朱正偉 陳 鋰 吳婉琴 江 豐 范小龍 王會(huì)霞

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

中國是蔬菜生產(chǎn)大國，同時(shí)也是蔬菜消費(fèi)大國。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫[1]顯示，2018年中國蔬菜產(chǎn)量已超過7.03億t。蔬菜在種植過程中會(huì)不同程度地使用殺蟲劑、除草劑、殺菌劑等農(nóng)藥，2018年中國農(nóng)藥使用量為150.36萬t[2]。

殺撲磷是一種硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥，對(duì)介殼蟲的防治具有特效[8]，被廣泛應(yīng)用于果樹、棉花、蔬菜等作物的失尖蚧、糠片蚧、蠟蚧、粉蚧等害蟲、害螨的防治[8]。殺撲磷屬于高毒性農(nóng)藥，對(duì)人類、鳥類、魚類等[9-10]多種生物均具有毒害作用。目前關(guān)于殺撲磷的研究主要集中于其檢測(cè)[11-12]和毒性[13-14]分析，對(duì)其降解物的研究暫未見報(bào)道。文章擬分析鑒定殺撲磷的降解產(chǎn)物，建立蔬菜中殺撲磷及其降解物殘留量的檢測(cè)方法，為殺撲磷及其降解物的食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

乙腈、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、無水硫酸鎂：分析純，上海國藥化學(xué)試劑有限公司；

韭菜、包菜、西紅柿、芹菜：市售；

殺撲磷農(nóng)藥：市售；

殺撲磷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.9%，美國Supelco公司；

牛津郡殺撲磷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.5%，日本W(wǎng)AKO公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：40～60 μm，北京艾杰爾科技有限公司；

石墨化炭黑(GCB)：40～120 μm，北京艾杰爾科技有限公司；

陶瓷均質(zhì)子：2 cm(長)×1 cm(外徑)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

有機(jī)相微孔濾膜：0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ型，美國沃特斯公司；

高效液相色譜—四極桿—飛行時(shí)間高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀：Triple TOF 5600+型，美國AB Sciex公司；

分析天平：MSA125P-1CE-DU型，德國Sartorius公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機(jī)：Allegra X-15R型，美國Beckman公司；

均質(zhì)器：T25 digital型，德國IKA公司；

渦旋混合器：945605型，美國TALBOYS公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.1 mg)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈溶解并定容，配成濃度為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃避光保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 準(zhǔn)確吸取一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中，用乙腈定容配制成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液 分別吸取一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，其中殺撲磷質(zhì)量濃度分別為1，5，10，20，40，60，100 ng/mL，牛津郡殺撲磷質(zhì)量濃度分別為1，3，6，15，30，60，100 ng/mL。

1.3.4 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 取1 mL空白基質(zhì)溶液氮?dú)獯蹈桑尤? mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液復(fù)溶，過微孔濾膜?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 自然光下水中殺撲磷降解產(chǎn)物研究 準(zhǔn)確移取50 μL 殺撲磷中間液于玻璃比色管中，用超純水定容至20 mL，搖勻后置于自然光下，每天移取0.60 mL直接進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，數(shù)據(jù)用Peakview軟件分析，降解產(chǎn)物的毒性通過美國環(huán)境保護(hù)署的毒性估算軟件工具Toxicity Estimation Software Tool(T.E.S.T.)進(jìn)行計(jì)算。

1.4.2 殺撲磷農(nóng)藥成分分析 按GB 20682—2006執(zhí)行。

1.4.3 蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量檢測(cè)方法的建立

(1) 試樣制備：韭菜、西紅柿、甘藍(lán)、芹菜取可食用部分，切碎后放入組織搗碎機(jī)中打成勻漿，于聚乙烯瓶中冷凍貯藏。

(2) 基質(zhì)含量對(duì)殺撲磷及其降解物殘留量的影響：稱取10 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，1顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋提取1 min，加入7 g 氯化鈉，4 000 r/min離心5 min，取上清液分別用乙腈稀釋0，2，5，10，20，50倍，以此稀釋液為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的殺撲磷和牛津郡殺撲磷溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

(3) 石墨化炭黑(GCB)對(duì)殺撲磷和牛津郡殺撲磷的吸附：準(zhǔn)確移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液于50 mL容量瓶，用乙腈定容后搖勻，移取2 mL于15 mL離心管中，并分別加入0，10，20，30，40，50，60，80，100，150 mg GCB，渦旋30 s，4 000 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

(4) 3種QuEChERS方法比較：EN-QuEChERS農(nóng)殘方法參照EN 15662、AOAC-QuEChERS農(nóng)殘方法參照AOAC Official Method 2007.01，原始QuEChERS方法的前處理為：稱取10 g樣品于50 mL離心管，加入10 mL乙腈、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min 離心3 min，從乙腈層移取6 mL置于15 mL離心管中，加入900 mg無水硫酸鎂和150 mg PSA渦旋1 min，4 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

(5) 線性范圍測(cè)定：按1.3.3的方法分別配制4種基質(zhì)(韭菜、西紅柿、甘藍(lán)、包菜)標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

(6) 定量限測(cè)定：在韭菜、西紅柿、甘藍(lán)、包菜中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按已優(yōu)化好的方法進(jìn)行處理，上UPLC-MS/MS分析，計(jì)算殺撲磷和牛津郡殺撲磷的信噪比(S/N)，以S/N為10時(shí)的加標(biāo)水平為定量限。

(7) 基質(zhì)效應(yīng)：根據(jù)殺撲磷和牛津郡殺撲磷在韭菜、西紅柿、甘藍(lán)、芹菜基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的斜率，按式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

ME=(km/ks-1)×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)，%；

km、ks——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

當(dāng)-20%

(8) 準(zhǔn)確度測(cè)定：依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2386號(hào)《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》，選取殺撲磷質(zhì)量濃度分別為0.005，0.015，0.050 mg/kg，牛津郡殺撲磷質(zhì)量濃度分別為0.003，0.010，0.050 mg/kg的加標(biāo)水平，按已優(yōu)化的前處理方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次。

(9) 精密度測(cè)定：根據(jù)殺撲磷和牛津郡殺撲磷準(zhǔn)確度試驗(yàn)中的6次重復(fù)性結(jié)果，計(jì)算不同加標(biāo)水平的RSD。

1.4.4 儀器條件

(1) UPLC-Q-TOF-MS條件:液相色譜條件：C18色譜柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描，采集范圍m/z50～1 000，離子源溫度550 ℃。

(2) UPLC-MS/MS條件:液相色譜條件：C18色譜柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脫程序見表2。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，毛細(xì)管電壓2 500 V，其定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及錐孔電壓和碰撞能量見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然光下水中殺撲磷降解產(chǎn)物的鑒定

表1 梯度洗脫程序

表2 梯度洗脫程序

表3 殺撲磷和牛津郡殺撲磷的質(zhì)譜參數(shù)

利用T.E.S.T.軟件計(jì)算殺撲磷和牛津郡殺撲磷的毒性，其結(jié)果見表4。由表4可知，大鼠經(jīng)口LD50、生物富集因子的計(jì)算值與試驗(yàn)值比較接近，說明利用T.E.S.T.軟件計(jì)算的結(jié)果具有一定的參考性。?？そ驓淞椎腖D50高于殺撲磷，但按中國農(nóng)藥的毒性分類，其仍屬于高毒農(nóng)藥，具有遺傳毒性。

2.2 殺撲磷農(nóng)藥成分分析

經(jīng)上機(jī)分析發(fā)現(xiàn)，購買的殺撲磷農(nóng)藥中，殺撲磷和牛津郡殺撲磷含量分別為71.0，1.5 g/kg，說明殺撲磷農(nóng)藥在生產(chǎn)階段或貯藏過程中易降解為牛津郡殺撲磷，將其噴灑于植物后，會(huì)在植物中殘留。

2.3 蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量檢測(cè)方法的建立

2.3.1 基質(zhì)含量對(duì)殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量的影響

由圖2、圖3可知，不論是顏色深的韭菜還是顏色淺的甘藍(lán)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)含量降低，殺撲磷和?？そ驓淞椎捻憫?yīng)與同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)越接近，說明基質(zhì)含量對(duì)殺撲磷和牛津郡殺撲磷的響應(yīng)影響較大，有必要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，減小基質(zhì)帶來的抑制影響。

圖1 殺撲磷及其降解產(chǎn)物的提取色譜圖Figure 1 Extract chromatogram of methidathion and methidathion-oxon

表4 T.E.S.T.軟件計(jì)算的殺撲磷和?？そ驓淞椎亩拘詳?shù)據(jù)

2.3.2 GCB對(duì)殺撲磷和牛津郡殺撲磷的吸附影響 GCB可以很好地除去蔬菜中的色素，減弱基質(zhì)效應(yīng)，減輕對(duì)儀器的污染，但除去色素的同時(shí)，也會(huì)對(duì)一些平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有強(qiáng)的吸附性。由圖4、圖5可知，隨著GCB加入量的增多，殺撲磷和?？そ驓淞椎幕厥章示陆?，但殺撲磷對(duì)GCB表現(xiàn)得更敏感；當(dāng)GCB加入量相同時(shí)，牛郡津殺撲磷的回收率明顯高于殺撲磷，故選擇兩者回收率均>80%時(shí)為GCB的較優(yōu)加入量，即加入量為25 mg/mL。

2.3.3 3種QuEChERS前處理方法比較 由圖6、圖7可知，3種前處理方法對(duì)牛津郡殺撲磷回收率無顯著差異；EN-QuEChERS前處理方法對(duì)殺撲磷的回收率優(yōu)于其他兩種方法，故選擇改良后的EN-QuEChERS方法為較優(yōu)方法。

2.3.4 線性范圍 上機(jī)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL 時(shí)，韭菜、西紅柿、甘藍(lán)、芹菜的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(R2≥0.99)。

2.3.5 定量限 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，殺撲磷和牛津郡殺撲磷的最優(yōu)定量限分別為0.005，0.003 mg/kg，其在4種基質(zhì)中的信噪比見表5。

2.3.6 基質(zhì)效應(yīng) 由圖8可知，殺撲磷在西紅柿基質(zhì)中呈中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)(20%<|ME|<50%)，在其他基質(zhì)中呈強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)(|ME|≥50%)；牛津郡殺撲磷在西紅柿中呈弱的基質(zhì)效應(yīng)(|ME|≤20%)，在包菜和芹菜中呈中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)(20%<|ME|<50%)，而在顏色最深的韭菜中呈強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)(|ME|≥50%)。凈化后，凈化液基本呈無色，但基質(zhì)效應(yīng)仍很強(qiáng)，所以在殺撲磷及其降解產(chǎn)物牛津郡殺撲磷的檢測(cè)過程中仍需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

Ks表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分別表示稀釋0，2，5，10，20，50倍的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖2 基質(zhì)含量對(duì)殺撲磷響應(yīng)的影響Figure 2 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion

Ks表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分別表示稀釋0，2，5，10，20，50倍的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖3 基質(zhì)含量對(duì)牛津郡殺撲磷響應(yīng)的影響Figure 3 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion-oxon

圖4 GCB加入量對(duì)殺撲磷回收率的影響Figure 4 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion

圖5 GCB加入量對(duì)牛津郡殺撲磷回收率的影響Figure 5 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion-oxon

圖6 3種QuEChERS前處理方法對(duì)殺撲磷回收率的影響Figure 6 Effect of three QuEChERS pretreatmentmethods on recovery of methidathion

圖7 3種QuEChERS前處理方法對(duì)牛津郡殺撲磷回收率的影響Figure 7 Effect of three QuEChERS pretreatment methods on recovery of methidathion-oxon

表5 殺撲磷和牛津郡殺撲磷在4種基質(zhì)中的信噪比

2.3.7 準(zhǔn)確度 由圖9、圖10可知，低、中、高加標(biāo)水平下，殺撲磷和牛津郡殺撲磷在4種基質(zhì)中的回收率分別為68.5%～97.2%，62.9%～94.3%，均能滿足《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》的要求。

2.3.8 精密度 由表6可知，殺撲磷和?？そ驓淞椎腞SD均在《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》規(guī)定的范圍之內(nèi)。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化前處理方法，建立了蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量的檢測(cè)方法，該方法的線性范圍、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)確性和精密度等指標(biāo)均能滿足《農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》的要求，適用于植物源中殺撲磷及牛津郡殺撲磷殘留量的測(cè)定。自然條件下，殺撲磷易降解為牛津郡殺撲磷，但牛津郡殺撲磷的穩(wěn)定性如何，會(huì)繼續(xù)降解成何種物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

圖8 殺撲磷和牛津郡殺撲磷在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Figure 8 Matrix effect diagram of methidathion and methidathion-oxon in different matrices

圖9 不同加標(biāo)水平下殺撲磷的回收率Figure 9 Matrix effect diagram of methidathion in different matrices

圖10 不同加標(biāo)水平下牛津郡殺撲磷的回收率Figure 10 Matrix effect diagram of methidathion-oxon in different matrices

表6 不同加標(biāo)水平下殺撲磷和?？そ驓淞自?種基質(zhì)中的精密度