姜 寧 李正鵬 周 峰 董浩然 李巧珍 李 玉

(上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部應用真菌資源與利用重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403)

刺芹側(cè)耳（Pleurotnseryngii）俗稱杏鮑菇，隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、蘑菇目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]，是目前國內(nèi)進行規(guī)?；a(chǎn)的主要食用菌之一。同時，刺芹側(cè)耳菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，菌柄脆滑，味道鮮美，有淡淡的杏仁香味和肥嫩的鮑魚口感，因而被稱為“平菇王”“干貝菇”“草原的美味牛肝菌”[2]。此外，刺芹側(cè)耳營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸、多糖和寡糖，具有防癌抗癌、降血脂、降膽固醇以及提高人體免疫力等功效。

近年來，食用菌的遺傳轉(zhuǎn)化及功能研究成為了熱點，常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有PEG介導轉(zhuǎn)化法[3]、限制性內(nèi)切酶介導的DNA轉(zhuǎn)化法[4]、基因槍轉(zhuǎn)化法[5]、電激轉(zhuǎn)化法[6]、根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法等。其中，根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法是一種天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，具有操作方便、不需要復雜的儀器設備、轉(zhuǎn)化成本低且轉(zhuǎn)化效率高、容易獲得單拷貝的轉(zhuǎn)化菌株、重復性較高、在食用菌轉(zhuǎn)化的受體選擇上具有靈活性等優(yōu)點[7-8]，故近年來該遺傳轉(zhuǎn)化法在雙孢蘑菇[9]、糙皮側(cè)耳[10]、香菇[11]、金針菇[12]、刺芹側(cè)耳[13]等食用菌中已取得了一定的研究成果。但在根癌農(nóng)桿菌介導的刺芹側(cè)耳的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，轉(zhuǎn)化受體對于卡那霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉、潮霉素等抗生素的敏感性是運用該技術(shù)的關(guān)鍵，而且選擇合適的篩選標記基因以及抗生素濃度對提高轉(zhuǎn)化效率都具有很大的影響。在此背景下，筆者擬在根癌農(nóng)桿菌介導的刺芹側(cè)耳的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，對常用抗生素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響進行研究和探索，以期為進一步建立并優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導的刺芹側(cè)耳的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論基礎?，F(xiàn)將相關(guān)試驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試劑

供試菌株為刺芹側(cè)耳“國森一號”菌絲體，保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所。供試抗生素為卡那霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉、潮霉素，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。供試馬鈴薯葡萄糖瓊脂購于碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配制

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂稱取39 g溶于1 L蒸餾水中，徹底混勻，用玻璃棒快速攪拌加熱3 min，待粉末完全溶解后，用500 mL三角瓶分裝，在121 ℃的高溫高壓下滅菌20 min，冷卻至40～45 ℃，加入不同濃度的抗生素，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后進行接種。

培養(yǎng)皿中抗生素的終濃度分別為：卡那霉素0、25、50、75、100、125 mg/L，氨芐青霉素 0、25、50、75、100、125 mg/L，頭孢噻肟鈉0、100、200、300、400、500 mg/L，潮霉素0、10、20、30、40、50 mg/L。

1.3 菌種活化培養(yǎng)與接種

將液氮中保藏的刺芹側(cè)耳“國森1號”菌種轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)皿中進行活化培養(yǎng)，待菌絲長滿平板時用打孔器打孔，將打孔菌塊分別接種到含有4種抗生素不同濃度的培養(yǎng)皿中，并用封口膜封口，然后將其置于25 ℃培養(yǎng)房中進行恒溫培養(yǎng)。每種抗生素、每個濃度梯度接種3組作為平行對照。

1.4 測定項目

觀察記錄不同種類、不同濃度下抗生素培養(yǎng)皿中的刺芹側(cè)耳菌落形態(tài)、菌絲生長速率、抗生素對菌絲生長的抑制率。即在刺芹側(cè)耳菌絲培養(yǎng)10 d時，觀察記錄培養(yǎng)皿中刺芹側(cè)耳菌絲的生長狀態(tài)，測量計算每個培養(yǎng)皿中刺芹側(cè)耳菌絲生長速率和抗生素對菌絲生長的抑制率。計算公式為：菌絲生長速率（mm/d）=菌絲生長長度÷菌絲培養(yǎng)天數(shù)；抗生素對菌絲生長的抑制率（%）=(對照菌絲生長速率-抗生素處理菌絲生長速率) ÷對照菌絲生長速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

經(jīng)試驗期間觀察，刺芹側(cè)耳菌絲在含有卡那霉素抗生素的培養(yǎng)皿中生長正常，菌絲潔白均勻，長勢旺盛，與對照培養(yǎng)皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。由表1可知，刺芹側(cè)耳菌絲生長速度隨著卡那霉素濃度的升高而降低；卡那霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長具有輕微的抑制作用，但僅在濃度為125 mg/L時，卡那霉素對菌絲生長的抑制率高于10%。因此，卡那霉素不適合作為刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素進行使用。

表1 卡那霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

2.2 氨芐青霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

經(jīng)試驗期間觀察，刺芹側(cè)耳菌絲在含有氨芐青霉素抗生素培養(yǎng)皿中生長正常，菌絲厚實健壯，潔白濃密，平滑均勻，與對照培養(yǎng)皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。由表2可知，低濃度的氨芐青霉素可以促進刺芹側(cè)耳菌絲生長，雖然隨著氨芐青霉素濃度的升高，對刺芹側(cè)耳菌絲生長的抑制率也隨之增加（濃度為50 ml/L除外），但是氨芐青霉素并不會抑制刺芹側(cè)耳菌絲生長。因此，氨芐青霉素不適合作為刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素進行使用，但可用作根癌農(nóng)桿菌侵染刺芹側(cè)耳菌絲受體后抑制根癌農(nóng)桿菌生長的抗生素，其在抑制根癌農(nóng)桿菌生長的同時不會影響刺芹側(cè)耳菌絲的生長。

表2 氨芐青霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

2.3 頭孢噻肟鈉對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

由表3可知，頭孢噻肟鈉對刺芹側(cè)耳菌絲生長沒有明顯的抑制效果，且經(jīng)試驗期間觀察，在含有不同濃度頭孢噻肟鈉抗生素的培養(yǎng)皿中，刺芹側(cè)耳菌絲都能正常生長，菌落形態(tài)規(guī)則、齊整，與對照培養(yǎng)皿中的菌絲生長狀況無明顯差異。因此，頭孢噻肟鈉可用作根癌農(nóng)桿菌侵染刺芹側(cè)耳菌絲受體后抑制根癌農(nóng)桿菌生長的抗生素，其在抑制根癌農(nóng)桿菌生長的同時不會影響刺芹側(cè)耳菌絲的生長。

表3 頭孢噻肟鈉對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

2.4 潮霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

由表4可知，濃度為10 mg/L的潮霉素已經(jīng)對刺芹側(cè)耳菌絲生長有明顯的抑制效果，當濃度達到40 mg/L時，潮霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的抑制率達96.95%，當濃度達到50 mg/L時，刺芹側(cè)耳菌絲無法生長，被完全抑制。同時，經(jīng)試驗期間觀察，在含有不同濃度潮霉素的抗生素培養(yǎng)皿中，刺芹側(cè)耳的接種菌塊顏色變深、發(fā)黑，菌絲發(fā)黃發(fā)黑、稀疏細弱，無法正常生長。因此，潮霉素可用作刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素。

表4 潮霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長的影響

3 小結(jié)與討論

篩選標記基因是一種已知序列或已知功能的基因，在遺傳轉(zhuǎn)化中擔負著區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子的重要作用。在篩選壓力下，不含標記基因及其產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)化子死亡，而轉(zhuǎn)化子由于具有抗性，可以繼續(xù)存活，因而有利于區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子[14]。因此，合適的篩選標記基因及其相應的篩選劑是生物體遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。

卡那霉素是遺傳轉(zhuǎn)化研究中被廣泛應用的抗生素篩選劑。本研究發(fā)現(xiàn)，在卡那霉素不同試驗濃度下，刺芹側(cè)耳菌絲生長正常，表明卡那霉素對刺芹側(cè)耳菌絲生長沒有顯著的抑制效果，不能達到區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子的目的。因此，卡那霉素不適合作為刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素進行使用。

潮霉素是植物中應用較廣泛的篩選抗生素，其作用機理是潮霉素可以穩(wěn)定核糖體大亞基上的tRNA結(jié)合位點，導致空載tRNA不能脫離核糖體，進而影響細胞蛋白質(zhì)的翻譯，從而抑制植物細胞的形成和生長[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，刺芹側(cè)耳菌絲對潮霉素異常敏感，濃度為50 mg/L的潮霉素即能完全抑制菌絲生長，而攜帶潮霉素抗性基因hpt的載體可編碼一種潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶可使潮霉素發(fā)生磷酸化而失活，從而使轉(zhuǎn)化子不受潮霉素的毒害作用，最終達到篩選目的[16]。因此，潮霉素可以作為刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素進行使用。

在食用菌的遺傳轉(zhuǎn)化試驗中，攜帶載體的根癌農(nóng)桿菌侵染完成后需清除多余的根癌農(nóng)桿菌，避免影響受體菌絲的正常生長。而氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉均可抑制根癌農(nóng)桿菌的生長，且在本研究中發(fā)現(xiàn)，在不同試驗濃度下，氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉均對刺芹側(cè)耳菌絲生長沒有抑制效果，在一定濃度下反而能促進菌絲生長。因此，在刺芹側(cè)耳遺傳轉(zhuǎn)化研究中，可選擇氨芐青霉素和頭孢噻肟鈉用于抑制根癌農(nóng)桿菌生長。