李 霂，潘夢璐，鄭美娟，帥宗文

抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA associate vasculitis, AAV)臨床常分為顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangitis, MPA)、嗜酸性肉芽腫性多血管炎(eosinophilic granulomatous polyangiitis, EGPA)和肉芽腫性多血管炎(granulomatous polyangiitis, GPA)，MPA和EGPA中ANCA識別的主要自身抗原為髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)，GPA中ANCA主要識別蛋白酶-3(protease 3, PR3)，分別稱為MPO-ANCA和PR3-ANCA。在中國，AAV主要以MPO-ANCA陽性的MPA最為多見，中老年人群高發(fā)，病程進展快，病死率高。MPO-AAV的確切發(fā)病機制未明，研究表明，MPO-ANCA是致病自身抗體。B細胞發(fā)育成熟為分泌自身抗體(MPO-ANCA)漿細胞的過程中，必需CD4的濾泡輔助T細胞(follicular helper T cells, Tfh)協(xié)助，Tfh表達有CXC趨化因子受體5(CXC-chemokine receptor 5，CXCR5)和可誘導的共刺激因子(inducible co-stimulator，ICOS)，分別是Tfh的標志分子和處于活化狀態(tài)的標志，前期研究顯示，MPO-AAV患者周圍血MPO-ANCA水平與CD4T細胞中Tfh%及其活性程度呈正相關(guān)。

中性粒細胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是由激活的中性粒細胞釋放的一種由去致密DNA和蛋白(其中包括MPO和PR3)構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，基本功能之一是胞外捕獲并殺滅病原體。進一步研究表明NET有促進炎癥反應作用，與多種自身免疫病的發(fā)病有關(guān)。已有的研究表明，含有MPO的NET可能參與MPO-AAV的發(fā)病。然而，NET是固有免疫參與者，MPO-ANCA是適應性免疫的產(chǎn)物，NET如何干預MPO-ANCA產(chǎn)生，目前尚未見臨床研究報道。該研究初步探索NET影響MPO-ANCA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

35例MPO-AAV患者選自2018年3月—2019年10月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院的患者，均符合 2012 年 Chapel Hill 共識會議和1990年美國風濕病學院關(guān)于 MPA、GPA 或EGPA 的定義和分類診斷標準。間接免疫熒光法(IIF)檢測核周型ANCA(p-ANCA)陽性，免疫斑點法和ELISA法檢測MPO-ANCA均陽性。除外抗蛋白酶3抗體(PR3-ANCA)和抗核抗體(anti-nuclearantibody，ANA)陽性者，以免其對研究觀察指標的影響。所有患者均為初次確診，病情處于活動期，未曾接受過激素及免疫抑制劑治療。采用修訂的伯明翰血管炎活動度評分(BVAS-V3)評估每例患者的病情活動度。35例健康對照者隨機選自該院健康體檢中心，年齡和性別與入組病例匹配，排除結(jié)締組織病史及近期感染性疾病史。研究符合安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會制定的關(guān)于人體試驗的倫理學標準(批文號：PJ 2014-07-10)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細胞分離液(北京Solarbio公司)；FITC標記小鼠抗人CD278抗體(美國eBioscience公司)；PerCP-CyTM5.5標記小鼠抗人CD4抗體、APC標記小鼠抗人CD185抗體、PE標記小鼠抗人CD279抗體、PE-IgG1-к、APC- IgG2b-к(美國BD公司)；FITC-IgG1-к(美國eBioscience公司)；歐蒙醫(yī)學實驗診斷試劑盒、人MPO抗原(美國Sigma-Aldrich公司)；羊抗人IgG(美國Sigma公司)；IL-23檢測試劑盒(美國BioTSZ公司)；低速離心機(Centrifuge5810R，德國Eppendorf公司)；酶標儀(PRA ELX800，美國萊姆德公司)；流式細胞儀(FACS Calibur型，美國BD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1

流式細胞術(shù)(FCM)檢測外周血Tfh 外周血單個核細胞(PBMCs)的制備：取1 ml抗凝血與1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積混勻稀釋；取1 ml淋巴細胞分離液于15 ml離心管內(nèi)，將制備的混合液輕注入淋巴細胞分離液表面；1 260 r/min離心20 min后分為4層(從上至下依次為血漿層、PBMCs層、淋巴細胞分離液層及紅細胞層)，取PBMCs層，加入3 ml PBS充分混勻，1 500 r/min離心5 min×3次，加入300 μl PBS 重懸?？贵w標記及檢測：取PBMCs懸液100 μl于流式管中，加入CD4-PerCP-CyTM5.5、CD185-APC、CD278-FITC和CD279-PE各5 μl，每管均設(shè)置同型對照(加入細胞懸液100 μl及FITC-IgG1-κ、PE-IgG1-κ和APC-IgG2b-κ各5 μl，振蕩后避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min離心棄上清液，加入300 μl PBS重懸，上機檢測。

1.3.3

IL-23檢測 采用IL-23檢測試劑盒，按試劑盒說明書常規(guī)ELISA步驟定量檢測IL-23。

2 結(jié)果

2.1 入組患者及研究對照的臨床資料

研究中入選的35例患者病程為0.5～24(5.2±6.1)月，均為初診未治療的患者，BVAS評分為5～47(19.2±7.3)分，病情均處于活動期。病例組與對照組間年齡分別為23～85(66.0±12.2)歲和28～78(63.5±11.9)歲，男 ∶女分別為16 ∶19和17 ∶18，組間年齡和性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(分別為

t

=0.862，

P

=0.392；χ=0.057，

P

=0.811)?；颊呓M中33例臨床診斷符合MPA，2例符合GPA，患者的人口學特點及AAV疾病構(gòu)成符合中國MPO-AAV的特點。

2.2 研究指標的組間比較

FCM檢測結(jié)果顯示，與健康對照組比較，入組患者CD4T細胞中Tfh分數(shù)(Tfh%)、ICOSTfh占CD4T細胞分數(shù)(ICOSTfh%)及ICOS的平均熒光表達強度(mean fluorescence intensity，MFI)均高于對照組。ELISA檢測結(jié)果顯示病例組周圍血NET及IL-23表達水平高于對照組。見表1。

表1 病例組與對照組各觀察指標檢測結(jié)果比較

2.3 病例組中各觀察指標的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3.1

MPO-ANCA與Tfh指標的相關(guān)性分析 雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，患者周圍血MPO-ANCA水平分別與Tfh%及Tfh表達ICOS的MFI(表示Tfh的活動強度)呈正相關(guān)，但多元線性回歸分析結(jié)果顯示MPO-ANCA水平僅與Tfh%呈正相關(guān)。見表2。分析Tfh%與患者主要內(nèi)臟損害(腎和肺)間的關(guān)系，顯示Tfh%與腎和肺損害BVAS間無相關(guān)性(分別為

r

=0.306，

P

=0.074；

r

=0.292，

P

=0.089)。

表2 周圍血MPO-ANCA與Tfh指標相關(guān)分析結(jié)果(n=35)

2.3.2

周圍血IL-23與觀察指標的相關(guān)分析結(jié)果 雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，MPO-AAV患者周圍血IL-23水平分別與Tfh%、Tfh活動強度及NET呈正相關(guān)。見表3。

表3 周圍血IL-23與研究觀察指標的相關(guān)性分析(n=35)

2.3.3

CD4T中Tfh%與IL-23、NET的相關(guān)性分析結(jié)果 雙變量分析結(jié)果顯示Tfh%分別與NET和IL-23呈正相關(guān)，但多元線性回歸分析結(jié)果提示Tfh%僅與NET呈正相關(guān)。見表4。分析NET與患者主要內(nèi)臟損害(腎和肺)間的關(guān)系，顯示NET與腎損害BVAS間存在相關(guān)性(

r

=0.390，

P

=0.021)，與肺損害間無相關(guān)性(分別為

r

=0.038，

P

=0.827)。

表4 周圍血CD4+ T中Tfh%與NET及IL-23的相關(guān)分析結(jié)果(n=35)

3 討論

淋巴組織中Tfh輔助B細胞發(fā)育成熟為分泌抗體(包括自身抗體MPO-ANCA)漿細胞的途徑中，不僅可通過分泌多種細胞因子(如IL-4、IL-10和IL-21等)，還可以通過表達ICOS發(fā)揮作用。ICOS是CD28共刺激分子家族的成員，僅表達于活化的T細胞，其配體BTRP-1結(jié)構(gòu)性表達于B細胞，阻斷ICOS與BTRP-1的相互作用，可以抑制Tfh細胞的生成和B細胞的分化，因此，該研究選擇ICOS作為Tfh活性的指標。

NET由DNA、組蛋白、MPO、PR3、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、溶酶體膜蛋白2(lysome-associated membrane protein-2, LAMP-2)等組成。髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells, mDC)屬于專職抗原遞呈細胞，動物實驗研究表明，NET可能更易于被淋巴濾泡內(nèi)的mDC捕獲，通過向Th細胞更有效地提呈組成NET的自身抗原物質(zhì)，促進自體免疫反應，產(chǎn)生自身抗體ANCA。IL-23是mDC活化過程產(chǎn)生的主要細胞因子之一，具有廣泛的固有免疫和適應性免疫的促進作用，也是Tfh分化和功能作用不可或缺的細胞因子。

結(jié)果顯示，與正常對照組比較，患者組周圍血Tfh%、ICOSTfh%及Tfh的活動強度均增高，這與之前的研究結(jié)果一致。病例組中進一步分析Tfh各指標對致病抗體MPO-ANCA的可能影響，顯示自身抗體MPO-ANCA僅分別與Tfh%及Tfh的活動強度呈正相關(guān)，但多元回歸分析提示僅Tfh%是影響致病抗體MPO-ANCA的獨立因素。不過，MPO-AAV患者的臨床損害不僅受MPO-ANCA的影響，同時受補體旁路激活產(chǎn)生C5a、周圍血中對抗MPO銅藍蛋白濃度等因素影響，這可能是該研究中Tfh%與主要內(nèi)臟(腎和肺)損害無相關(guān)性的原因。目前認為，NET可能是參與AAV發(fā)病的重要因素之一，研究表明患者組周圍血中NET水平高于對照組，且NET與患者常見內(nèi)臟損害腎損害呈正相關(guān)，支持NET可能是參與AAV發(fā)病的重要因素之一。因入組該研究的主要為高齡的MPA患者，影響肺損害評估的其他因素(如慢性支氣管肺病變伴感染等)可能干預肺損害BVAS評估，出現(xiàn)NET與肺損害間無相關(guān)性。結(jié)果顯示MPO-AAV患者周圍血IL-23高于對照組，推測MPO-AAV患者分泌IL-23的mDC的活性增強。病例組中進一步分析IL-23與該研究主要觀察指標間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-23與Tfh%、Tfh活動強度、NET分別呈正相關(guān)，符合IL-23具有促進固有免疫(NET)和適應免疫(Tfh細胞)的廣泛生物學功能特點。

綜上所述，Tfh%是影響致病自身抗體MPO-ANCA的獨立影響因素，Tfh%分別與NET及IL-23呈正相關(guān)，經(jīng)多元回歸分析，結(jié)果顯示僅NET是影響Tfh%的獨立因素。因此，固有免疫NET參與MPO-AAV發(fā)病的可能途徑之一是通過激活mDC，促進適應性免疫Tfh%升高以輔助B細胞發(fā)育成熟，產(chǎn)生特異性自身抗體MPO-ANCA，可能最終導致MPO-AAV發(fā)病。