杜崇宣, 劉云根,2*, 王 妍,2, 包寧穎, 陳 天

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院， 云南 昆明 650224； 2. 西南林業(yè)大學(xué)山地農(nóng)村生態(tài)環(huán)境演變與污染治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650224)

砷(Arsenic，As)是一種具有強(qiáng)毒性的環(huán)境污染物[1]，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，As被廣泛應(yīng)用于冶金、含砷殺蟲(chóng)劑、除草劑、木材防腐劑和飼料添加劑等，過(guò)量的As釋放到環(huán)境中，導(dǎo)致土壤和水體的As污染問(wèn)題日益嚴(yán)重[2-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界土壤中As濃度的平均值為6 mg·kg-1，我國(guó)為11.2 mg·kg-1[4]，約為世界平均值的2倍。土壤As污染具有隱蔽性、累積性、地域性、不可逆性和長(zhǎng)期性等特點(diǎn)，As污染不僅影響土壤肥力、作物產(chǎn)量和品質(zhì)，而且會(huì)通過(guò)食物鏈的“生物放大”作用對(duì)人體健康產(chǎn)生極大威脅。因此，如何減輕As污染問(wèn)題成為了目前亟待解決的問(wèn)題，必須加以重視。

面對(duì)日益嚴(yán)重的土壤As污染現(xiàn)象，綠色環(huán)保的植物修復(fù)(Phytoremediation)是目前研究最熱門(mén)的環(huán)境修復(fù)技術(shù)之一。香蒲(TyphaangustifoliaL.)是一種廣泛分布于我國(guó)的挺水植物，其根系發(fā)達(dá)且生長(zhǎng)快速。有研究表明[5]，在100～150 mg·kg-1As污染生境中，香蒲的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)不僅沒(méi)有受到抑制，反而優(yōu)于正常生境，表明香蒲對(duì)As污染具有一定的耐受性。因此，香蒲對(duì)As具有良好的吸附效果，能有效減輕土壤As污染，可作為As污染修復(fù)區(qū)生態(tài)修復(fù)的目標(biāo)植物[6]。低量的As可以刺激植物的生長(zhǎng)，但是超過(guò)了一定濃度，As就會(huì)對(duì)植物的光合作用等生理生態(tài)指標(biāo)產(chǎn)生不同程度的影響[7-9]，而根系分泌的有機(jī)化合物組成和含量的變化是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫最直接和最明顯的反映。因此，探究As污染對(duì)植物根系分泌物的影響已越來(lái)越重要。

高等植物的表皮覆蓋著一層由長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物組成的蠟質(zhì)。蠟質(zhì)具有多種功能，它可以為植物提供物理化學(xué)保護(hù)屏障、減少非氣孔水分的損失、控制溫度、提供光保護(hù)、增強(qiáng)抗霜凍能力以及對(duì)有害物(包括害蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌)攻擊的抵抗力[10]。作為植物蠟質(zhì)重要組成部分之一的正構(gòu)烷烴在自然界植物的葉、莖、花以及果實(shí)器官和組織的表面廣泛存在[11]，畢博遠(yuǎn)等[12]就從不同種植年限紫花苜蓿的根系分泌物中提取出多種正構(gòu)烷烴化合物。由于其性質(zhì)穩(wěn)定、難降解，且正構(gòu)烷烴與對(duì)應(yīng)的生物源前身有一定的結(jié)構(gòu)聯(lián)系或相關(guān)性[13]，從而常用作分子標(biāo)志物來(lái)指示生態(tài)環(huán)境特征與物源關(guān)系[14]，而有關(guān)逆境脅迫對(duì)植物根系分泌正構(gòu)烷烴的影響鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)分析不同濃度As(50，150，600 mg·kg-1)污染對(duì)香蒲光合色素、鮮重和根系分泌物的影響，旨在明確香蒲在As污染生境中的生理適應(yīng)性機(jī)制，從而為As污染土壤的改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：以As耐受型植物——香蒲為試驗(yàn)材料，香蒲購(gòu)自云南省昆明市富民縣香蒲種植基地。

土壤：校園無(wú)污染紅壤，試驗(yàn)所用的土壤基本性質(zhì)如下表1所示：

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)方法

取回的土壤自然晾干、粉碎，過(guò)2 mm篩后備用。使用前，將土壤與有機(jī)復(fù)合肥按1∶2(v∶v)混合，用黑色聚乙烯塑膠桶(25 cm×32 cm)作為濕地模擬裝置(共12個(gè))，每桶裝入15 kg干土。在供試土壤中進(jìn)行加As處理，分別添加0(CK)，50(低)，150(中)和600(高) mg·kg-14個(gè)濃度(以Na2HAsO4·7H2O為As源，As濃度以純As計(jì))并攪勻，每個(gè)濃度3次重復(fù)，添加10 L無(wú)菌水保持淹水狀態(tài)并標(biāo)記出每個(gè)濕地裝置的持水線高度，并將土壤置于常溫、黑暗環(huán)境中老化1.5個(gè)月。

待土壤老化以后，每個(gè)濕地裝置移栽4株生長(zhǎng)一致，苗齡為1個(gè)月的香蒲幼苗，以盆為重復(fù)，定株培養(yǎng)60 d，培養(yǎng)時(shí)間為：2018年4月15日—6月15日。室內(nèi)進(jìn)行，自然光照，室溫：20～25℃，濕度：60%～75%，期間每隔一個(gè)星期向各濕地裝置中添加無(wú)菌水至持水線高度。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

葉綠素：葉綠素含量的測(cè)定用分光光度法[15]。

生物量：將提取完根系分泌物的植物樣品，先用自來(lái)水小心清洗植物葉片及根部，再用濾紙吸去植株表面水分后用剪刀將植物分成地上部分和地下部分，用電子稱測(cè)定各部分鮮重。

根系分泌物：以盆為單位，將植物從土壤中小心取出，參考韋雪晶等[16]的方法：用去離子水沖洗根系4次，洗凈根部的土壤顆粒后用20%的H2O2溶液浸泡10 min，用去離子水洗凈根系后，將根系轉(zhuǎn)致盛有300 mL 0.5 mmol·L-1CaCL2溶液中，并保證根部處于避光條件下收集根系分泌物12 h。收集完成后，將收集好的浸提液定容至300 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜。取浸提液加入分液漏斗與二氯甲烷1∶1比例萃取3次，合并萃取液，取有機(jī)相到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸發(fā)，減壓濃縮至干后用2 mL色譜純二氯甲烷潤(rùn)洗溶解有機(jī)相并過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后裝入2 mL樣品瓶-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

GC-MS分析：采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍M/Z30～600AMU，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230℃。毛細(xì)管柱：HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫50℃(2 min)，以6℃·min-1程序升溫至250℃(保持15 min)。載氣為He，流量1 mL·min-1，進(jìn)樣量為l次。為消除試驗(yàn)誤差，按照相同測(cè)定條件以萃取劑二氯甲烷作空白試驗(yàn)。應(yīng)用NiST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0和Microsoft Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差和數(shù)據(jù)均值及標(biāo)準(zhǔn)差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 As污染對(duì)香蒲葉綠素含量和鮮重的影響

如表2所示，As污染對(duì)香蒲葉片光合色素含量的影響均表現(xiàn)出“低促高抑”的趨勢(shì)，即低、中濃度As污染處理?xiàng)l件下，香蒲葉片光合色素含量增加。葉綠素a和總?cè)~綠素含量在底泥As低濃度處理下，有所上升，但是變化幅度較小，分別較CK增加了1.14%和3.08%，而葉綠素b含量則顯著升高(P<0.05)，較CK增加4.30%；葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均在底泥中濃度污染時(shí)達(dá)到峰值，并顯著高于CK(P<0.05)，分別較CK增加23.43%，17.56%和19.60%；高濃度As污染處理后葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均降低，與CK相比，葉綠素a含量沒(méi)有顯著降低(1.14%)，葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別顯著降低了48.74%和30.40%(P<0.05)。葉綠素a/b在底泥As中濃度污染時(shí)變化幅度較小，當(dāng)?shù)啄郃s低濃度污染時(shí)，葉綠素a/b顯著低于CK(P<0.05)，高濃度污染時(shí)則顯著高于CK(P<0.05)，這主要是與葉綠素a和葉綠素b的增加或降低幅度有關(guān)，并且高濃度As處理?xiàng)l件下葉綠素a的降解明顯低于葉綠素b。

表2 As污染對(duì)植物光合色素的影響

由圖1可知，底泥As污染對(duì)香蒲地上部鮮重與地下部鮮重的影響也均呈現(xiàn)出中低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的“低促高抑”規(guī)律。植物地上部分鮮重在底泥As低、中濃度污染處理?xiàng)l件下，均顯著高于CK(P<0.05)，分別增加了26.20%和16.73%。植物地上部分鮮重在低濃度As處理達(dá)到峰值后便開(kāi)始降低，中濃度As處理相對(duì)于低濃度植物地上部分有所降低，但差異不顯著，高濃度As處理植物地上部分鮮重相對(duì)于低、中濃度顯著降低(P<0.05)，并顯著低于CK(P<0.05)，降低了44.26%。

植物地下部分鮮重在底泥As低、中濃度污染處理后同樣也高于CK，低濃度As處理?xiàng)l件下，植物地下部分鮮重增加8.85%，而中濃度As處理則增加了136.42%(P<0.05)，高濃度As處理后地下部分顯著降低(P<0.05)，相對(duì)于CK減少了38.41%?？梢?jiàn)，低、中濃度As污染處理不僅沒(méi)有抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，反而促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而高濃度As污染處理則顯著性抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖1 As污染下香蒲各部分生物量

2.2 As污染對(duì)香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴的影響

由表3可知，香蒲根系分泌的11種正構(gòu)烷烴化合物濃度在底泥As污染處理后均呈現(xiàn)“先增后降”的趨勢(shì)，即中低濃度增加，而高濃度降低。除二十三烷低濃度As污染處理顯著低于CK外，其余化合物濃度均在底泥低、中和高濃度As污染處理后，正構(gòu)烷烴化合物濃度均顯著高于CK(P<0.05)；除十六烷高濃度As污染處理顯著低于低濃度As污染處理外(P<0.05)，其余化合物濃度均在底泥中、高濃度處理?xiàng)l件下顯著高于低濃度處理(P<0.05)；除二十三烷高濃度As污染處理與中濃度相比沒(méi)有顯著變化外，其余各處理化合物濃度均顯著低于中濃度處理(P<0.05)。可見(jiàn)，底泥As污染促進(jìn)香蒲根系正構(gòu)烷烴化合物的分泌，各底泥As污染化合物濃度依次為：中濃度>高濃度>低濃度>CK。

本研究中共檢測(cè)到11種正構(gòu)烷烴類化合物(表3)，其中短鏈正構(gòu)烷烴化合物有6種，長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴化合物有5種，可以看出香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物并沒(méi)有明顯的長(zhǎng)短碳鏈優(yōu)勢(shì)。香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物的碳數(shù)在C14～C26之間，其中長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴化合物的濃度無(wú)論是在正常生長(zhǎng)條件下還是不同底泥As濃度污染處理?xiàng)l件下均表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)。正常生境中，香蒲根系分泌的長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴化合物占總正構(gòu)烷烴化合物的63.49%，底泥低、中、高濃度As污染處理后分別占63.48%，67.81%和64.34%。

表3 As污染下香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴濃度

2.3 As污染下香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴化合物與植物生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析

為研究香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴化合物與植物生長(zhǎng)和光合色素之間的相互關(guān)系，對(duì)香蒲根系分泌的各正構(gòu)烷烴化合物濃度與植物生物量及植物光合色素含量進(jìn)行了Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)。

香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴化合物濃度與植物生物量的相關(guān)性Pearson值見(jiàn)表4。由表4可知，除二十三烷與植物地上部分鮮重呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系外(P<0.05)，其余檢測(cè)到的根系分泌正構(gòu)烷烴化合物濃度與植物地上部分鮮重沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系；在檢測(cè)到的11種正構(gòu)烷烴化合物中，有十九烷、二十二烷、二十四烷、二十五烷和二十六烷共5種正構(gòu)烷烴化合物與植物地下部分鮮重呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，其中除十九烷以外，其余四種化合物均為長(zhǎng)鏈烷烴；十四烷、十八烷和二十烷3種短鏈烷烴與植物地下部分鮮重呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

香蒲根系分泌正構(gòu)烷烴化合物濃度與植物光合色素的相關(guān)性Pearson值見(jiàn)表5。由表5可知，香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物與植物光合色素之間相互影響，在檢測(cè)到的11種正構(gòu)烷烴化合物中，十四烷、十九烷、二十烷、二十二烷、二十四烷、二十五烷和二十六烷7種化合物濃度與葉綠素a的含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，僅有十八烷1種化合物濃度與葉綠素a的含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。而檢測(cè)到的11種正構(gòu)烷烴化合物與葉綠素b和總?cè)~綠素的含量相關(guān)性不大。

表4 各正構(gòu)烷烴化合物與植物生物量相關(guān)性分析

表5 各正構(gòu)烷烴化合物與光合色素相關(guān)性分析

3 討論

3.1 不同濃度As污染對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]，因此它對(duì)植物的生長(zhǎng)具有極其重要的作用，而重金屬對(duì)植物光合作用的影響是通過(guò)破壞葉綠體的完整性來(lái)實(shí)現(xiàn)[18]，葉綠體被重金屬破壞之后，便使植物失綠，從而產(chǎn)生毒害現(xiàn)象。從本研究可以看出，不同濃度As處理對(duì)香蒲葉綠素的含量影響表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者關(guān)于As污染對(duì)植物葉綠素含量的影響都得出了相似的結(jié)論[19-21]。重金屬抑制植物的光合作用己被許多研究所證實(shí)，葉片中葉綠素含量隨As濃度的增加而降低，其原因是由于As進(jìn)入植物體后，使葉綠素酶活性增大，導(dǎo)致葉綠素分解加快[22]，而在50和150 mg·kg-1As處理時(shí)，香蒲通過(guò)調(diào)整自身生理代謝過(guò)程，建立了自身防御體系，因此表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象。值得注意的是，高濃度As處理(600 mg·kg-1)葉綠素a/b顯著高于CK(P<0.05)，從葉綠素a/b的比值可以看出，葉綠素a的降解明顯低于葉綠素b，由此可知，高濃度As處理顯著影響香蒲葉片內(nèi)葉綠素b的含量，但對(duì)葉綠素a含量的影響相對(duì)較小，保持體內(nèi)有相對(duì)較高的葉綠素a含量可以保證植物體對(duì)光能的充分利用，提高轉(zhuǎn)化率。有研究認(rèn)為葉綠素b含量的減少會(huì)影響到光系統(tǒng)的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致整個(gè)光合機(jī)構(gòu)的不穩(wěn)定，具體表現(xiàn)在對(duì)逆境的耐受性降低[23-24]。綜上，低、中濃度As污染，香蒲通過(guò)增加葉綠素含量和生物量，從而啟動(dòng)自身防御系統(tǒng)，增強(qiáng)植物耐受性；高濃度As處理嚴(yán)重破壞香蒲體內(nèi)葉綠素b，植物對(duì)逆境耐受性降低，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻(圖1)。

3.2 不同濃度As污染對(duì)植物根系分泌正構(gòu)烷烴的影響

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，根系從環(huán)境中攝取養(yǎng)分的同時(shí)，也向環(huán)境中分泌質(zhì)子和離子，并釋放大量有機(jī)物，任何影響植物生長(zhǎng)和生理的因素均會(huì)影響根分泌物的數(shù)量和種類[25]。本研究表明，底泥中、低濃度As污染處理植物代謝旺盛，長(zhǎng)勢(shì)良好(圖1)，根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物濃度顯著升高(P<0.05)(表3)。相關(guān)性分析顯示，香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物濃度與植物地下部分鮮重呈顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系。這與Zheng等人[26]的研究有相似的結(jié)論，植物的根系參數(shù)，如：根系體積、根密度、根重等與根系分泌物的分泌量、物質(zhì)種類和數(shù)量成正相關(guān)?？梢?jiàn)植物的生長(zhǎng)會(huì)影響根系正構(gòu)烷烴類物質(zhì)的分泌，但是，底泥高濃度As污染處理，植物生長(zhǎng)受到顯著抑制，根系分泌正構(gòu)烷烴化合物濃度仍然顯著性高于CK，這可能是因?yàn)橹参锸艿礁邼舛華s污染時(shí)，植物體內(nèi)的細(xì)胞膜受損的緣故。至于香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物濃度與聚光色素葉綠素a相關(guān)性顯著，尤以長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴最為顯著，而與葉綠素b和總?cè)~綠素相關(guān)性不大這個(gè)問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

高等植物的表皮覆蓋著一層由長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物組成的蠟質(zhì)，植物蠟質(zhì)是一種復(fù)雜的混合物，其成分是長(zhǎng)鏈的脂肪族和環(huán)狀化合物，而正構(gòu)烷烴是植物類脂的重要組成部分，最主要的功能是鎖水作用，其平均碳鏈長(zhǎng)度(ACL)作為植物對(duì)水分脅迫程度的生理性反映。植物在受到毒害時(shí)會(huì)增加根系分泌物的產(chǎn)生和積累[27-29]。本研究也得到了相同的結(jié)論，不同濃度底泥As污染處理?xiàng)l件下，明顯改變了香蒲根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物濃度(表3)，香蒲根系正構(gòu)烷烴的分泌量隨As濃度的升高而表現(xiàn)為升高-降低的現(xiàn)象，且As污染處理后，根系正構(gòu)烷烴的分泌量均顯著高于CK(P<0.05)。這可能是香蒲植株在應(yīng)對(duì)底泥As污染主動(dòng)發(fā)生的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)根系分泌物中合成更多的正構(gòu)烷烴類化合物，以抵御底泥As脅迫。目前有關(guān)植物蠟質(zhì)的研究多集中在地上部分的葉表皮蠟質(zhì)上，而有關(guān)植物地下部分根表皮蠟質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。本研究從香蒲的根系提取出了11種正構(gòu)烷烴化合物，由此可以推測(cè)植物根系表面同樣也包裹著一層蠟質(zhì)，表皮蠟質(zhì)是植物與外界環(huán)境接觸的第一道防線，真菌與植物接觸時(shí)，首先粘附于覆蓋在植物最表層的蠟質(zhì)層，主要靠附著胞等入侵結(jié)構(gòu)粘附，而附著胞的形成較易受蠟質(zhì)層的影響[30]。植物根系受到As污染污染時(shí)，植物根際可能會(huì)滋生有害細(xì)菌，根系通過(guò)增加正構(gòu)烷烴化合物的分泌，增加根系表皮蠟質(zhì)的含量，使有害細(xì)菌粘附于蠟質(zhì)層而避免對(duì)植物根系的侵害。植物根系分泌的正構(gòu)烷烴化合物是否通過(guò)一系列反應(yīng)最終生成根系表面的蠟質(zhì)層，根系表面的蠟質(zhì)層在底泥As污染下所起的具體作用還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

綜上所述，香蒲是一種As耐受型植物，在底泥150 mg·kg-1As污染脅迫條件下不僅能完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育，而且長(zhǎng)勢(shì)良好；在一定濃度As污染脅迫時(shí)，香蒲通過(guò)增加其各部分生物量、葉綠素含量以及根系分泌正構(gòu)烷烴化合物含量以提高植物抗脅迫能力，維持正常生長(zhǎng)發(fā)育，當(dāng)超過(guò)一定濃度As污染脅迫時(shí)，植物生長(zhǎng)受到抑制，尤其以葉綠素b的降解最為顯著；根系正構(gòu)烷烴化合物的分泌與植物地下部分鮮中和葉綠素a呈顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系。