張 珊 黃雪松

(暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632)

二氫黃酮類化合物(包括蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)[1]和三萜內(nèi)酯化合物檸檬苦素均為柚子中的活性成分，其中柚皮苷和檸檬苦素為苦味物質(zhì)，前者造成“直接”苦味，后者呈現(xiàn)“后苦”現(xiàn)象[2-3]，兩類物質(zhì)的含量是衡量柚子加工產(chǎn)品質(zhì)量和保健功效的重要品質(zhì)指標(biāo)，因此兩類物質(zhì)的測(cè)定方法成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及報(bào)道中，這兩類物質(zhì)都是分別測(cè)定的，如：GB 1886.262—2016僅規(guī)定了柚皮苷的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定方法；NY/T 2014—2011規(guī)定了同時(shí)測(cè)定橙皮苷、柚皮苷的HPLC方法；朱露等[4]提出同時(shí)測(cè)定枳實(shí)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC方法；蔡艷芳等[5]提出測(cè)定枳實(shí)中檸檬苦素的HPLC方法，迄今尚未見(jiàn)檸檬苦素與黃酮類物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。試驗(yàn)擬以柚子幼果和柚子果汁為樣品，研究一種方便、快速、準(zhǔn)確且同時(shí)測(cè)定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種成分的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白肉蜜柚幼果(直徑小于5 cm)、白肉蜜柚：廣東順興種養(yǎng)股份有限公司；

蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品：成都普菲生物技術(shù)有限公司；

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純：瑞典歐森巴克化學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-20A nence型，配SPD-M20A紫外檢測(cè)器，島津(廣州)檢測(cè)技術(shù)有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

二兩裝高速中藥粉碎機(jī)：111型，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；

高速離心機(jī)：HC-3514型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精確稱取一定量的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分別用甲醇溶解于50 mL容量瓶中并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.053，1.363，1.102，1.096 g/L的單標(biāo)溶液，測(cè)定其出峰時(shí)間及紫外吸收光譜。

精確稱取一定量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素，用甲醇溶解于同一50 mL容量瓶中并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.080，1.146，1.104，1.176，0.812 g/L 的混標(biāo)母液，用甲醇倍比稀釋至0.50，0.25，1.25×10-1，6.25×10-2，3.13×10-2，1.56×10-2，7.81×10-3，3.91×10-3，1.95×10-3，9.77×10-4倍，測(cè)定其濃度。

1.3.2 樣品制備 精確稱取凍干柚子粉末(100目)樣品0.107 7 g于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲提取30 min，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

取新鮮柚子以果肉榨汁，取1 g柚子汁溶于10 mL甲醇，超聲提取30 min后，6 000 r/min離心10 min，取上清液，將上清液與甲醇(V上清液∶V甲醇)以1∶50的比例再次混合，靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.3.3 HPLC梯度洗脫方法 參考朱露等[4]和蔡艷芳等[5]的方法，設(shè)計(jì)如表1中的5種方法。根據(jù)所獲HPLC色譜圖從中選出最適宜的方法予以評(píng)價(jià)。

1.3.4 HPLC測(cè)定條件 色譜柱Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃。配二極管陣列紫外檢測(cè)器(PDA)，分別在283 nm和220 nm檢測(cè)4種黃酮苷和檸檬苦素。

混標(biāo)溶液洗脫條件由表1中的5種洗脫方法逐個(gè)試用，單標(biāo)溶液洗脫條件和柚子樣品的洗脫條件為表1中選取的最優(yōu)方法。

1.3.5 重復(fù)性的測(cè)定 取1.3.2中的供試品溶液，制成平行樣品5份，以1.3.4中的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，分別計(jì)算5種成分的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.6 精確度與加樣回收率的測(cè)定 精密稱取201.5 mg柚子幼果粉末，置于50 mL容量瓶中，分別加入不同質(zhì)量的5種標(biāo)準(zhǔn)品，定容。以1.3.2中的方法處理后，制成平行樣品5份，在1.3.4中的HPLC條件下進(jìn)行測(cè)定，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，按式(1)計(jì)算平均回收率。用平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評(píng)價(jià)精確度高低。

(1)

式中：

R——回收率，%；

m1——測(cè)得量，mg；

m2——樣品中成分質(zhì)量，mg；

m3——加標(biāo)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定條件的確定

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng) 圖1分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖。由圖1(a)～(d)可知，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為282，282，283，283 nm，為操作與計(jì)算方便，選取283 nm為4種黃酮苷的紫外吸收波長(zhǎng)。由圖1(e)可知，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)<240 nm時(shí)，波長(zhǎng)越小，檸檬苦素的響應(yīng)值越大，但考慮到既能檢測(cè)到檸檬苦素又盡可能減少雜質(zhì)或溶劑導(dǎo)致的紫外吸收誤差，選擇220 nm 為測(cè)定檸檬苦素的吸收波長(zhǎng)。據(jù)此，定量測(cè)定上述5種成分時(shí)，檸檬苦素選擇采用220 nm時(shí)的吸收峰面積，而4種黃酮?jiǎng)t采用283 nm測(cè)定時(shí)的吸收峰面積。

表1 5種不同的洗脫程序

圖2(a)～圖2(e)分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的單標(biāo)在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖，圖2(f)和圖2(g)為上述5種物質(zhì)的混標(biāo)在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖。由單標(biāo)和混標(biāo)的出峰時(shí)間對(duì)比分析可知，圖2(f)和圖2(g)中峰1～5分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素。

圖1 4種黃酮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖Figure 1 UV absorption spectra of four flavonoid glycosides and limonin

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖2 5種標(biāo)準(zhǔn)品在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 2 Chromatograms of 5 standards at 283 nm and 220 nm

2.1.2 最佳HPLC梯度洗脫條件 如圖3所示，逐步提高流動(dòng)相中乙腈比例，可使檸檬苦素的出峰時(shí)間提前。檸檬苦素出峰時(shí)間由方法1中21.15 min提前至方法5中15.84 min[圖2(g)]，提前了5.31 min，這是因?yàn)镃18反相色譜柱的填料以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)。因此，選擇系統(tǒng)洗脫時(shí)間最短的方法5測(cè)定4種物質(zhì)；在該條件下，各成分的分離度均大于1.5，滿足測(cè)定要求[6]。

2.2 測(cè)定方法的可靠性

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢測(cè)限和定量限 在1.3.4的條件下，對(duì)不同質(zhì)量濃度的4種黃酮苷與檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5種物質(zhì)的線性方程(見(jiàn)表2)。信噪比(S/N)為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為檢出限(LOD)，信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)[7]。

2.2.2 重復(fù)性 按照1.3.5的處理方法，得出表3的重復(fù)性進(jìn)樣結(jié)果，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2%，表明此種方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精確度與加樣回收率 按照1.3.6的處理方法，得出表4中一系列結(jié)果，5種成分的平均回收率范圍為98.47%～99.81%，RSD均小于2%，表明此種方法測(cè)量精確，回收率良好。

2.3 柚子幼果與柚子汁中5種物質(zhì)的含量

根據(jù)上述測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定按照1.3.5準(zhǔn)備的柚子樣品，測(cè)得柚子幼果(圖4)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%；測(cè)得柚子汁(圖5)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖3 不同洗脫條件下的色譜圖(220 nm)Figure 3 Comparison of tailing of limonoid peaks under different elution conditions (220 nm)

表2 5種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限?

由圖4、圖5可知：4種黃酮物質(zhì)分離度高，峰型好；但檸檬苦素峰型受到樣品中雜質(zhì)的影響，有一定的偏差，需要注意選擇積分曲線；由表5可知：不同品種、不同生長(zhǎng)期和不同部位的柑橘作物中成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)各不相同。

盡管如此，通過(guò)上述方法一次測(cè)定且同時(shí)獲得上述5種成分的含量是非常方便的。此前，人們或分為2～3次分別測(cè)量5種物質(zhì)，或僅測(cè)其中的3～4種，試驗(yàn)所建立的HPLC方法可方便地同時(shí)測(cè)得其含量，為測(cè)定柑橘水果中類黃酮和苦味物質(zhì)節(jié)約大量的成本與時(shí)間。

表3 5種成分的重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果

表4 5種成分的加樣回收率?

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖4 柚子幼果在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 4 Chromatograms of young pomelo sample solution at 220 nm and 283 nm

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖5 柚子汁在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 5 Chromatograms of young pomelo sample solution at 283 nm and 220 nm

表5 不同柚子品種與部位的5種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立的高效液相色譜法在20 min內(nèi)，利用PDA檢測(cè)器在283 nm與220 nm分別完成了對(duì)柚子幼果及柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種關(guān)鍵的黃酮類和苦味物質(zhì)的同時(shí)定量測(cè)定，測(cè)得柚子幼果中5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%，柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。但最終確定的方法中，新橙皮苷與檸檬苦素峰[圖2(g)]之間的時(shí)間間隔仍然較長(zhǎng)，后續(xù)可使用不同流動(dòng)相組分或洗脫方法予以減少。