歐宏宇，朱海宏，朱文君，賀貝貝，吳世樂

胃癌(gastric cancer，GC)是世界第6大常見惡性腫瘤，其病死率高居各類惡性腫瘤的第3位，且5年生存率低于30%。由于GC早期癥狀不明顯，超過80%的患者確診時就是中晚期，而中國是GC高發(fā)地區(qū)，每年新增病例數(shù)占全球40%～50%，其防治形勢相當(dāng)嚴(yán)峻。因此，了解GC相關(guān)發(fā)病機制，尋找潛在治療靶點，對改善GC治療、提高預(yù)后具有重要意義?？咕腖L-37是一種由前體蛋白hCAP-18水解產(chǎn)生的C端肽，具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能，在慢性感染、炎癥反應(yīng)、傷口愈合、組織再生、腫瘤等方面發(fā)揮重要的生理功能。LL-37是人體內(nèi)唯一的抗菌肽，其異常表達與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但有關(guān)其在腫瘤中的功能目前研究甚少。有研究表明，LL-37在幽門螺桿菌感染患者胃上皮組織和胃分泌物中顯著上調(diào)，而在萎縮性胃炎向胃腺癌進展過程中表達逐漸降低。Wu et al研究表明，LL-37在GC組織中低表達，并通過蛋白酶體依賴機制激活骨形成蛋白信號通路來抑制GC細胞增殖。據(jù)此推測，LL-37可能作為抑癌基因參與胃癌發(fā)生發(fā)展進程，然而有關(guān)LL-37在胃癌中更多的功能作用目前鮮有報道。該研究擬采用外源LL-37干預(yù)GC細胞，探討LL-37對GC細胞凋亡的影響并初步闡明其可能機制，為GC靶向治療提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人胃癌AGS細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫；胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；PrimeScriptRT reagent Kit和TB Green

Premix

Ex

Taq

Ⅱ試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和辣酸根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(MTT)購自北京索萊寶科技有限公司；p53 siRNA干擾質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒購自漢恒生物科技上海有限公司；p53、Cleaved-caspase-3、PUMA、Bcl-2、Bax、GAPDH和Histone H3等抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

取出液氮凍存的人胃癌AGS細胞，添加至含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀態(tài)，每隔2～3 d傳代1次。

1.3 MTT實驗

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，以2×10個/孔接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的LL-37溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。避光條件下，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處吸光度(opitcal density,OD)值，以O(shè)D490值表示細胞增殖活性，并計算半抑制濃度(IC)值。

1.4 qRT-PCR檢測

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，取等體積細胞懸液分別接種于培養(yǎng)皿中，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的LL-37溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞沉淀，加入適量TRIzol試劑，提取細胞總RNA，采用PrimeScriptRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用TB Green

Premix

Ex

Taq

Ⅱ試劑盒進行PCR擴增。引物序列：p53，forward: 5′-GAGGTT GGCTCTGACTGTACC-3′，reverse: 5′-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3′；GAPDH，forward:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，reverse: 5′-GCCCAATACG-ACCAAATCC-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，共35個循環(huán)。采用2法計算p53 mRNA相對表達量。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，以1.5×10個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的LL-37溶液處理24 h。收集細胞，500 r/min離心5 min，棄上清液，按照試劑盒說明書加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，再分別加入5 μl Annexin V-FITC染液和10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光15 min，隨后置于冰上，立即采用流式細胞儀進行檢測。

1.6 免疫熒光實驗

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，以1.5×10個/孔接種于內(nèi)含無菌蓋玻片的6孔板中，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的LL-37溶液處理24 h。棄培養(yǎng)基， 3%多聚甲醛固定10 min，預(yù)冷PBS輕輕洗2次，1% NP40處理5 min，吸掉液體，5%牛血清白蛋白4 ℃封閉2 h，滴加p53抗體(1 ∶500)，置于4 ℃冰箱中孵育過夜，預(yù)冷PBS輕輕洗3次，滴加熒光二抗(1 ∶1 500)，室溫避光孵育1 h，預(yù)冷PBS輕輕洗3次，滴加適量DAPI溶液(0.1 mg/ml)，室溫避光孵育15 min，預(yù)冷PBS輕輕洗3次，取出玻片，滴加防淬滅劑，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，取等體積細胞懸液分別接種于培養(yǎng)皿中，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度為0、10、20、40 μmol/L的LL-37溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞沉淀，分別加入全細胞蛋白裂解液或核蛋白裂解液抽提蛋白并定量。取25 μg蛋白經(jīng)沸水浴變性后，行SDS-PAGE凝膠電泳，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氯乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗p53(1 ∶1 000)、Cleaved-caspase-3(1 ∶1 000)、PUMA(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)和Histone H3(1 ∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜。次日，加入二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量蛋白條帶灰度值，以Histone H3為核蛋白p53內(nèi)參，其他蛋白以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白吸光度值與內(nèi)參蛋白吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.8 LL-37聯(lián)合siRNA-p53干預(yù)實驗

取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度，以1.5×10個/孔接種于6孔板中，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA陰性對照質(zhì)粒(siRNA-NC)和p53 siRNA干擾質(zhì)粒(siRNA-p53)分別轉(zhuǎn)染至AGS細胞中，記為siRNA-NC組和siRNA-p53組，另取未經(jīng)轉(zhuǎn)染的AGS細胞作為空白對照組(blank)。轉(zhuǎn)染48 h后，采用上述qRT-PCR和Western blot法檢測p53 mRNA和蛋白水平。

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后AGS細胞，調(diào)整細胞密度，以1.5×10個/孔接種于6孔板中，將細胞分為siRNA-NC、siRNA-NC+LL-37、siRNA-p53和siRNA-p53+LL-37組。待細胞完全貼壁后，siRNA-NC+LL-37組和siRNA-p53+LL-37組細胞均采用20 μmol/L LL-37處理24 h，收集細胞后采用上述流式細胞術(shù)法檢測各組細胞凋亡水平，Western blot法檢測各組細胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 LL-37抑制AGS細胞增殖活性

MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)LL-37處理24 h后，胃癌AGS細胞OD490值分別為(0.48±0.01)、(0.43±0.01)、(0.36±0.01)和(0.29±0.01)，IC值為55.54 μmol/L。與0 μmol/L比較，LL-37可呈劑量依賴性抑制AGS細胞增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=189.631，

P

<0.001)。為了保證該研究后續(xù)實驗中AGS細胞的增殖活性，該研究選擇40%抑制濃度(約40 μmol/L)作為該研究LL-37最大干預(yù)濃度。

2.2 LL-37促進AGS細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖1A)顯示，不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)LL-37處理24 h后，胃癌AGS細胞凋亡率分別為(7.37±1.86)%、(14.80±1.49)%、(25.53±2.85)%和(39.10±2.56)%；與0 μmol/L比較，不同濃度(10、20、40 μmol/L)LL-37處理后，AGS細胞凋亡率逐漸增加(

F

=114.868，

P

<0.001)。Western blot檢測結(jié)果(圖1B)顯示，不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)LL-37處理24 h后，胃癌AGS細胞中Cleaved-caspase-3、Bax和PUMA蛋白表達水平逐漸上升(

F

=586.209、252.665、482.897，

P

<0.001)，而Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低(

F

=705.271，

P

<0.001)。

圖1 LL-37對AGS細胞凋亡的影響A：流式細胞術(shù)檢測AGS細胞凋亡；B：Western blot檢測AGS細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達；與0 μmol/L LL-37處理組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 LL-37激活p53信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)

qRT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)LL-37處理24 h后，胃癌AGS細胞中p53 mRNA相對表達量分別為(1.00±0.02)、(2.46±0.09)、(4.23±0.13)和(7.09±0.62)；與0 μmol/L比較，不同濃度(10、20、40 μmol/L)LL-37處理后，AGS細胞中p53 mRNA表達水平逐漸增加(

F

=207.276，

P

<0.001)。Western blot檢測結(jié)果(圖2A)顯示，(0、10、20、40 μmol/L)LL-37處理24 h后，胃癌AGS細胞核中p53 蛋白相對表達量分別為(0.06±0.03)、(0.16±0.03)、(0.31±0.02)和(0.86±0.04)；與0 μmol/L比較，不同濃度(10、20、40 μmol/L)LL-37處理后，AGS細胞核中p53 蛋白表達水平逐漸增加(

F

=401.866，

P

<0.001)。免疫熒光結(jié)果(圖2B)顯示，0 μmol/L LL-37處理后AGS細胞中p53 蛋白綠色熒光非常弱，而不同濃度(10、20、40 μmol/L)LL-37處理后AGS細胞中p53 蛋白綠色熒光逐漸增強，并且逐漸由細胞質(zhì)向細胞核內(nèi)聚集。

圖2 LL-37對AGS細胞中p53蛋白表達及定位的影響A：Western blot檢測AGS細胞核中p53蛋白表達水平；B： 免疫熒光實驗檢測AGS細胞中p53 蛋白定位情況×400；與0 μmol/L LL-37處理組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 干擾

53基因表達抑制LL-37誘導(dǎo)的細胞凋亡

qRT-PCR結(jié)果顯示， siRNA-p53組細胞中p53 mRNA相對表達量(1.00±0.04)低于blank組(0.96±0.06)和siRNA-NC組(0.28±0.06)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=185.368，

P

<0.001)。Western blot檢測結(jié)果(圖3A)顯示，與blank組和siRNA-NC組比較，siRNA-p53組細胞中p53蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=169.321，

P

<0.001)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖3B)顯示，siRNA-NC、siRNA-NC+LL-37、siRNA-p53和siRNA-p53+LL-37組細胞凋亡率分別為(7.23±1.07)%、(27.01±2.31)%、(4.83±1.66)%和(11.13±2.90)%。與siRNA-NC組比較，siRNA-NC+LL-37組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=11.531，

P

<0.001)，而siRNA-p53+LL-37組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=2.275，

P

>0.05)；與siRNA-p53組比較，siRNA-p53+LL-37組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=3.675，

P

<0.01)。Western blot檢測結(jié)果(圖3C)顯示，與siRNA-NC組比較，siRNA-NC+LL-37組細胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=28.583，

P

<0.001)，而siRNA-p53+LL-37組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=2.042，

P

>0.05)；與siRNA-p53組比較，siRNA-p53+LL-37組細胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=4.219，

P

<0.01)。

圖3 干擾p53基因表達對LL-37誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響A：Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中p53蛋白表達水平；與blank或siRNA-NC組比較：***P<0.001；B：流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率；C：Western blot檢測各組細胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達水平； 1:siRNA-NC組; 2:siRNA-NC+IL-37組; 3:siRNA-p53組; 4:siRNA-p53+IL-37組； 與siRNA-NC組比較：***P<0.001；與siRNA-p53組比較：##P<0.01

3 討論

無限增殖及抵抗細胞死亡均是腫瘤細胞的主要特征之一，也是抗腫瘤藥物研發(fā)的靶點。目前，較多一線抗腫瘤藥物均以干擾細胞周期進程為靶點，如5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑等；也有某些以原癌基因或抑癌基因為靶點的分子靶向抗癌藥物，如以表皮生長因子受體(RGFR)為分子靶點的吉非替尼、以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為靶點的依維莫司等，并且都取得顯著效果。作為一個具有多種生物學(xué)活性的人源抗菌肽，LL-37在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要生理作用，但其功能具有腫瘤異質(zhì)性，而其作用的分子靶點主要為膜受體蛋白及其相關(guān)信號通路。在LL-37抗腫瘤研究方面，閆圣玉 等報道稱，LL-37通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路介導(dǎo)的細胞自噬，抑制結(jié)腸癌細胞裸鼠移植瘤的生長；Mader et al證實，LL-37通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人Jurkat T白血病細胞凋亡。而該結(jié)果顯示，LL-37可通過激活抑癌基因

p

53的表達抑制胃癌AGS細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，表明

p

53可能是LL-37作為治療胃癌潛在藥物的一個分子靶點。抑癌基因的失活及原癌基因的激活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的始作俑者。作為一種非常重要的抑癌基因，

p

53基因可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的表達，通過參與調(diào)節(jié)細胞周期、DNA修復(fù)、細胞凋亡以及細胞衰老等生物學(xué)過程抑制腫瘤進程。然而，在多數(shù)腫瘤組織中

p

53基因發(fā)生突變，導(dǎo)致

p

53基因轉(zhuǎn)錄激活功能的喪失，進而失去腫瘤抑制活性。目前，靶向

p

53基因的抗癌藥物主要以恢復(fù)

p

53基因野生型功能、誘導(dǎo)突變型p53蛋白降解以及抑制突變型

p

53下游功能為策略，但化學(xué)合成藥物副作用較大。LL-37是在人體中迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的抗菌肽，具有多種生物學(xué)活性，因此人源抗菌肽LL-37藥用價值較大。已經(jīng)有報道稱，LL-37能夠激活p53介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡。為此，為了探討LL-37對胃癌細胞凋亡的影響及其作用機制與p53關(guān)系，該研究選擇p53野生型的胃癌AGS細胞為研究對象，采用人源抗菌肽LL-37進行干預(yù)，結(jié)果顯示，LL-37可呈劑量依賴性抑制胃癌AGS細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，該研究還表明，不同濃度LL-37處理可促進AGS細胞中

p

53 mRNA表達，表明LL-37能夠促進

p

53基因的轉(zhuǎn)錄表達。作為核轉(zhuǎn)錄因子，p53蛋白須由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核才能激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其抑癌活性。為此該研究對AGS細胞核中p53蛋白表達水平進行了檢測，Western blot結(jié)果顯示0 μmol/L LL-37處理時，AGS細胞核中p53蛋白表達量較低，而經(jīng)過不同濃度LL-37處理后AGS細胞核中p53蛋白表達水平逐漸升高，且免疫熒光實驗進一步證實LL-37能夠促進p53蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核。提示，LL-37不僅能夠促進

p

53基因的表達，而且還能促進p53蛋白由胞質(zhì)向細胞核中轉(zhuǎn)位。p53介導(dǎo)的細胞凋亡途徑是

p

53發(fā)揮抑癌基因功能的重要方式，其可直接轉(zhuǎn)錄激活PUMA的表達，隨后PUMA與Bcl-2/Bax復(fù)合體相互作用誘導(dǎo)線粒體膜間隙細胞色素C的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終由Cleaved-caspase-3執(zhí)行凋亡。該結(jié)果顯示，不同劑量的LL-37處理可促進AGS細胞中PUMA、Bax及Cleaved-caspase-3等蛋白的表達，而抑制Bcl-2蛋白的表達，提示LL-37可能通過激活p53介導(dǎo)的細胞凋亡途徑誘導(dǎo)AGS細胞凋亡。為了進一步證實LL-37是通過p53途徑誘導(dǎo)AGS細胞凋亡，該研究采用siRNA技術(shù)沉默AGS細胞中

p

53基因表達，然后再采用LL-37進行干預(yù)，結(jié)果顯示與siRNA-NC組比較，

p

53基因沉默后LL-37誘導(dǎo)的AGS細胞凋亡率大幅度降低，同時Cleaved-caspase-3蛋白表達水平也明顯降低，說明LL-37是通過激活p53介導(dǎo)的細胞凋亡途徑誘導(dǎo)AGS細胞凋亡。此外，該結(jié)果還顯示與siRNA-p53組比較，siRNA-p53+LL-37組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平均升高，說明激活p53介導(dǎo)的細胞凋亡途徑并非LL-37誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的唯一途徑，還可能存在其他途徑。