高 翔，劉 扣，桂衍超，陳可洋，蔣正軒

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)、也是最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其機(jī)制可能與血脂代謝異常有關(guān)。總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)的濃度變化可視為脂質(zhì)代謝紊亂的指標(biāo)之一。Mahmoudabady et al的報(bào)道指出，降低TC、TG濃度是治療DR的有效手段?？ㄍ衅绽鳛檠芫o張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，其在治療DR上具有重要意義，但機(jī)制尚不清楚。最新研究表明卡托普利能夠降低大鼠血清TC、TG濃度。由此推測(cè)，卡托普利改善大鼠DR可能與其降低視網(wǎng)膜中TC、TG濃度有關(guān)。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(sterol regulatory element binding protein，SREBP)是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)控因子。其中，SREBP1是脂肪酸合成的特異性限速酶，它的活性及表達(dá)對(duì)TG的合成和分泌具有顯著的影響；而SREBP2是膽固醇合成的特異性限速酶，直接參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的調(diào)控。

該研究采用卡托普利治療2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠，通過(guò)檢測(cè)血清TC、TG濃度的變化，觀察大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)改變，并進(jìn)一步檢測(cè)視網(wǎng)膜中SREBP1、SREBP2表達(dá)水平的變化來(lái)探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

卡托普利、HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)；血糖儀、血糖試紙(美國(guó)羅氏公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、小鼠抗β-actin(美國(guó)Sigma 公司)；一抗：兔Anti-SREBP1抗體、兔Anti-SREBP2(美國(guó)abcam公司)；山羊抗兔 IgG 抗體、山羊抗小鼠 IgG抗體(北京中杉金橋生物有限公司)；凝膠掃描成像系統(tǒng)Fine-do X6顯影儀(上海天能科技有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒(上海碧云天公司)，TG、TC檢測(cè)試劑盒(南京建城生物工程研究所)；其余常見(jiàn)試劑和耗材均來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系教研室。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及干預(yù)

選取SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量均為180～200 g(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，所有動(dòng)物均自由進(jìn)食，大鼠生活環(huán)境為 12 h白/12 h黑暗的晝夜節(jié)律，動(dòng)物房溫度為(23±2) ℃，相對(duì)濕度為(50±5) %。隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)；20只大鼠作為造模組先給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，之后每周1次給予禁食不禁水喂養(yǎng)16 h后，將大鼠稱(chēng)重并按35 mg/kg于左下腹注射配置好的STZ溶液(STZ溶于1%的枸櫞酸-枸櫞酸三鈉溶液配成0.1 mol/L，pH值4.3的緩沖液)，注射72 h后測(cè)空腹血糖≥11.1 mmol/L確定為糖尿病模型；測(cè)空腹血糖<11.1 mmol/L大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)1周，重復(fù)該步驟，共3周全部造模成功。將成模的大鼠隨機(jī)分為卡托普利干預(yù)組(DM+CAP)和0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組(DM+NS)，每組各10只。DM+CAP組大鼠給予卡托普利溶液每天25 mg/kg灌胃，DM+NS與正常對(duì)照組則給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。每周1次檢測(cè)大鼠體質(zhì)量、空腹血糖(禁食8 h)。大鼠墊料每天更換2次，保證其生活條件干燥舒適。灌胃操作共持續(xù)8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)后處理

藥物灌胃8周后，對(duì)每只大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，立即打開(kāi)胸腔，抽取腹主動(dòng)脈血，用0.9%氯化鈉溶液經(jīng)心臟灌洗直至臟器變蒼白，摘取雙眼眼球。一側(cè)眼球置于多聚甲醛組織固定液中待用，另一側(cè)眼球立刻磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，移至解剖顯微鏡下，在角鞏膜緣下2 mm處沿赤道方向剪開(kāi)，去除眼前節(jié)和玻璃體，鈍性分離視網(wǎng)膜，儲(chǔ)存在1.5 ml EP管中，液氮冷凍，于-80 ℃保存。該研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行。

1.4 血清TC、TG濃度及視網(wǎng)膜病理學(xué)檢測(cè)

待收集的全血凝固后，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上層血清，檢測(cè)TC、TG濃度(mmol/L)。大鼠眼球固定72 h后，將眼球清洗、乙醇脫水、石蠟包埋，并沿視神經(jīng)走向切片，HE染色。

1.5 視網(wǎng)膜SREBP1、SREBP2蛋白水平檢測(cè)

稱(chēng)取20 mg視網(wǎng)膜組織，經(jīng)裂解勻漿后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，變性后于-20 ℃保存，SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，PVDF纖維素膜轉(zhuǎn)膜，一抗(Anti-SREBP1、Anti-SREBP2)室溫孵育1 h或4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30～60 min。孵育好的PVDF膜清洗后滴加配置完成的顯影液，置于顯影儀中進(jìn)行顯影并記錄保存。對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、空腹血糖的變化

DM+CAP組及DM+NS組大鼠均表現(xiàn)出多飲多食多尿的糖尿病特征，而正常對(duì)照組無(wú)上述特征。糖尿病模型組與正常對(duì)照組比較，體質(zhì)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。DM+CAP組與DM+NS組體質(zhì)量見(jiàn)圖1A。DM+CAP組、DM+NS組大鼠血糖一直保持在20 mmol/L以上。見(jiàn)圖1B。

圖1 大鼠體質(zhì)量及空腹血糖A：大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖; B：大鼠空腹血糖變化趨勢(shì)圖; 與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化

DM+NS組大鼠視網(wǎng)膜的組織形態(tài)較正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織發(fā)生明顯的改變。HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，各層分界清楚；DM+NS組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂(黃箭)，分界不清，神經(jīng)纖維層有大量新生血管生成(黑箭)；DM+CAP組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)稍顯疏松，但各層界限較清晰，少有新生血管分布。見(jiàn)圖2。

圖2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察 HE×200A：正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；B：DM+NS組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；C：DM+CAP組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

2.3 卡托普利降低糖尿病大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)

檢測(cè)大鼠血清中TC濃度，正常對(duì)照組為(4.03±0.40)mmol/L，DM+NS組為(20.20±2.38)mmol/L，DM+CAP組為(8.11±0.74)mmol/L，3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=199.522，

P

<0.01)。見(jiàn)圖3A。檢測(cè)大鼠血清中TG濃度，正常對(duì)照組為(2.08±0.50)mmol/L，DM+NS組為(21.41±1.56)mmol/L，DM+CAP組為(13.54±1.61)mmol/L，3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=321.64，

P

<0.01)。見(jiàn)圖3B。與正常對(duì)照組比較，DM+NS組血清TC、TG上升，卡托普利的干預(yù)降低了該數(shù)值。

圖3 大鼠血清中TC、TG含量A：大鼠血清中TC的含量；B：大鼠血清中TG的含量；1：正常對(duì)照組；2：DM+NS組；3：DM+CAP組； 與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與DM+NS組比較：#P<0.05

2.4 卡托普利對(duì)視網(wǎng)膜SREBP1、SREBP2的影響

Western blot重復(fù)檢測(cè)蛋白，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，DM+NS組、DM+CAP組大鼠視網(wǎng)膜SREBP1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；DM+NS組大鼠視網(wǎng)膜中SREBP2升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，但DM+CAP組與正常對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DM+NS組比較，DM+CAP組大鼠視網(wǎng)膜SREBP1、SREBP2均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖4A、B。由此可見(jiàn)，卡托普利不僅降低了TC、TG在血清中的含量，在視網(wǎng)膜組織中同樣下調(diào)了TC、TG調(diào)控因子SREPB2、SREBP1的表達(dá)水平。

圖4 視網(wǎng)膜SREBP1、SREBP2蛋白水平A：SREBP1/β-actin；B：SREBP2/β-actin；1：正常對(duì)照組；2：DM+NS組；3：DM+CAP組；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與DM+NS組比較：#P<0.05

3 討論

該實(shí)驗(yàn)中，卡托普利降低了DM血清TC、TG濃度。此外，SREBP1、SREBP2在DM視網(wǎng)膜中表達(dá)上調(diào)，而卡托普利的治療抑制了兩種蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，卡托普利通過(guò)下調(diào)視網(wǎng)膜中SREBP1、SREBP2的表達(dá)水平降低視網(wǎng)膜血供中TC、TG的濃度。與正常對(duì)照組比較，DM視網(wǎng)膜組織形態(tài)惡化，而卡托普利治療組的大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)有明顯改善。該實(shí)驗(yàn)表明，卡托普利在DR中通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝異常發(fā)揮保護(hù)作用。

DR的基本病理特征是新生血管的生成。Sun et al指出，新生血管的生成與脂代謝失衡有關(guān)，研究者在脂代謝紊亂的小鼠眼睛中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)病變，并指出該機(jī)制可能與脂肪酸代謝失調(diào)有關(guān)。研究表明，SREBP1作為脂肪酸合成的限速酶，對(duì)TG合成具有重要意義，抑制SREBP1的表達(dá)能有效降低TG的合成和分泌。SREBP2 作為膽固醇合成的特異性限速酶，通過(guò)與HMG-CoA 還原酶和LDL受體等基因上的SRE區(qū)域發(fā)生特異結(jié)合，直接參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的調(diào)控，從而影響機(jī)體的脂質(zhì)代謝過(guò)程。在該實(shí)驗(yàn)采用卡托普利治療DR大鼠，通過(guò)檢測(cè)大鼠血清TG、TC濃度驗(yàn)證既往結(jié)論，通過(guò)病理組織切片觀察卡托普利對(duì)DR大鼠的治療效果，并進(jìn)一步檢測(cè)了大鼠視網(wǎng)膜中SREBP1、SREBP2的蛋白表達(dá)，探索卡托普利治療DR的分子機(jī)制。臨床研究表明，強(qiáng)化降血脂治療延緩了DR患者的病情進(jìn)展，但是強(qiáng)化降血壓治療沒(méi)有延緩DR的進(jìn)展，說(shuō)明血壓波動(dòng)對(duì)DR進(jìn)展無(wú)明顯影響。該實(shí)驗(yàn)中，卡托普利具有降血壓作用，但該作用與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明確相關(guān)性，因此沒(méi)有檢測(cè)大鼠血壓變化。

該實(shí)驗(yàn)采用的方法是目前應(yīng)用最廣泛的HFD/STZ誘導(dǎo)法，此方法操作簡(jiǎn)單、易于成模，且制備糖尿病模型穩(wěn)定，接近人2型糖尿病。研究表明，采用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型長(zhǎng)期穩(wěn)定，并且大鼠糖尿病眼病隨著糖尿病病程不斷發(fā)展而進(jìn)展，與臨床糖尿病眼病的相關(guān)病理改變極為相似，是研究糖尿病眼病較為理想的動(dòng)物模型。

綜上所述，該研究表明卡托普利通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP1、SREBP2降低TC、TG水平，抑制新生血管，是卡托普利保護(hù)DR的新作用機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣本量較少，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。