葛志文 周建新 方 勇 王光宇 邱偉芬

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

稻谷是我國三大主糧之一，在生產(chǎn)、消費(fèi)與安全儲(chǔ)藏方面一直備受關(guān)注[1,2]。安徽省是我國稻谷主產(chǎn)地之一，屬于典型的濕潤區(qū)，高溫高濕氣候增加了儲(chǔ)藏稻谷霉變的風(fēng)險(xiǎn)。此外，稻谷在收獲和運(yùn)輸過程中，與土壤、空氣、水等自然物質(zhì)和機(jī)械接觸，攜帶大量的微生物進(jìn)入儲(chǔ)藏期[3-5]。儲(chǔ)藏過程中適宜的溫濕度環(huán)境，有利的促進(jìn)了真菌的生長繁殖與代謝[6,7]。產(chǎn)毒真菌的存在易導(dǎo)致大量真菌毒素產(chǎn)生，不僅破壞稻谷安全與品質(zhì)，甚至威脅消費(fèi)者健康，引發(fā)致癌、致畸、致突變等病理反應(yīng)[8]。

目前關(guān)于儲(chǔ)藏稻谷真菌區(qū)系的研究，主要采用傳統(tǒng)平板菌落計(jì)數(shù)法和直接計(jì)數(shù)法[9]。然而，只有可培養(yǎng)真菌才能在培養(yǎng)基中生長，但它們僅占真菌總數(shù)的1%左右[10,11]，不能完全反映真菌區(qū)系分布。Illumina MiSeq測(cè)序法由于能對(duì)不同環(huán)境[12]中的真菌群落進(jìn)行全面的檢測(cè)，包括可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)真菌，如植物根際[13,14]，土壤[15,16]，深海沉積物等[17,18]，因此，近年來在多個(gè)領(lǐng)域研究中得到廣泛應(yīng)用。

本研究先后對(duì)新入庫、儲(chǔ)藏1年、儲(chǔ)藏2年及儲(chǔ)藏3年的稻谷樣品進(jìn)行了采集，采用Illumina MiSeq測(cè)序法，對(duì)儲(chǔ)藏稻谷樣品進(jìn)行了DNA總序列測(cè)定，進(jìn)一步全面深入了解不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品真菌群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌屬分布，以期為有效采取稻谷儲(chǔ)藏霉變防控措施，創(chuàng)新防控技術(shù)提供更充分的理論依據(jù)，確保儲(chǔ)藏稻谷的安全與品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

從安徽省國屬糧庫中采集樣品。稻谷在(20±5) ℃和50%±5%相對(duì)溫濕度條件下儲(chǔ)藏，含水量低于12%。先后對(duì)新入庫、儲(chǔ)藏1年、2年以及3年的稻谷樣品通過三層五點(diǎn)法進(jìn)行采集，每個(gè)樣品重復(fù)采集三次，共得12個(gè)樣本。新入庫、儲(chǔ)藏1年、儲(chǔ)藏2年及儲(chǔ)藏3年稻谷樣品分別編號(hào)為S0-1，S0-2，S0-3；S1-1，S1-2，S1-3；S2-1，S2-2，S2-3；S3-1，S3-2，S3-3。

1.1.2 試劑

真菌基因組DNA試劑盒、Miseq v3試劑盒、AgencourtAMPure XP核酸純化磁珠、TransStart?Top Taq DNA Polymerase kit、dNTP mix。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Eppendorf 5810R離心機(jī)，WH-2微型旋渦混合儀，AB 2720 Thermal Cycler，Invitrogen qubit3.0分光光度計(jì)，安捷倫2100 生物分析儀，Nanodrop 2000檢測(cè)儀，光照測(cè)序儀，ABI 2720型熱循環(huán)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取步驟按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書完成，將提取的總DNA加入到50 μL緩沖液中，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。擴(kuò)增真菌ITS 1區(qū)所選用的引物為：ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。每個(gè)樣本擴(kuò)增三次，以標(biāo)準(zhǔn)真菌基因組DNA混合物作為陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)25 次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。將所得PCR產(chǎn)物在Illumina MiSeq臺(tái)式測(cè)序機(jī)上運(yùn)行。

1.3.2 操作分類單位聚類和物種注釋

對(duì)下機(jī)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，以獲得高質(zhì)量序列[19]。通過UPARSE軟件將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。每個(gè)OTU選擇對(duì)應(yīng)的代表序列，進(jìn)行物種注釋。

1.3.3 多樣性和統(tǒng)計(jì)分析

以O(shè)TU數(shù)量，Chao 1指數(shù)，ACE指數(shù)，Shannon指數(shù)，Simpson指數(shù)和覆蓋度為指標(biāo)，分析各樣品的α多樣性。參照Ramette[20]的方法，通過主成分分析比較樣品間β多樣性，根據(jù)樣本OTU繪制各分類水平物種豐度圖及熱圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用 Excel 2016 和 Origin 8.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，擴(kuò)增子測(cè)序共產(chǎn)生2 071 941個(gè)序列數(shù)，序列平均長度為242.49 bp，統(tǒng)計(jì)有效數(shù)據(jù)見表1。S0稻谷樣品有效序列數(shù)最大，其優(yōu)化序列數(shù)占比也最高，達(dá)98.46%；S1稻谷樣品的序列數(shù)次之，S2稻谷樣品的序列數(shù)最少，優(yōu)化序列數(shù)占比分別為98.38%、97.38%；S3稻谷樣品的序列數(shù)較S2稻谷樣品序列數(shù)略有增加，優(yōu)化序列數(shù)占比為97.83%。S2序列數(shù)與S0、S1、S3序列數(shù)差異顯著(P<0.05)，表明儲(chǔ)藏期真菌群落數(shù)量在儲(chǔ)藏期逐漸減少后又有所增加。

表1 不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品DNA擴(kuò)增序列統(tǒng)計(jì)

根據(jù)物種生物學(xué)理論，將稻谷樣品中微生物種類分為界、門、綱、目、科、屬、種六個(gè)等級(jí)，如表2，每列表示樣品在對(duì)應(yīng)分類學(xué)水平上的OTU個(gè)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)分類學(xué)水平上，S0稻谷真菌群落中微生物種類對(duì)應(yīng)最多，而S3稻谷真菌群落中微生物種類數(shù)最少，整體順序?yàn)镾0>S2>S1>S3，且S0與S2，S1與S3之間差異不顯著，表明儲(chǔ)藏過程中真菌群落物種數(shù)發(fā)生變化，與儲(chǔ)藏年限不成正相關(guān)，隨儲(chǔ)藏年限增加群落物種數(shù)趨向減少。

表2 不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品物種注釋統(tǒng)計(jì)分析

2.2 儲(chǔ)藏稻谷真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)分析

Shannon-Wiener曲線用于反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性及樣品中物種的豐富程度，如圖1所示，以抽取的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)真菌群落物種多樣性。曲線已趨向平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量已接近飽和，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息[21]。

圖1 四種不同儲(chǔ)藏稻谷以97%同源性O(shè)TU聚類的Shannon-Wiener曲線

表3中比較了12個(gè)儲(chǔ)藏稻谷樣品的樣本序列在文庫中的覆蓋度，最低為0.997 7，最高達(dá)到0.998 8，表明測(cè)序結(jié)果能表達(dá)樣品的完整多樣性。Chao1、ACE反映了不同年限儲(chǔ)藏稻谷樣品真菌群落的物種豐富度差異，比較知S0稻谷真菌群落的Chao1和ACE值均最大，表明其真菌群落物種豐富度最大，S3稻谷真菌群落物種豐富度最小。Shannon指數(shù)越大，表明真菌群落的物種多樣性越大，Simpson指數(shù)則與之相反。S0稻谷真菌群落的Shannon多樣性指數(shù)值為3.29，Simpson指數(shù)值為0.079。稻谷儲(chǔ)藏1年后，其真菌群落物種多樣性有所下降，達(dá)3.17，儲(chǔ)藏期延長，其真菌群落種類先增加后減少。S2稻谷真菌群落Shannon多樣性指數(shù)最大，平均值達(dá)3.38，對(duì)應(yīng)的Simpson指數(shù)最小，為0.067。在儲(chǔ)藏3年后，真菌群落物種多樣性大大降低，Shannon多樣性數(shù)值僅為2.08。正如前人研究[22]，稻谷新入庫時(shí)攜帶大量田間真菌，微生物群落種類豐富，在進(jìn)入儲(chǔ)藏期后，田間真菌逐漸被儲(chǔ)藏真菌替代，儲(chǔ)藏真菌逐漸增加。但因儲(chǔ)藏條件的控制，儲(chǔ)藏真菌生長受到抑制，隨儲(chǔ)藏年限的增加而不斷減少[23，24]。

表3 儲(chǔ)藏稻谷真菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

2.3 儲(chǔ)藏稻谷真菌群落組成與多樣性分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果及物種注釋結(jié)果，在屬和種水平上對(duì)物種結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并構(gòu)建對(duì)應(yīng)的豐度譜。按生物分類學(xué)，4種儲(chǔ)藏稻谷真菌群落可分為5個(gè)門、24個(gè)綱、69個(gè)目、132個(gè)科、232個(gè)屬，336個(gè)種。

由圖2可知，不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品的菌屬結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度比各有不同。S0稻谷樣品中假絲酵母菌屬(Candida)，內(nèi)生菌屬(Hypocreales)，盤蛇孢屬(Ophiosphaerella)和帚枝霉屬(Sarocladium)是優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為19.83%、14.33%、11.90%和3.24%。S1稻谷樣品中曲霉屬，帚枝霉屬，內(nèi)生菌屬和盤蛇孢屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為12.70%、7.42%、7.09%和3.69%。S2稻谷樣品中內(nèi)生菌屬，曲霉屬，盤蛇孢屬，帚枝霉屬和節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度為14.91%、11.30%、8.28%、8.00%和5.84%。S3稻谷樣品中內(nèi)生菌屬，節(jié)擔(dān)菌屬，盤蛇孢屬和曲霉屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度為57.43%、8.55%、6.41%和3.98%。由此可知，稻谷儲(chǔ)藏期不同，優(yōu)勢(shì)菌屬不同，進(jìn)入儲(chǔ)藏期后曲霉屬一直為優(yōu)勢(shì)菌屬之一。曲霉菌屬在新入庫時(shí)含量相對(duì)較少，進(jìn)入儲(chǔ)藏期時(shí)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長有相應(yīng)的增加，隨后又呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。

圖2 不同儲(chǔ)藏年限稻谷的真菌相對(duì)豐度(屬水平)

不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品的菌種組成及相對(duì)豐度比也各有不同。從圖3知，S0稻谷樣品中物種種類數(shù)最多，主要菌種是肉座菌(Hypocrealessp)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，格孢(Ophiosphaerellaagrostidis)和中型假絲酵母(Candidaintermedia)，其相對(duì)豐度占比為14.33%、12.03%、11.90%和7.58%。S1稻谷樣品中主要菌種分別是稻帚枝霉(Sarocladiumoryzae)，肉座菌，帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)和格孢，其相對(duì)豐度占比為7.29%、7.09%、5.01%和3.69%。S2稻谷樣品中主要菌種分別是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚狀曲霉，其相對(duì)豐度占比為14.91%、8.28%、7.82%和7.77%。S3稻谷樣品中物種種類數(shù)最少，主要菌種分別是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚狀曲霉，其相對(duì)豐度占比為57.43%、6.41%、2.71%和1.79%。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基易生長菌株黃曲霉(Aspergillusflavus)，交鏈孢霉(Alternariasp)依然是儲(chǔ)藏稻谷真菌群落中優(yōu)勢(shì)菌株，由此可見，稻谷在入庫后不同儲(chǔ)藏期間均有曲霉和鏈格孢霉存在，這與平板培養(yǎng)法結(jié)果相一致[25]。培養(yǎng)基不易生長菌株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)，多育曲霉(Aspergillusproliferans)也被檢測(cè)出來，相較于傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)法，更加廣泛全面的反映了儲(chǔ)藏稻谷真菌群落的菌種組成。

圖3 不同儲(chǔ)藏年限稻谷的真菌相對(duì)豐度(種水平)

選擇相對(duì)豐度排行前25的物種進(jìn)行制圖，并對(duì)4組樣本菌屬種類進(jìn)行了聚類分析。由圖4可知，隨儲(chǔ)藏年限增加，主要菌屬假絲酵母菌屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、帚枝霉屬(Sarocladium)、鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)不同變化。儲(chǔ)藏年限越長，儲(chǔ)藏稻谷中假絲酵母菌屬和鏈格孢屬的相對(duì)豐度增加，曲霉屬、帚枝霉屬、枝孢霉屬和青霉屬的相對(duì)豐度先增加后減少，表明稻谷在儲(chǔ)藏中其真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了明顯的演替，有研究者表明這與儲(chǔ)藏過程中稻谷的生理代謝產(chǎn)物積累，不同類型微生物代謝產(chǎn)物形成相互抑制有關(guān)[26，27]。

圖4 不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品屬水平熱圖分析

2.4 不同儲(chǔ)藏年限稻谷真菌群落間差異分析

Venn圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣品中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，從而直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣品的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。

如圖5所示，S0、S1、S2、S3稻谷樣品真菌群落總OTU數(shù)分別為657、518、551、451。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，S0稻谷具有的特性O(shè)TU數(shù)量最多，達(dá)222個(gè)，隨著儲(chǔ)藏年限增加，S1、S2、S3儲(chǔ)藏稻谷樣品真菌群落中具有的特性O(shè)TU數(shù)量逐漸減少，依次為117、113和75個(gè)。四種稻谷樣品真菌群落中共有的OTU數(shù)相對(duì)較多，達(dá)217個(gè)。由此可見，不同儲(chǔ)藏年限稻谷真菌群落存在很多相同物種和不同物種，群落間物種豐富度存在差異，且新入庫儲(chǔ)藏稻谷真菌群落物種豐富度遠(yuǎn)大于儲(chǔ)藏期的稻谷樣品。

注：不同樣本分組用不同的顏色表示，不同顏色圓圈重疊的區(qū)域標(biāo)注數(shù)字表示共有的OTU數(shù)。圖5 不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品OTU分布比較Venn圖

如圖6所示，基于不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品獲得的OTU豐度表進(jìn)行主成分分析，以比較分析糧庫控溫儲(chǔ)藏環(huán)境下儲(chǔ)藏稻谷真菌群落間差異。第1、2主成分分別占總變異的70.242%和19.891%。由圖可知，不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品位置間均相對(duì)分散，其中S3稻谷樣品位置與其他儲(chǔ)藏年限稻谷樣品位置的相對(duì)分散最遠(yuǎn)，表明其菌群物種多樣性與其他儲(chǔ)藏年限的稻谷樣品差異顯著，說明儲(chǔ)藏時(shí)間以及儲(chǔ)藏條件對(duì)稻谷真菌群落物種多樣性的變化有顯著影響。

圖6 不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品主成分分析圖

3 結(jié)論

隨儲(chǔ)藏年限增加，稻谷真菌群落多樣性發(fā)生變化，優(yōu)勢(shì)菌屬也發(fā)生演替，優(yōu)勢(shì)菌屬假絲酵母菌屬(Gibberella)和鏈格孢屬(Alternaria)的相對(duì)豐度增加，曲霉屬(Aspergillus)、帚枝霉屬 (Sarocladium)、 枝孢霉屬(Cladosporium)和青霉屬(Penicillium)的相對(duì)豐度先增加后減少，其均是儲(chǔ)藏稻谷中產(chǎn)真菌毒素高風(fēng)險(xiǎn)因子，應(yīng)作為稻谷儲(chǔ)藏過程中的重點(diǎn)防控對(duì)象。

新入庫儲(chǔ)藏稻谷真菌群落物種豐富度遠(yuǎn)大于儲(chǔ)藏期的稻谷樣品。各生物分類學(xué)水平上，新入庫稻谷真菌群落中微生物種類對(duì)應(yīng)最多，且真菌群落多樣性與其他儲(chǔ)藏年限稻谷差異顯著(P<0.05)，儲(chǔ)藏3年稻谷真菌群落中微生物種類數(shù)最少。目前儲(chǔ)藏稻谷真菌群落中無法確認(rèn)分類學(xué)信息的真菌在屬級(jí)占比達(dá)30.37%，種級(jí)占比達(dá)37.81%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)儲(chǔ)藏稻谷真菌群落中未知真菌種類鑒定、群落中菌屬特征及功能特性等展開進(jìn)一步研究。