。迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于漢麻籽多肽方面的研究報道較少，國內(nèi)在漢麻籽多肽制備工藝[15]、漢麻籽多肽抗氧化[16]、漢麻籽多肽降血糖[17]等研究方面已取得進展，而有關(guān)漢麻籽多肽降血脂活性研究還鮮見報道。

本研究在前期復(fù)合酶法制備漢麻籽多肽研究的基礎(chǔ)上，通過漢麻籽多肽體外降血脂作用及其序列分析，探討漢麻籽多肽降血脂活性與氨基酸組成的關(guān)系，以期為漢麻降脂肽構(gòu)效關(guān)系的深入研究以及漢麻降脂肽在功能食品、醫(yī)藥中的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽多肽：采用復(fù)合酶解法制備；木瓜蛋白酶(酶活力為8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為 1.3×105U/g)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糠醛、硫酸、 CHCA、乙腈、三氟乙酸。

1.2 儀器與設(shè)備

VFD-6000型真空冷凍干燥機，HA221-50-06型超臨界CO2萃取設(shè)備，BIOQ-MU1000型切向膜過濾系統(tǒng)，紫外可見分光光度計， 4 800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer(AB SCIEX)，Q-Exactive質(zhì)譜儀，Easy nLC1000納升級液相色譜儀，真空離心濃縮儀。

1.3 方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽的制備

稱取一定質(zhì)量的漢麻籽蛋白，按照1∶10料液比加入蒸餾水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時間為3 h。酶解結(jié)束后，將酶解液進行水浴(95 ℃)滅酶。將酶解得到的漢麻蛋白酶解液，采用超濾系統(tǒng)，用截留分子質(zhì)量為1、3、5 ku的過濾膜進行分離純化，截留4種不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽如表1所示，將漢麻籽多肽混合液及4種不同分子質(zhì)量多肽液分別冷凍干燥，制得的多肽凍干粉放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽各個組分分子質(zhì)量

1.3.2 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別稱取膽酸鹽0、 40、80、120、160、200 mg 置于100 mL 棕色容量瓶中，用去離子水定容，配成膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用糠醛顯色法測定膽酸鹽的含量[18]，分別取各濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加入 40% H2SO4溶液6 mL，搖勻，加入1%糠醛溶液1 mL，混勻，60 ℃溫育40 min，待溫度降到室溫后，于620 nm波長處測吸光值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 模擬體外消化環(huán)境研究不同濃度漢麻籽多肽結(jié)合膽酸鹽能力

1.3.3.1 人工胃液的配制

按《中國藥典》2010版[19]的方法，取稀鹽酸16.4 mL,加入800 mL去離子水，再加入10 g胃蛋白酶，搖勻后，加水定容至1 000 mL,冷藏備用。

1.3.3.2 人工腸液的配制

按《中國藥典》2010版[19]的方法，稱取磷酸二氫鉀6.8 g,用去離子水500 mL溶解，用0.1 mol/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，另取10 g胰酶加水溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL,冷藏備用。

1.3.3.3 不同濃度的多肽結(jié)合膽酸鹽[20]的能力。稱取一定質(zhì)量的漢麻籽蛋白，按照1∶10料液比加入蒸餾水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH為5.0，酶解溫度為70 ℃，酶解時間為3 h。酶解結(jié)束后，將酶解液進行水浴(95 ℃)滅酶。將酶解得到的漢麻蛋白酶解液進行分離純化，制備漢麻籽多肽液。量取不同濃度(0、25、50、75、100、125 mg/mL)漢麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化1 h 。用0.1 mol/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，加入2 mL人工腸液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化 1 h 。分別加入2 mL(2 mg/mL)的膽酸鹽，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩1 h。 8 000 r/min 離心10 min。準(zhǔn)確移取 2 mL上清液，按照膽酸鹽的測定中糠醛顯色法測定 620 nm 波長處吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其膽酸鹽的質(zhì)量濃度。再根據(jù)反應(yīng)前后溶液中膽酸鹽的濃度差計算漢麻籽多肽對膽酸鹽的吸附量。

吸附率=(P1-P2)/P1×100%

式中：P1為膽酸鹽溶液的初始質(zhì)量濃度/mg/mL；P2為吸附后膽酸鹽溶液的質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.3.4 不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽降血脂作用研究

量取100 mg/mL不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化1 h。用0.1 mol/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，加入2 mL人工腸液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化 1 h。分別加入2 mg/mL的膽酸鹽2 mL，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩1 h。 8 000 r/min 離心10 min。準(zhǔn)確移取2 mL上清液，按照膽酸鹽的測定中糠醛顯色法測定 620 nm 波長處吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其膽酸鹽的質(zhì)量濃度。再根據(jù)反應(yīng)前后溶液中膽酸鹽的濃度差計算漢麻籽多肽對膽酸鹽的吸附量。根據(jù)多肽吸附膽酸鹽能力，篩選出降血脂最強的多肽組分。

1.3.5 降脂較強的漢麻籽多肽組分的分子質(zhì)量分布測定

采用MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀進行分子質(zhì)量分布測定，取降血脂最強的多肽組分樣品復(fù)溶于0.1% TFA(三氟乙酸)/30%CAN(乙腈)水溶液中，離心取上清1 μL 點至樣品靶上，自然干燥后，再取1 μL CHCA 基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(4 700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。

采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品Calibration Mixture 1 進行外標(biāo)一級校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于0.5 u；采集圖譜條件：反射掃描模式一級質(zhì)譜(MS)掃描范圍：100～4 000m/z，每張譜圖累加500 個Laser Shots。

1.3.6 降脂較強的漢麻籽多肽組分的氨基酸序列分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[21]對降脂較強的多肽組分進行氨基酸序列分析

1.3.6.1 脫鹽

樣品(降血脂最強的漢麻多肽組分)用1 mL 0.1%TFA復(fù)溶；C18柱內(nèi)加入1 mL乙腈，洗脫； C18柱內(nèi)加入1 mL 0.1%TFA水，洗脫； C18柱內(nèi)加入樣品，洗脫； C18柱內(nèi)加入1 mL 0.1%TFA水，抽干，重復(fù)一次；換1.5 mL新收集管，加入1 mL 70%ACN/0.1%TFA，洗脫， 洗脫液凍干。

1.3.6.2 高效液相色譜

液相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱0.15 mm×150 mm (RP-C18)(Column Technology Inc.)以95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到Zorbax 300SB-C18 peptide traps，再經(jīng)色譜柱分離，相關(guān)液相梯度為：0～50 min，B液線性梯度從4%到50% ；50～54 min，B液線性梯度從50%到100% ；54～60 min，B液維持在100%。

1.3.6.3 ESI 質(zhì)譜鑒定[22]

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細管高效液相色譜脫鹽及分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。檢測方式：正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比每次全掃描后采集10個碎片圖譜。

1.3.6.4 ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

原始文件用Mascot 2.2軟件中的de nava算法分析。相關(guān)參數(shù)為:Enzyme=none、Variable modification：Oxidation(M)，Peptides tolerance：20 ppm，MS/MS tolerance：0.1 u，Mascot結(jié)果過濾參數(shù)為：FDR≤0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用糠醛顯色法，根據(jù)不同濃度膽酸鹽測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

膽酸鈉的線性回歸方程為y=0.281 7x+0.006 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4；

甘氨膽酸鈉的線性回歸方程為y=2.235 5x+0.071 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2；

牛黃膽酸鈉的線性回歸方程為y=0.701 2x+0.044 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7，都具有較好的線性關(guān)系。

2.2 不同質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽結(jié)合膽酸鹽的能力

模擬體外消化道環(huán)境，研究不同質(zhì)量濃度(0、25、50、75、100、125 mg/mL)漢麻籽多肽結(jié)合膽酸鹽的能力。分別吸取各濃度的漢麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化1 h。用0.1 mol/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，加入2 mL人工腸液，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩消化1 h。分別加入2 mL(2 mg/mL)的膽酸鹽，于37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩1 h。 8 000 r/min 離心10 min。準(zhǔn)確移取 2 mL上清液，按照膽酸鹽的測定中糠醛顯色法測定 620 nm 波長處吸光度，計算漢麻籽多肽對膽酸鹽的吸附率。

實驗結(jié)果如圖1所示，漢麻籽多肽質(zhì)量濃度0～100 mg/mL之間，隨著濃度的增加，多肽對3種膽酸鹽的吸附率逐漸增大；當(dāng)質(zhì)量濃度達100 mg/mL時，多肽對3種膽酸鹽的吸附率達到最大值，對膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉的吸附率分別為80.1%、57.3%、28.1%；漢麻籽多肽濃度100～125 mg/mL之間，隨著濃度的增加，多肽對3種膽酸鹽的吸附率逐漸降低。

圖1 不同濃度漢麻籽多肽結(jié)合膽酸鹽能力

2.3 不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽各個組分結(jié)合膽酸鹽能力

將漢麻籽多肽酶解液經(jīng)8 000 r/min，離心15 min，收集上清液。采用切向流過濾系統(tǒng)，對酶解漢麻籽多肽的混合液進行分離，采用超濾膜(截留分子質(zhì)量為1、3、5 ku)對混合液進行分離，得到4種不同分子質(zhì)量的多肽組分，采用真空冷凍干燥機制備不同分子質(zhì)量漢麻多肽凍干粉。各個組分和分子質(zhì)量范圍如表1所示。吸取不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽(100 mg/mL)，模擬體外消化環(huán)境，研究不同分子質(zhì)量多肽對膽酸鹽的結(jié)合能力，實驗結(jié)果如圖2所示。不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽各組分對3種膽酸鹽都具有吸附作用，其中組分H4的對膽酸鹽的吸附能力大于其他3個組分，對膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉吸附率分別為86.08%、57.25%、26.87%，研究結(jié)果表明漢麻籽多肽組分H4(<1 ku)中具有較強降血脂活性。

圖2 不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽各組分結(jié)合膽酸鹽能力

2.4 降脂較強的多肽組分氨基酸序列分析

2.4.1 降脂較強的多肽組分H4(<1 ku)分子質(zhì)量分布

采用MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀進行分子質(zhì)量分布測定，取 1 μL 多肽樣品(<1 ku)點至樣品靶上，自然干燥后，再取 1 μL CHCA 基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品 (4 700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品 Calibration Mixture 1 進行外標(biāo)一級校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差小于0.5 u；采集圖譜條件：一級質(zhì)譜(MS)范圍：100～5 000m/z，每張譜圖累加 500 個 Laser Shots。從H4分子質(zhì)量分布質(zhì)譜圖中可以看出，H4肽段分布豐富，肽段主要集中在400～850 u，其中豐度較高的5個肽段為815.4、733.4、655.3、574.3、513.2 u。

2.4.2 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進行氨基酸序列分析

根據(jù)多肽組分H4(<1 ku)的分子質(zhì)量分布，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，對815.4、 733.4、655.3、574.3、513.2 u的5個峰值較高的肽段進行序列分析，多肽序列分析結(jié)果及質(zhì)譜圖如表2及圖3～圖7所示。5個氨基酸序列中疏水性氨基酸含量較高，并且均含有疏水性氨基酸—亮氨酸，而且5個氨基酸序列末端的氨基酸均是疏水性氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)。活性肽降血脂活性與其疏水性氨基酸的含量有關(guān)[23]。鄭睿[24]從亞麻籽中分離出4種能顯著抑制膽固醇膠束溶解度的多肽，4種多肽的氨基酸序列中含有苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸等疏水性大于10的氨基酸。Lwami等[25]發(fā)現(xiàn)疏水性較強的大豆肽對膽酸鹽的吸附能力較強，并可促進膽固醇的排出。Kagawa等[26]采用酸性蛋白酶對大豆蛋白進行酶解，研究疏水性氨基酸含量高的水解產(chǎn)物可有效的降低血清 TG 含量。劉健敏等[27]研究發(fā)現(xiàn)，大豆肽鏈的 C-末端為亮氨酸殘基，與降膽固醇活性可能有密切的聯(lián)系。因此，推斷漢麻籽多肽的降血脂活性可能與其氨基酸序列中的疏水性氨基酸含量、組成有關(guān)，特別是與其含有的亮氨酸密切相關(guān)。

表2 漢麻肽段氨基酸序列分析結(jié)果

圖3 815.4 u肽段序列質(zhì)譜圖

圖4 733.4 u肽段序列質(zhì)譜圖

圖5 655.3 u肽段序列質(zhì)譜圖

圖6 574.3 u肽段序列質(zhì)譜圖

圖7 513.2 u肽段序列質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

不同分子質(zhì)量的漢麻籽多肽各組分對3種膽酸鹽都具有吸附作用，其中組分H4(<1 ku)對膽酸鹽的吸附能力大于其他3個組分，具有較強的降血脂活性。采用質(zhì)譜分析對漢麻降脂活性最強組分H4(<1 ku)豐度較高的5個峰對應(yīng)的肽段815.4、 733.4、655.3、574.3、513.2 u進行序列測定，氨基酸序列分別為NNGDSPLV、MLPLLF、ELAPLL、SLLEL、LSFF。5個序列中均含有疏水性氨基酸亮氨酸，而且5個氨基酸序列末端的氨基酸均是疏水性氨基酸纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。本研究通過對不同分子質(zhì)量漢麻籽多肽結(jié)合膽酸鹽能力及降脂肽(<1 ku)氨基酸序列分析，推斷漢麻籽多肽降血脂活性與其分子質(zhì)量大小及疏水性氨基酸組成有關(guān)，特別是與序列中的亮氨酸密切相關(guān)。