王 品，齊 齊，鄭斯莉，徐浩展，繆朝玉 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室，上海 200433）

動(dòng)脈粥樣硬化以慢性血管炎癥及大中動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)斑塊形成為主要特征，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等均參與動(dòng)脈粥樣硬化的過程，隨著斑塊的積累，累及多種器官導(dǎo)致其病變[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是由多種因素共同作用而形成，由脂質(zhì)代謝紊亂所引起的血脂異常發(fā)揮著重要的作用，其中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)升高已被證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，低密度脂蛋白氧化后可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活和功能障礙，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成等[2]。隨著現(xiàn)代生活方式及膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的改變，高脂血癥的發(fā)病率呈逐年上升，并加重了動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的進(jìn)展[3]。因此，進(jìn)一步研究高脂飲食所引起的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病具有極其重要的意義。與以人體為研究對(duì)象相比，動(dòng)物具有易于管理、飲食和環(huán)境危險(xiǎn)因素可控的優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型是基于高脂飲食，同時(shí)操縱膽固醇代謝的相關(guān)基因，并且引入動(dòng)脈粥樣硬化的額外危險(xiǎn)因素，加速動(dòng)脈斑塊形成。各種動(dòng)物模型現(xiàn)均已被用于動(dòng)脈粥樣硬化研究，其中鼠類和兔子的模型使用最多，其次是豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，每種模型都有優(yōu)點(diǎn)和局限性。由于小鼠繁殖速度快、經(jīng)濟(jì)成本較低以及較為容易監(jiān)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，它已成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的優(yōu)勢(shì)物種[4]。目前，高脂飼料已被廣泛用于包括肥胖癥、糖尿病等多種代謝性疾病的研究中，高脂飲食也可造成高脂血癥，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)在血管內(nèi)膜堆積形成動(dòng)脈粥樣硬化。市場(chǎng)上存在著不同配方的高脂飼料，造模效果參差不齊，主要作用需進(jìn)一步探討。我們首先驗(yàn)證了一種較為常用的由普路騰公司生產(chǎn)的動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊形成的作用，并且在正常C57BL/6J 小鼠上研究其對(duì)血糖血脂的影響，最后分析了不同禁食時(shí)間對(duì)正常飲食條件下血脂檢測(cè)結(jié)果的影響。通過對(duì)高脂飼料對(duì)血糖血脂作用的深入研究，為小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼料配方

SPF 級(jí)10 周齡雄性C57BL/6J 及ApoE-/-小鼠，購(gòu)于西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，在明暗交替、溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度40%～60%、噪音≤60 dB 的環(huán)境飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案與操作均按照國(guó)家規(guī)定進(jìn)行，符合動(dòng)物福利及“3R”原則。

國(guó)產(chǎn)鼠用動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料購(gòu)于普路騰公司，配方：基礎(chǔ)飼料（58.1%）、豬油（16.6%）、蔗糖（10.6%）、麥芽糖糊精（3%）、膽固醇（1.3%）、膽鹽（0.3%）、預(yù)混料（1.6%）。

正常鼠用飼料配方：水分（≤10%）、蛋白質(zhì)（≥20.5%）、粗脂肪（≥4%）、蛋氨酸+胱氨酸（≥0.78%）、精氨酸（≥1.32%）、鈣（1.0%～1.8%）、粗纖維（≥5%）、粗灰分（≤8%）、磷（0.6%～1.2%）、氯化鈉（0.4%）。

1.2 動(dòng)物分組與造模

1.2.1 考察高脂飼料對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用

取雄性ApoE-/-小鼠8 只，分為2 組，每組4 只，分別給予動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)，4 個(gè)月后觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況。

1.2.2 其他指標(biāo)考察

取雄性C57BL/6J 小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即：①普通飼料4 周，不禁食組；②普通飼料4 周，禁食6 h(8:00 至14:00)組；③普通飼料4 周，禁食12 h（20:00 至次日8:00）組；④高脂飼料2 周(HFD 2W)組，先以普通飼料喂食2 周，再喂食高脂飼料2 周，禁食12 h（20:00 至次日8:00）⑤高脂飼料4 周(HFD 4W)組，以高脂飼料喂食4 周，禁食12 h（20:00 至次日8:00）。分別考察禁食時(shí)間對(duì)正常飲食（ND）條件下血脂檢測(cè)結(jié)果的影響，以及高脂飼料飲食（HFD）對(duì)小鼠體重、肝臟及血糖血脂水平的影響。

1.3 取材方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 ApoE-/-主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積測(cè)定

①主動(dòng)脈分離：小鼠稱量體重(g)，1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射完全麻醉，打開胸腔，暴露心臟，用1 ml 注射器自上下腔靜脈匯合處緩慢抽取血液。冰水混合物灌流心臟，分離主動(dòng)脈及與其相連的心臟和雙腎，用直徑0.2 mm 的不銹鋼針固定于裝滿冰浴PBS 的硅膠皿中，剪去心臟和雙腎及多余脂肪組織。

②主動(dòng)脈油紅O 染色：取兩根鋼針固定住頭尾，開始慢慢地沿主動(dòng)脈縱向剪開，邊剪邊增加固定鋼針，最終使主動(dòng)脈整個(gè)內(nèi)腔面平鋪朝上。用現(xiàn)配好的油紅O 溶液對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)腔面進(jìn)行染色：倒掉皿中PBS 溶液，加入油紅O 溶液浸沒主動(dòng)脈，靜置15 min，倒掉油紅O 溶液，加入75%乙醇浸沒主動(dòng)脈，再靜置10～15 min，倒掉75%乙醇，用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像。使用ImageJ 軟件測(cè)量整個(gè)主動(dòng)脈內(nèi)腔面的面積和斑塊面積。每個(gè)樣品的粥樣斑塊比例=粥樣斑塊總面積/主動(dòng)脈內(nèi)腔面積×100%。

1.3.2 血糖測(cè)量

實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物單籠飼養(yǎng)于安靜無打擾的環(huán)境中，自由活動(dòng)，2 h 后開始禁食（可自由飲水），禁食時(shí)間為12 h(20:00 至次日8:00)。測(cè)血糖時(shí)，剪去尾巴末端1～2 mm，輕輕擠出兩滴血，采用GA-3 型血糖儀及試紙條進(jìn)行血糖測(cè)定，取兩次測(cè)量的平均值。

1.3.3 C57BL/6J 小鼠肝臟取材及血脂檢測(cè)

麻醉方法同上，打開胸腔，用1ml 注射器自上下腔靜脈匯合處緩慢抽取血液收集至EP 管中，血液室溫靜置2 h 后，離心取血清。用干冰凍存送至武漢塞維爾生物科技有限公司，應(yīng)用Chemray240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(TG)、血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-c)、高密度脂蛋白(HDL-c)、游離脂肪酸(NEFA)水平。

打開腹腔，取小塊肝組織用4%多聚甲醛溶液固定，固定好的肝組織用于制作冰凍切片，分別進(jìn)行HE 及油紅O 染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用GraphPad Prism-5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的計(jì)量資料均以xˉ±s表示，兩樣本均數(shù)的 比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食加速ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成

如圖1 所示，ApoE-/-小鼠在高脂飲食4 個(gè)月后，其主動(dòng)脈產(chǎn)生的粥樣斑塊面積比例明顯高于正常飲食組（P＜0.01），說明高脂飲食可顯著加速ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。

圖1 ApoE-/-小鼠經(jīng)正常飲食和高脂飲食4 個(gè)月后主動(dòng)脈粥樣斑塊的形成情況

2.2 高脂飲食對(duì)C57BL/6J 小鼠體重及肝臟的影響

如圖2 所示，C57BL/6J 小鼠高脂飲食2 周及4 周后，其體重高于正常飲食組（P＜0.01），相比于高脂2 周組，高脂4 周后體重顯著升高（P＜0.01）。高脂4 周后肝臟外觀呈脂肪樣變，有油膩感，鏡下顯示肝細(xì)胞內(nèi)充滿脂肪空泡。表明高脂飼料可以升高小鼠體重并造成肝臟脂肪堆積。

2.3 高脂飲食不同時(shí)間對(duì)C57BL/6J 小鼠血糖的影響

如圖3 所示，C57BL/6J 小鼠在高脂飲食2 周后，其空腹血糖高于正常飲食組（P＜0.01）。相比于高脂飲食2 周組，高脂飲食4 周后空腹血糖顯著升高（P＜0.01）。表明動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料具有一定的升血糖作用。

2.4 高脂飲食不同時(shí)間對(duì)C57BL/6J 小鼠血脂的影響

圖2 C57BL/6J 小鼠不同飲食后體重及肝臟變化情況(n=10)

圖3 C57BL/6J 小鼠不同飲食后血糖水平比較(n=10)

圖4 高脂飲食不同時(shí)間對(duì)C57BL/6J 小鼠血脂的影響(n=10)

如圖4 所示，小鼠經(jīng)過高脂飲食2 周及4 周后，其血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)水平均明顯高于正常飲食組（P＜0.01），但三酰甘油(TG)水平均明顯下降（P＜0.05），而游離脂肪酸(NEFA)均未見明顯改變（P＞0.05）。此外，相比于高脂飲食2 周組、高脂飲食4 周組的血清TG、TC、LDL-c、HDL-c、NEFA 均未見明顯改變（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料主要提高血清膽固醇的含量，但同時(shí)降低血清TG 水平。

2.5 正常飲食條件下取材前不同禁食時(shí)間對(duì)血脂檢測(cè)結(jié)果的影響

如圖5 所示，在正常飲食條件下，取材前禁食6 h 組及不禁食組的血清TG 值明顯高于取材前禁食12 h 組（P＜0.01），其余指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。另外，相比于禁食6 h 組，不禁食組的血脂水平無明顯差別（P＞0.05），這表明取材前禁食時(shí)間可影響血清TG 水平。

圖5 正常飲食條件下C57BL/6J 小鼠不同禁食時(shí)間對(duì)血脂的影響(n=10)

3 討論和總結(jié)

血脂異常是心血管疾病常見的致病危險(xiǎn)因素。調(diào)查我國(guó)北方農(nóng)村人口血脂異?；疾÷拾l(fā)現(xiàn)，血脂異?；疾÷始s占45.8%，高膽固醇血癥的存在主要與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，而三酰甘油的異常主要與非酒精性脂肪肝、糖尿病相關(guān)[5]。他汀類降脂藥可抑制體內(nèi)膽固醇生物合成，是預(yù)防和治療高脂血癥患者導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化的一線藥物，已被證實(shí)可以穩(wěn)定甚至逆轉(zhuǎn)已建立的動(dòng)脈斑塊，其主要目的已經(jīng)由單純降低LDL-c 轉(zhuǎn)向關(guān)注心血管風(fēng)險(xiǎn)[6]。在動(dòng)物模型中，由于C57BL/6J 小鼠血漿不含血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白，自然生長(zhǎng)條件下不能形成動(dòng)脈粥樣硬化[7]。隨著基因工程動(dòng)物的進(jìn)展，具有動(dòng)脈粥樣硬化易感性的載脂蛋白E (ApoE)敲除小鼠逐漸被廣泛應(yīng)用。ApoE 基因敲除小鼠可以自發(fā)升高血脂水平，約在8～10 周齡時(shí)可見泡沫細(xì)胞形成，15～20 周齡可見自發(fā)性的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，通過高脂飼料喂養(yǎng)，可大大加速斑塊形成過程[8]。

高脂飼料通常是在基礎(chǔ)飼料上添加不同成分的輔食逐漸發(fā)展而來，添加膽汁酸可以促進(jìn)膽固醇的吸收，添加丙硫氧嘧啶可以有效地抑制甲狀腺的功能，升高血漿TC 和LDL-c 濃度，但是會(huì)造成肝臟、淋巴損傷等副作用，使用需謹(jǐn)慎[9-10]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，所造成的?dòng)物模型的高脂飼料配方也不同，如肥胖模型使用的超高脂飼料豬油占較高比例，能夠大大增加動(dòng)物體重并造成體脂堆積，富含高糖類的高脂飼料則可造成糖尿病動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料輕微升高動(dòng)物體重及血糖。在動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料的發(fā)展過程中，Paige 等[11]首先發(fā)明了“西方型”飲食飼料，隨著制作工藝的不斷完善，逐漸制作出1.25%高膽固醇飼料，用于動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型制備。實(shí)驗(yàn)用高脂飼料為42%脂肪供能，從上述結(jié)果可以看出，該高脂飼料的主要特點(diǎn)是造成高膽固醇血癥，尤其是提高LDL-c 濃度，這種作用在短時(shí)間內(nèi)（2 周）即可形成顯著性差異。隨著高脂時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，可使小鼠血清LDL-c 穩(wěn)定在高水平。但是動(dòng)脈粥樣硬化高脂飼料會(huì)使TG 值顯著下降，有研究認(rèn)為這可能是由于小鼠三酰甘油被高膽固醇飼料造成的大量外來膽固醇攝入所抑制，并且導(dǎo)致了肝臟來源的三酰甘油被抑制，從而導(dǎo)致血清三酰甘油水平降低[9]。此外，高脂飲食2 周及4 周后C57BL/6J 小鼠HDL-c 水平顯著升高，目前許多研究認(rèn)為HDL-c 水平與心血管風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)典學(xué)說中HDL-c 的保護(hù)作用主要機(jī)制是與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[12]。但是最近的研究對(duì)HDL-c 水平和心血管疾病之間的負(fù)相關(guān)的假設(shè)提出了質(zhì)疑，認(rèn)為兩者之間的關(guān)系是U 型的，血清高HDL-c 不再被認(rèn)為具有保護(hù)作用，來自動(dòng)脈粥樣硬化患者的HDL 不僅表現(xiàn)出保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化的功能受損，而且還有促動(dòng)脈粥樣硬化的作用，與此相一致的是，以提高HDL-c 濃度的治療方法的藥物臨床試驗(yàn)并不能顯示心血管疾病的降低[13]。

通常情況下，臨床檢測(cè)血脂要求在空腹情況下進(jìn)行，即禁食10～12 h。隨著臨床研究的不斷深入，越來越多的專家共識(shí)和建議表明，血脂檢測(cè)可能無需空腹進(jìn)行[14]。更多的證據(jù)表明，在一般人群中，正常的食物攝入對(duì)脂質(zhì)水平影響較小，可能主要對(duì)三酰甘油有所影響，但對(duì)膽固醇影響較小[15]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明雖然非空腹TG 水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于空腹TG 水平，但這種差異的臨床意義尚不清楚，到目前為止，在評(píng)估血脂預(yù)測(cè)心血管風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，沒有可靠的科學(xué)證據(jù)表明禁食優(yōu)于不禁食，選擇非空腹血脂譜是一種簡(jiǎn)化測(cè)量手段，對(duì)心血管疾病的診斷和治療沒有任何負(fù)面影響[16]。有研究指出禁食與非禁食狀態(tài)下的TG 水平均可以預(yù)測(cè)紅斑狼瘡患者的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)以及可用非空腹血脂檢測(cè)結(jié)果評(píng)估孕婦等特殊群體的脂質(zhì)代謝等[17-18]。脂質(zhì)的變化需要一定的時(shí)間，通常是在早餐前幾小時(shí)，相比較而言，非空腹?fàn)顟B(tài)條件主導(dǎo)大部分時(shí)間，更能反映真實(shí)的生理狀態(tài)。對(duì)于臨床醫(yī)生與患者來說，非禁食樣本比禁食樣本有許多明顯的優(yōu)勢(shì)，比如簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)室的血液采樣，避免了空腹的不便，有效避免糖尿病患者因禁食所造成的低血糖等。隨著研究的不但深入，未來一旦制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，非禁食狀態(tài)下的血脂檢測(cè)也必將得到越來越多的認(rèn)可，從而大大方便醫(yī)生及患者。