蔡 羽 ，曾 珉 ，陳運(yùn)中

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 湖北省中藥保健食品工程技術(shù)研究中心 武漢 430065）

2019 年底，武漢地區(qū)首先報(bào)道爆發(fā)新型冠狀肺炎（COVID-19），新冠肺炎被世界衛(wèi)生組織定義為“全球大流行”；到目前為止全球疫情統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示已累計(jì)確診超過(guò)1115 萬(wàn)人，死亡人數(shù)接近53 萬(wàn)人，COVID-19 對(duì)社會(huì)造成一定的負(fù)面影響，同時(shí)值得一提的是，新型冠狀肺炎發(fā)源地尚不明確，中國(guó)對(duì)武漢不明原因肺炎疫情反應(yīng)快速、態(tài)度公開(kāi)透明。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7 版）》提及新冠病毒的病原學(xué)特點(diǎn)是其屬于β屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140 nm；流行病學(xué)顯示，該病可通過(guò)呼吸道飛沫、糞口以及接觸等方式傳染[1]。SARS-CoV-2利用S蛋白與機(jī)體的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）蛋白結(jié)合實(shí)現(xiàn)入侵過(guò)程，其入侵機(jī)理與SARS-CoV相類似，病毒入侵后機(jī)體出現(xiàn)炎癥因子失調(diào)，產(chǎn)生炎癥過(guò)度反應(yīng)，加快病情并且產(chǎn)生多器官衰竭等臨床表現(xiàn)。研究表明，ACE2 是SARS-CoV-2 入侵機(jī)體的關(guān)鍵因子，其分布于在肺、心臟、睪丸、大動(dòng)脈、腎臟和腸道等器官組織，同時(shí)SARS-CoV-2 侵入機(jī)體后，普通型和輕癥只是出現(xiàn)干咳、發(fā)熱和全身乏力，當(dāng)轉(zhuǎn)化為重癥后，患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭等嚴(yán)重臨床癥狀[2-4]。

在無(wú)特效藥和疫苗的情況下，中醫(yī)藥在抗擊新冠疫情發(fā)揮著重要的作用，其中在91.5%確診病例使用，有效治療率達(dá)到90%以上，特別是《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7 版）》中推薦的“三藥三方”[2,5]，在中西醫(yī)思想并重的指導(dǎo)下，展示出良好的臨床治療效果。在中醫(yī)藥辨證論治、動(dòng)態(tài)觀、整體觀的思想指導(dǎo)下，結(jié)合臨床實(shí)踐總結(jié)凝練出“三藥三方”：化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、血必凈注射液[5]，“三藥三方”具有減輕發(fā)熱癥狀、減少激素用量和減輕并發(fā)癥等方面作用，同時(shí)在改善嘔惡、便秘癥狀、退熱、控制病情進(jìn)展、靶器官保護(hù)和維護(hù)心肺腎功能等方面具有作用，另外其與西藥相比，表現(xiàn)為縮短臨床癥狀消失時(shí)間和減少平均住院時(shí)間，同時(shí)降低普通型轉(zhuǎn)化為危重型的幾率。

基于多成分-多靶點(diǎn)-多通路的中藥治療，其藥理機(jī)理較為復(fù)雜，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用初步闡述了藥物作用機(jī)理，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究中醫(yī)藥的有效方法，也是中醫(yī)現(xiàn)代化的關(guān)鍵之一，其有利于詳細(xì)解釋中醫(yī)藥發(fā)揮的系統(tǒng)調(diào)控作用。同時(shí)分子對(duì)接能夠從分子水平解釋化合物和蛋白質(zhì)結(jié)合情況，從分子角度上揭示藥物作用的具體機(jī)理[6-8]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究方法，以辨證論治、治病求因、正氣存內(nèi)、已病防變的中醫(yī)思想指導(dǎo)下，收集和分析“三藥三方”的成分、靶點(diǎn)和通路，構(gòu)建靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)并且進(jìn)行KEGG 富集，探尋“三藥三方”治療COVID-19 的功能調(diào)控關(guān)系，并且比較不同復(fù)方作用機(jī)理的異同初步分析“三藥三方”治療新冠肺炎的分期治療特點(diǎn)，展現(xiàn)中醫(yī)藥整體治療和辨證治療的特色。

1 材料與方法

1.1 成分和靶點(diǎn)信息收集

從《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第7版）》中查找“三藥三方”的復(fù)方組成，分別收集6 種復(fù)方的藥材組成成分，初步構(gòu)建中藥復(fù)方數(shù)據(jù)庫(kù)[1]。復(fù)方藥材成分及其關(guān)鍵靶點(diǎn)的收集是通過(guò)ETCM 中藥數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcmip.cn/ETCM/）實(shí)現(xiàn)，ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)包含中醫(yī)藥綜合信息，特別是復(fù)方、藥材、成分和靶點(diǎn)[9]。另外，利用BATMAN 數(shù)據(jù)庫(kù)完善藥材、成分和靶點(diǎn)信息。

1.2 交集分析

疾病靶點(diǎn)基因包含5556 種與ACE2 共表達(dá)的基因，其是通過(guò)結(jié)腸上皮細(xì)胞單細(xì)胞序列鑒定結(jié)果[10]。對(duì)各自的復(fù)方成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，最終獲得各自復(fù)方的藥理作用關(guān)鍵靶點(diǎn)，并且利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[11]。同時(shí)通過(guò)TBtools 生信分析工具來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)6 個(gè)復(fù)方的藥材、化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用 STRING 數(shù)據(jù) 庫(kù)（https://string-db. org/cgi/input.pl）構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)[12]，利用Cytoscape 軟件對(duì)PPI 靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析處理，并且利用MCODE 插件實(shí)現(xiàn)分解模塊的功能，從而達(dá)到復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分模塊的處理[13]。

1.4 KEGG通路富集

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行KEGG 通路分析，分別將6 個(gè)復(fù)方的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及交集靶點(diǎn)共7 組數(shù)據(jù)導(dǎo)入到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析。同樣地，7 組數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進(jìn)行富集分析，獲取通路以及生物過(guò)程的關(guān)聯(lián)[14,15]。兩種數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，互相對(duì)比補(bǔ)充地揭示復(fù)方藥理作用機(jī)制，以及從多種角度獲取復(fù)方通路作用的異同。

1.5 分子對(duì)接分析

利用分子對(duì)接數(shù)據(jù)庫(kù)（https://ncov.schanglab.org.cn/index.php）對(duì)化合物與蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)接[16]，具體化合物以及蛋白質(zhì)見(jiàn)表6，13 種交集化合物與12 種關(guān)鍵蛋白完成分子對(duì)接模型實(shí)驗(yàn)。

另外利用D3Targets-2019-nCoV 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.d3pharma.com/D3Targets-2019-nCoV/index.php）對(duì)“三藥三方”中活性化合物與新冠病毒肺炎相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接，具體化合物和靶點(diǎn)見(jiàn)表7，12種化合物均是“三藥三方”活性化合物，具有潛在的生物活性和藥理治療活性，14 種蛋白質(zhì)與新冠病毒藥物研究靶點(diǎn)相關(guān)[17]。

1.6 復(fù)方分析

通過(guò)ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集復(fù)方的性質(zhì)包括藥味歸經(jīng)等數(shù)據(jù)，對(duì)于上述提到不存在的藥材從網(wǎng)絡(luò)獲取信息，獲取復(fù)方信息后利用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)造，同時(shí)繪制藥材性質(zhì)比例圖，以及對(duì)復(fù)方數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析和對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方成分與靶點(diǎn)收集

最終收集到6種復(fù)方化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊和血必凈注射液，分別命名為復(fù)方1（Formula 1）、復(fù)方2（Formula 2）、復(fù)方 3（Formula 3）、復(fù)方 4（Formula 4）、復(fù)方 5（Formula 5）和復(fù)方6（Formula 6），同時(shí)繪制復(fù)方化合物和靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表格（表1）。復(fù)方6包含最少藥材、化合物和靶點(diǎn)數(shù)量，復(fù)方2包含最多的藥材、化合物和靶點(diǎn)數(shù)量。具體來(lái)講，復(fù)方1 包含14 種中藥，562 種成分和1195 種潛在靶點(diǎn)，其中甘草（licorice）包含較多的化合物成分，蒼術(shù)（Atractylodes Lancea（Thunb.）Dc.）包含較多的潛在靶點(diǎn)；復(fù)方2 包含21 種中藥、829 種成分和1477 種潛在靶點(diǎn)，其中甘草（licorice）包含較多化合物成分，山藥（Rhizoma Dioscoreae）包含較多的潛在靶點(diǎn)；復(fù)方 3 包含 13 種中藥、502 種化合物成分和 1231 種潛在靶點(diǎn)，其中甘草（licorice）包含較多化合物成分，蒼術(shù)（Atractylodes Lancea（Thunb.）Dc.）包含較多的潛在靶點(diǎn)；復(fù)方4包含12種中藥、481種化合物成分和1221種潛在靶點(diǎn)，其中知母（Anemarrhenae Rhizoma）包含較多化合物成分，薏苡仁（Fritillariae Thunbrgii Bulbus）包含較多潛在靶點(diǎn)；復(fù)方5 包含13 種中藥、546 種化合物成分和1399 種潛在靶點(diǎn)，其中甘草（licorice）包含較多的化合物成分，板藍(lán)根（Isatidis Radix）包含較多的潛在靶點(diǎn)；復(fù)方6包含5種中藥、266種化合物成分和750種潛在靶點(diǎn)，其中丹參（Radix Salviae）包含較多的化合物，紅花（Carthami Flos）包含較多的潛在靶點(diǎn)。

2.2 復(fù)方交集分析

復(fù)方的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過(guò)交集分析得到各自的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并且繪制各自的Venn 圖（圖1）。復(fù)方1到復(fù)方 6 的核心靶點(diǎn)分別有256、318、47、264、305 和175 個(gè)，其中復(fù)方2 靶點(diǎn)最多，復(fù)方3 靶點(diǎn)最少，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化處理。

利用Venn圖和TBtools工具獲取6種復(fù)方的藥材、化合物和靶點(diǎn)的交集，并且繪制可視化圖形（圖2）。對(duì)于化合物而言，6 種復(fù)方的共同交集化合物有6 個(gè)，具體為 Lauric Acid（月桂酸）、Sitosterol（谷甾醇）、Alexandrin（胡蘿卜甙）、Chuanxiongzine（川芎嗪）、Cetylic Acid（棕櫚酸）和Oleanolic Acid（齊墩果酸）；對(duì)于藥材而言，6種復(fù)方?jīng)]有共同的藥材交集；對(duì)于關(guān)鍵靶點(diǎn)而言，6種復(fù)方的共同關(guān)鍵靶點(diǎn)交集數(shù)量有25種，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，完成關(guān)鍵交集靶點(diǎn)的表格繪制（表2）。關(guān)鍵交集靶點(diǎn)中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹芍?，Cytochrome P450 2B6（細(xì)胞色素P450 2B6）、Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter（ABCG2 廣譜底物特異性 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 ABCG2）、Cytochrome P450 2C19（細(xì)胞色素 P450 2C19）和 ATP-dependent translocase ABCB1（ATP 依賴性轉(zhuǎn)位酶ABCB1）的Degree（連接程度）較高；細(xì)胞色素P450 2C19、Amine oxidase（細(xì)胞色素P450 2B6、胺氧化酶）和Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-2（γ-氨基丁酸受體亞單位α-2）的Betweenness（中介中心性程度）較高；細(xì)胞色素P450 2B6、廣譜底物特異性ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2、細(xì)胞色素P450 2C19 和 ATP 依 賴 性 轉(zhuǎn) 位 酶 ABCB1）的 Closeness Centrality（緊密中心性）程度較高。

2.3 蛋白互作分析

通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)軟件的使用，最終完成圖3-圖4 的繪制。復(fù)方1 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含244 個(gè)點(diǎn)和1394 條邊，其中靶點(diǎn)連接度高的靶點(diǎn)是MAPK3、GAPDH、ESR1、NRNH4等靶點(diǎn)；復(fù)方2的PPI網(wǎng)絡(luò)圖包含308 個(gè)點(diǎn)和1963 條邊，其中連接度高的靶點(diǎn)是GAPDH、MAPK3、EGF、ACTB、ESR1 等靶點(diǎn)；復(fù)方3 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含35 個(gè)點(diǎn)和80 條邊，其中連接度高的是CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、ABCB1 和 ABCG2 等靶點(diǎn)；復(fù)方 4 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含 254 個(gè)點(diǎn)和 1442 條邊，其中連接度高的靶點(diǎn)是GAPDH、MAKP3、ESR1、PPARG和 ACTB；復(fù)方 5 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含 291 個(gè)點(diǎn)和 1814 條邊，其中連接度高的靶點(diǎn)是GAPDH、MAKP3、PPARG、ESR1 和 ATP5B；復(fù)方 6 的 PPI 網(wǎng)路圖包含 159 個(gè)點(diǎn)和669 條邊，其中連接度高的靶點(diǎn)是CYP2B6、ESR1、PPARG、ABCB1、ABCG2 和 SOD1；交集靶點(diǎn)的 PPI 網(wǎng)路圖包含19 個(gè)點(diǎn)和48 條邊，其中連接度高的靶點(diǎn)是GABRE、GABRB1 和GABRA2，另外PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅慕Y(jié)果展示 Degree，Closeness Centrality 和 Betweenness，其結(jié)果見(jiàn)表2。利用MCODE 插件對(duì)7 個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行子模塊的分析，并且完成分模塊圖形的繪制。復(fù)方中PPI 網(wǎng)絡(luò)圖分解模塊分別含有11、12、4、9、8、8 和2個(gè)分模塊，各復(fù)方含有各自的分模塊，但對(duì)于ABCB1等共同靶點(diǎn)6 個(gè)復(fù)方具有相似性，靶點(diǎn)具有相似性的分模塊。特別是在交集關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 分模塊中，存在7-蛋白功能網(wǎng)路和3-蛋白功能，其中7-蛋白功能網(wǎng)路包含細(xì)胞色素P450 與ATP 相關(guān)蛋白、核受體的關(guān)聯(lián)，3-蛋白功能網(wǎng)絡(luò)包含γ-氨基丁酸受體之間的關(guān)聯(lián)。同時(shí)利用Omicsmean 數(shù)據(jù)庫(kù)分析核心靶點(diǎn)PPI 分模塊蛋白的生物功能，詮釋“三藥三方”分模塊蛋白發(fā)揮的生物功能，展示蛋白的GO 生物過(guò)程以及KEGG通路，繪制表3顯示“三藥三方”分模塊蛋白生物功能。

表1 6種復(fù)方的化合物和靶點(diǎn)信息

續(xù)表

2.4 KEGG通路分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，最終各復(fù)方得到52、57、13、45、49 和 38 條 KEGG 通路，并且交集靶點(diǎn)調(diào)控16 條KEGG 通路，并且使用R 語(yǔ)言畫出交集靶點(diǎn)的通路氣泡圖（圖5），最終得到各復(fù)方調(diào)控7條KEGG 通路交集，與交集靶點(diǎn)調(diào)控通路進(jìn)行合并得到16 條KEGG通路，并對(duì)其進(jìn)行分類制作成表格（表4）。通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵靶點(diǎn)得到具體生物通路的關(guān)聯(lián)圖，同時(shí)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用從不同角度說(shuō)明關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物通路調(diào)控，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的結(jié)果具有相似性，DAVID 得到的是整體范圍的通路調(diào)控，而Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)則更強(qiáng)調(diào)的是通路關(guān)聯(lián)程度，同時(shí)繪制復(fù)方的性質(zhì)、通路的異同表格（表5）?！叭幦健苯患P(guān)鍵靶點(diǎn)共同參與調(diào)控具體表現(xiàn)為：①神經(jīng)保護(hù)作用；②免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風(fēng)暴調(diào)節(jié)；③內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控；④能量代謝調(diào)控；⑤藥物代謝；⑥其他通路。同時(shí)表5反映復(fù)方調(diào)控生物通路的關(guān)聯(lián)性和區(qū)別性，復(fù)方共同調(diào)控神經(jīng)保護(hù)、能量代謝、炎癥和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，復(fù)方也反映各自功能生物通路調(diào)控的獨(dú)特之處，復(fù)方4 和復(fù)方5 參與ACE2 相關(guān)的通路，表現(xiàn)出與ACE2 相關(guān)通路的調(diào)控，復(fù)方4 和復(fù)方5 發(fā)揮藥理作用影響到SARS-CoV-2 利用S 蛋白與ACE2 蛋白結(jié)合的過(guò)程，其反映阻止病毒入侵的藥理作用。

圖1 6種復(fù)方靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的Venn交集

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)分子對(duì)接數(shù)據(jù)庫(kù)最終得到對(duì)接結(jié)合分?jǐn)?shù)能量表格（表6），同時(shí)利用Discovery Studio 軟件將對(duì)接結(jié)果可視化（圖6）。交集化合物分子對(duì)接結(jié)合力普遍不高，說(shuō)明交集共同化合物發(fā)揮直接藥理作用較弱，側(cè)面反應(yīng)通過(guò)其他化合物發(fā)揮藥理作用，同時(shí)也有部分化合物與蛋白質(zhì)分子結(jié)合情況好，圖6 列舉部分結(jié)合情況好的復(fù)合物，展示部分化合物與殘基的作用情況。蛋白質(zhì)二維結(jié)合圖反映化合物與具體氨基酸殘基的相互作用，部分化合物與關(guān)鍵蛋白質(zhì)以分子間相互作用為主，同時(shí)存在靜電相互作用，另外二維蛋白質(zhì)作用圖反映具體氨基酸殘基的作用情況。

對(duì)于交集化合物與特定關(guān)鍵蛋白結(jié)合強(qiáng)的情況，Alexandrin（胡蘿卜甙）與Papain-like protease（木瓜蛋白酶類水解酶）、Nsp14（N7-MTase）（非結(jié)構(gòu)蛋白C 端鳥(niǎo)嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶）和E protein（ion channel）（包膜小膜蛋白）表現(xiàn)良好的結(jié)合能力，木瓜蛋白酶類水解酶與Mpro（主蛋白酶）一起切割病毒基因組翻譯的蛋白前體，得到非結(jié)構(gòu)蛋白，replicase-transcriptase complex（組裝復(fù)制-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體），除了參加切割加工的蛋白酶活性外，其是SARS 病毒編碼的宿主干擾素拮抗蛋白，其在SARS 調(diào)節(jié)宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[18]；Nsp14（非結(jié)構(gòu)蛋白14）具有雙重酶活性，與Nsp10（非結(jié)構(gòu)蛋白10）形成復(fù)合物發(fā)揮功能，C 端結(jié)構(gòu)域具有鳥(niǎo)嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，負(fù)責(zé)對(duì) mRNA 加帽，SARS 冠狀病毒 nsp14 近 C 端區(qū)域有鳥(niǎo)嘌呤-N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，其在RNA 加帽過(guò)程起著重要作用，且其活性依賴nsp14 近N 端核酸外切酶活性區(qū)域的存在[19]；Envelop small membrane protein（包膜小膜蛋白）形成五聚體并具有離子通道功能，同時(shí)E蛋白與病毒入侵宿主緊密相關(guān)，其被認(rèn)為與病毒的感染能力相關(guān)[20]。胡蘿卜甙與上述3 種關(guān)鍵蛋白質(zhì)結(jié)合力強(qiáng)，其阻斷病毒的潛在藥理作用涉及到切割病毒基因組翻譯的蛋白前體、調(diào)節(jié)宿主抗病毒免疫反應(yīng)、阻斷mRNA 加帽以及影響介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。Oleanolic Acid（石竹素）與RdRp with RNA RNA（依賴的RNA 聚合酶）、Nsp16（2'-O-MTase）（2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）和包膜小膜蛋白表現(xiàn)良好結(jié)合能力。同時(shí)RNA依賴的RNA 聚合酶結(jié)構(gòu)包括Nsp12 與RNA，在病毒基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，同時(shí)與病毒引起宿主免疫反應(yīng)相關(guān)[21]；Nsp16（2'-O-MTase）（2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）通過(guò)對(duì)核苷酸核糖添加甲基化修飾，可幫助病毒逃避宿主的識(shí)別而逃避宿主的天然免疫，針對(duì)其設(shè)計(jì)的抑制劑可有效抑制病毒的復(fù)制，對(duì)病毒的有效增殖以及RNA 的合成和穩(wěn)定起著重要作用[22]。通過(guò)上述3種關(guān)鍵蛋白Oleanolic Acid（石竹素）表現(xiàn)出阻止SARS-CoV-2 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、增殖和介導(dǎo)影響病毒侵入機(jī)體的潛在藥理作用。

表2 6種復(fù)方交集靶點(diǎn)信息

圖2 6種復(fù)方的功能交集圖

圖3 交集靶點(diǎn)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)于“三藥三方”活性成分與新冠病毒相關(guān)蛋白結(jié)合情況，繪制表7 具體說(shuō)明化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，結(jié)果主要反映活性化合物與新冠病毒受體相關(guān)蛋白的結(jié)合情況，對(duì)接結(jié)果整體結(jié)合情況較好。其中ACE2 是SARS-CoV-2 入侵機(jī)體的關(guān)鍵因子，跨膜蛋白酶TMPRSS2 能夠激活高致病性人冠狀病毒的突觸蛋白，其可裂解并激活SARS-CoV 的S 蛋白進(jìn)行膜融合，同時(shí)TMPRSS2 與金屬蛋白酶ADAM17 在結(jié)合ACE2 時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，ADAM17 除與病毒感染相關(guān)，其還可介導(dǎo)心肌病和糖尿病，能夠介導(dǎo)ACE2 膜上脫落調(diào)節(jié)心血管功能[2,22,23]。SARS-CoV 可能通過(guò)S 蛋白上的高甘露聚糖與質(zhì)膜上的CD209L 結(jié)合，再介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，其可能是SARS-CoV的弱受體，研究表明CD209L 的多肽區(qū)域變體的雜合表達(dá)可能會(huì)改變病毒與配體的結(jié)合能力，炎性因子在SARS 感染中同樣起作用，其有助于增加SARS 的易感性[24,25]。DHODH 抑制劑可對(duì)輪狀病毒具有抗病毒作用，同時(shí)輪狀病毒與冠狀病毒屬于RNA 病毒，同時(shí)最近發(fā)現(xiàn)DHODH 的新型有效抑制劑對(duì)RNA病毒具有廣譜抗病毒感染的特點(diǎn)[26]。3CLPro 是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)[27]。Cathepsin L（組織蛋白酶），其是SARS 病毒的S 蛋白與細(xì)胞膜融合時(shí)必須的一種酶[28]。上述蛋白質(zhì)為治療新冠病毒的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)，驗(yàn)證活性化合物與上述蛋白質(zhì)有利于闡述“三藥三方”的潛在治療性，為“三藥三方”基礎(chǔ)研究和臨床研究提供理論證據(jù)。

圖4 交集靶點(diǎn)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)MCODE模塊分解圖

表3 核心靶點(diǎn)PPI分模塊蛋白生物通路功能

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

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續(xù)表

續(xù)表

2.6 復(fù)方分析結(jié)果

通過(guò)Cytoscape 軟件繪制出藥材的歸經(jīng)、藥性和藥味的網(wǎng)絡(luò)圖（圖7-圖9），同時(shí)繪制藥材歸經(jīng)、藥味和藥性的百分比堆積柱狀圖（圖10）。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)圖以及百分比堆積柱狀圖可知，對(duì)于歸經(jīng)而言復(fù)方1 到復(fù)方5以肺經(jīng)為主，其余不同復(fù)方在脾經(jīng)、心經(jīng)和胃經(jīng)占據(jù)一定重要比例，而復(fù)方6則以肝經(jīng)為主，其次的是脾經(jīng)和心經(jīng)；對(duì)于藥性而言，復(fù)方1 到復(fù)方5 分別是寒性藥和溫性藥各占據(jù)各自的重要比例，而復(fù)方6 則以溫性要為主，不存在寒性藥；對(duì)于藥味而言，6 種復(fù)方均具有相似性，均是苦味藥、辛味藥和甘味藥各占重要比例，只是占據(jù)比重分配不同。

3 討論

化濕敗毒方、清肺排毒湯、宣肺敗毒方、金花清感顆粒、蓮花清瘟膠囊和血必凈注射液這“三藥三方”在抗擊新冠疫情發(fā)揮著重要的作用，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中醫(yī)理論系統(tǒng)分析“三藥三方”的潛在治療機(jī)制和各自藥材的性味歸經(jīng)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢搜集“三藥三方”6 種復(fù)方的成分、靶標(biāo)信息、藥味、藥性和歸經(jīng)情況，并且構(gòu)建各自復(fù)方以及共同靶點(diǎn)的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，分析靶點(diǎn)干預(yù)的生物學(xué)過(guò)程和KEGG通路，通過(guò)可視化呈現(xiàn)復(fù)方的藥理特點(diǎn)，從多角度揭示6 種復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)-多通路的藥理分子機(jī)理。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，通過(guò)ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取“三藥三方”的成分、靶點(diǎn)和藥味歸經(jīng)，ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)包含 402 種中藥、3962 種復(fù)方、7284 種中藥成分、2266種靶點(diǎn)和4323種相關(guān)疾病，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究使用較多的數(shù)據(jù)庫(kù)—TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)包含499種中藥和12144 種化合物，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比得出ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中藥和成分查詢存在數(shù)量上的差異，但同時(shí)其靶點(diǎn)預(yù)測(cè)是基于MedChem Studio 軟件和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，然后建立較為完備的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，故靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和查全性具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)注重中醫(yī)藥信息庫(kù)的建立，包括中藥復(fù)方、藥味歸經(jīng)等信息，針對(duì)本研究使用的藥味歸經(jīng)，其與實(shí)際藥味歸經(jīng)相符合?？偟膩?lái)說(shuō)，通過(guò)從ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取“三藥三方”成分、靶點(diǎn)和藥味歸經(jīng)符合準(zhǔn)確性、查全性，但介于本研究重點(diǎn)比較“三藥三方”的生物機(jī)理的異同和分期治療特點(diǎn)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)仍然具有一定局限性，特別是對(duì)于血清和組織藥物化學(xué)、多成分藥代動(dòng)力學(xué)的研究不足，同時(shí)僅僅基于ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)核心指標(biāo)篩選復(fù)方成分、靶點(diǎn)，未按照常規(guī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)口服吸收率（OB）、類藥性（DL）等生物指標(biāo)篩選活性化合物進(jìn)而進(jìn)一步預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

表4 合并通路的具體分類

表5 復(fù)方特征以及功能調(diào)控通路異同

圖5 交集靶點(diǎn)的通路氣泡圖

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析，6種復(fù)方中有6個(gè)化合物交集和25 個(gè)交集靶點(diǎn)，無(wú)藥材交集，并且通過(guò)通路分析得到16條通路，并且識(shí)別了各自的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)并且分解成各自功能的子模塊，特別是對(duì)于共同靶標(biāo)的2個(gè)功能模塊，包括γ-氨基丁酸受體亞基相互作用以及細(xì)胞色素、ATP 依賴轉(zhuǎn)位酶和核受體的相互作用，分模塊與藥物代謝、心血管調(diào)節(jié)和神經(jīng)調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。同時(shí)對(duì)于交集靶點(diǎn)富集后的通路，表明復(fù)方具有共同調(diào)節(jié)的功能，以及從不同角度闡述復(fù)方的關(guān)聯(lián)性以及不同點(diǎn)，初步揭示復(fù)方共同調(diào)控的生物通路：①神經(jīng)保護(hù)作用；②免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風(fēng)暴調(diào)節(jié)；③內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控；④能量代謝調(diào)控；⑤藥物代謝；⑥其他通路。具體分析如下：

圖6 部分交集化合物與蛋白質(zhì)對(duì)接圖

神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第7 版）》尸檢報(bào)告中，病理改變提及“腦組織充血、水腫，部分神經(jīng)元變性”[1]。相關(guān)研究報(bào)告SARSCoV-2 感染除了呼吸道癥狀外還存在神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，鐘南山團(tuán)隊(duì)研究表明在全國(guó)范圍內(nèi)的1099 例確證患者中頭痛比例13.6%[4]；同時(shí)有研究表明新冠病毒感染重癥患者伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為急性腦血管疾病和意識(shí)不清[29]；復(fù)方共同作用富集的通路包含神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路Serotonergic synapse（5-羥色胺能突觸）、GABAergic synapse（GABA 能突觸），這也反映復(fù)方對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的干預(yù)保護(hù)作用，特別是對(duì)于神經(jīng)學(xué)標(biāo)志物的影響，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能性相關(guān)聯(lián)。復(fù)方干預(yù)保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)于新冠感染的患者具有良好的治療作用和緩解癥狀的作用，特別是對(duì)重癥患者有安神作用，有益于恢復(fù)元?dú)狻?/p>

圖7 復(fù)方藥材歸經(jīng)圖

圖8 復(fù)方藥材藥味網(wǎng)絡(luò)圖

免疫調(diào)節(jié)以及抗炎癥風(fēng)暴調(diào)節(jié)。SARS-CoV-2感染后導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥免疫反應(yīng)，特別是一周后發(fā)生炎性介質(zhì)風(fēng)暴，免疫功能亢奮和炎癥介質(zhì)釋放，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一般為CRP、TNF 和IL-6 指標(biāo)升高，進(jìn)一步導(dǎo)致病情惡化并且出現(xiàn)多器官衰竭和急性呼吸窘迫綜合癥，并且是輕癥轉(zhuǎn)化為重癥的重要時(shí)間軸點(diǎn)。復(fù)方共同調(diào)控涉及到Linoleic acid metabolism（亞油酸代謝），Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝），特別是Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝），其主要用于合成炎癥介質(zhì)，并且介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子、白介素等，通過(guò)抑制花生四烯酸代謝通路，從而達(dá)到平衡炎癥介質(zhì)，緩釋炎癥細(xì)胞風(fēng)暴[30]。

圖9 復(fù)方藥材藥性網(wǎng)絡(luò)圖

圖10 藥材歸經(jīng)、藥味和藥性的百分比堆積柱狀圖

內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及性激素調(diào)控。復(fù)方共同調(diào)控涉及到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)特別是對(duì)于性激素調(diào)節(jié)的作用，有利于緩解癥狀達(dá)到臨床治療的目的。尤其是對(duì)于性激素的調(diào)控，有研究表明新冠感染存在性別差異，將77932 例患者納入薈萃分析，其中男性為41510 例，占比53.3%，男性患病比率高于女性[31]。有多個(gè)原因表明新冠感染的性別差異，而最為關(guān)鍵的因素是SARSCoV-2 激活S 蛋白的過(guò)程中會(huì)利用到絲氨酸蛋白酶TMPRSS2，而絲氨酸蛋白酶TMPRSS2是促進(jìn)男性前列腺癌的關(guān)鍵因子，其受到雄性激素的正向調(diào)控[32]。而復(fù)方共同調(diào)劑通路中涉及到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，性激素的調(diào)節(jié)通路Ovarian steroidogenesis（卵巢類固醇生成），這對(duì)于新冠病毒感染有潛在的治療作用。

能量代謝調(diào)控。中醫(yī)藥通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路調(diào)控，辨證治療疾病，而能量代謝通路恰恰體現(xiàn)不同復(fù)方的辨證觀和整體觀治療。新冠患者往往會(huì)出現(xiàn)多器官損傷，如果患者營(yíng)養(yǎng)代謝狀態(tài)不良并且不及時(shí)干預(yù)，對(duì)于治療存在不利影響甚至?xí)夯∏椤６谥嗅t(yī)藥指導(dǎo)下的復(fù)方調(diào)節(jié)，不僅起到直接的藥理作用，并且通過(guò)多角度治療緩解癥狀，通過(guò)能量代謝通路 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣的重吸收），Bile secretion（膽汁分泌），Metabolic pathways（代謝通路）以及Retinol metabolism（視黃醇代謝），具體來(lái)講是為細(xì)胞供能并且保護(hù)心肌細(xì)胞。

藥物代謝。復(fù)方共同調(diào)控通路涉及到藥物代謝，這對(duì)于復(fù)方的藥理吸收以及發(fā)揮作用起著輔助作用，并且與上述PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的子模塊相呼應(yīng)，子模塊中細(xì)胞色素之間存在關(guān)聯(lián)，特別對(duì)于細(xì)胞色素P450是藥物代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，這利于復(fù)方發(fā)揮藥理作用，從而達(dá)到臨床治療作用[33]。

其他通路。對(duì)于其他通路，涉及到成癮性相關(guān)的通路，臨床上未報(bào)到對(duì)復(fù)方產(chǎn)生依賴性，并且也無(wú)出現(xiàn)成癮性相關(guān)的副作用，因?yàn)閺?fù)方起到神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于中樞神經(jīng)有影響作用，可能復(fù)方共同調(diào)控存在潛在的鎮(zhèn)痛作用，目前也無(wú)相關(guān)的研究報(bào)告，鎮(zhèn)痛作用也只是復(fù)方共同作用的潛在可能性，需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證。

同時(shí)復(fù)方4、復(fù)方5涉及到與Angiotensin-converting enzyme（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）蛋白相關(guān)的通路調(diào)節(jié)，而ACE2 是SARS-CoV-2 病毒的功能受體，在SARSCoV-2 感染的病人中存在ACE2 的高表達(dá)[3]。而復(fù)方4和復(fù)方5 有直接調(diào)控涉及到ACE2 的通路——Reninangiotensin system（腎素-血管緊張素系統(tǒng)），通過(guò)調(diào)控平衡ACE與ACE2蛋白達(dá)到治療目的。

對(duì)于6種復(fù)方理論分析、實(shí)驗(yàn)以及臨床驗(yàn)證，證明“三藥三方”具有治療新冠病毒的藥理作用?；瘽駭《痉饺接?4 味中藥組成，其適用于輕型、普通型和重型患者治療，臨床上發(fā)揮綜合治療，可明顯縮短核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間和住院時(shí)間；該方對(duì)于新冠病毒感染的小鼠模型，可降低肺組織病毒載量30%，在對(duì)該方進(jìn)行生物信息研究發(fā)現(xiàn)，該方表現(xiàn)與病毒相關(guān)蛋白有結(jié)合力，同時(shí)表現(xiàn)出免疫炎癥相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，另外化濕敗毒顆粒獲得獲臨床試驗(yàn)批件[5]。在金銀潭醫(yī)院75 例重癥患者治療效果觀察中，其CT 診斷的肺部炎癥和臨床癥狀明顯改善，住院時(shí)間以及核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間平均縮短3 天；對(duì)將軍路街衛(wèi)生院210 例普通型患者臨床觀察，東西湖方艙醫(yī)院894例輕型和普通型（中藥化濕敗毒方組452例）臨床療效觀察，化濕敗毒方在核酸轉(zhuǎn)陰和癥狀改善方面有顯著差異，同時(shí)對(duì)服用化濕敗毒方的患者進(jìn)行肝腎功能追蹤檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)[5]。

清肺排毒湯全方由21味中藥組成，其功能在于清熱化濕、宣肺透邪和健脾化飲，適用于輕型、普通型、重癥、危重型患者治療。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究分析下，清肺排毒湯起到免疫、炎癥通路調(diào)節(jié)，并且對(duì)于干擾病毒的復(fù)制以及影響病毒蛋白相互作用[34]。在四川省16所單位收集的98例新冠患者資料中，輕型54例、普通型33 例和重型及危重型11 例均服用清肺排毒湯，檢測(cè)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查，治療9天后的總有效率達(dá)92.09%，其中痊愈率41.13%，顯效率為26.92%，有效率為24.04%，不良反應(yīng)發(fā)生率為0.07%[35]。在截至2 月5 日的清肺排毒方應(yīng)用統(tǒng)計(jì)中，214 例確診患者的總有效率達(dá)90%，其中60%以上患者癥狀和影像學(xué)改善明顯，30%患者癥狀平穩(wěn)且無(wú)加重[36]。在山西133 例確診患者中，103 例患者服用清肺排毒湯，臨床癥狀改善明顯，發(fā)熱癥狀3天全部消失，6天治療之后，肺部CT 病灶的吸收非常明顯；同時(shí)山西省548例疑似患者中，187例使用清肺排毒湯核酸轉(zhuǎn)陽(yáng)率為5.35%（10 例），未使用清肺排毒湯核酸轉(zhuǎn)陽(yáng)率為34.17%（123 例）[37]。在截至 3 月 23 日，在 66 個(gè)定點(diǎn)單位的1265 例病例觀察中，已經(jīng)有1241 例治愈出院，另外對(duì)于57 例重癥患者進(jìn)行臨床觀察，無(wú)1 例轉(zhuǎn)為危重癥，有42 例（占73.7%）患者治愈出院，同時(shí)未見(jiàn)肝腎損傷[38]。在湖北省第三人民醫(yī)院回歸性研究中，與單純抗病毒藥物對(duì)比，清肺排毒湯加減方聯(lián)合抗病毒藥物能顯著縮短COVID-19 肺部CT 好轉(zhuǎn)時(shí)間、臨床癥狀好轉(zhuǎn)時(shí)間及患者住院時(shí)間[39]。

宣肺敗毒方全方由13味中藥組成，該方可縮短新冠患者新冠肺炎患者臨床癥狀消失時(shí)間、平均住院天數(shù)、體溫復(fù)常時(shí)間等，可以在一定程度上阻止由輕癥和普通型轉(zhuǎn)為重型；同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明該方通過(guò)調(diào)控病毒感染，免疫炎癥，能量代謝等實(shí)現(xiàn)治療[5,40]。在湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、武漢市中醫(yī)院等單位開(kāi)展的120 例新冠患者宣肺敗毒方對(duì)照試驗(yàn)，宣肺敗毒方（70例）與對(duì)照組（50例）研究對(duì)照顯示，宣肺敗毒方與對(duì)照組相比其淋巴細(xì)胞恢復(fù)提高17%，同時(shí)臨床治愈率提高22%[5]。同時(shí)在江夏方艙里280 例新冠患者臨床觀察中，未出現(xiàn)重癥轉(zhuǎn)化情況，說(shuō)明宣肺敗毒方降低病危率有積極作用。

金花清感顆粒全方由12味中藥組成，其功效表現(xiàn)為疏風(fēng)宣肺、清熱解毒，適用于輕癥患者，具體表現(xiàn)為縮短退熱時(shí)間，對(duì)于淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞復(fù)常率有提高作用，同時(shí)降低重癥轉(zhuǎn)化率；在臨床觀察中，123 例患者中，金花清感顆粒顯著減輕輕型患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰臨床癥狀，并且能夠緩解患者心理焦慮；在武漢102輕癥和普通型病例中，轉(zhuǎn)重癥率明顯降低，僅為11.8%；在北京天佑醫(yī)院開(kāi)展的80 例對(duì)照研究，使用該方的患者相比對(duì)照組的核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間降低2 天半[5]。同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論分析出，該方通過(guò)病毒、細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)來(lái)達(dá)到治療效果。針對(duì)湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診123 例新冠感染患者，通過(guò)常規(guī)治療對(duì)照組與金花清感顆粒組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金花清感顆粒能夠顯著減輕新冠感染的臨床癥狀如發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰，但同時(shí)治療組表現(xiàn)較高的不良反應(yīng)率32.93%（27 例），均為腹瀉[41]。在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院的46例新冠感染病例中，19例使用連花清瘟膠囊、27 例使用金花清感顆粒，并且配合西醫(yī)治療手段，最終所有患者癥狀逐漸改善好轉(zhuǎn)出院，基于本研究未進(jìn)行分組研究中醫(yī)藥治療新冠肺炎，無(wú)具體對(duì)比反映中西醫(yī)的具體作用，但該研究能夠積極反映連花清瘟膠囊和金花清感膠囊對(duì)新冠肺炎的治療作用[42]。

連花清瘟膠囊是治療感冒的常用中成藥，能夠減少輕型、普通型轉(zhuǎn)重癥的發(fā)生，并且有利于核酸轉(zhuǎn)陰的時(shí)間；同時(shí)該方可以通過(guò)關(guān)鍵分子從而達(dá)到激活的抗病毒、抗炎等協(xié)同作用減輕新冠肺炎的癥狀；鐘南山科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)該方能顯著抑制SARS-CoV-2 在細(xì)胞中的復(fù)制，該方處理后細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒表達(dá)顯著減少，并能顯著抑制SARS-CoV-2感染細(xì)胞所致的TNF-a、IL-6、MCP-1和IP-10炎癥因子的基因過(guò)度表達(dá)，且具劑量依賴關(guān)系，證實(shí)了該方的抗病毒效果[5,43]。臨床研究表明，連花清瘟膠囊能縮短新冠感染患者核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間、發(fā)熱時(shí)間同時(shí)明顯緩解臨床癥狀[44]。單獨(dú)使用連花清瘟膠囊治療輕癥、普通型患者有效率達(dá)到100%，連花清瘟膠囊聯(lián)合阿比多爾有效縮短患者治療時(shí)間以及住院時(shí)間[45]。與113 例對(duì)照組相比，138 例連花清瘟膠囊聯(lián)合常規(guī)治療提高了患者主要癥狀消失率，同時(shí)對(duì)于次要癥狀有改善作用[46]。連花清瘟膠囊通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)SARS 病毒的治療指數(shù)為40.33，半數(shù)抑制濃度為3.63 mg·mL-1，同時(shí)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其能夠提高免疫功能，并且具有延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期、化痰和抗炎的作用[47]。

血必凈注射液由5 味中藥提取物組成，表現(xiàn)出體外抗病毒作用，并且能夠顯著降低炎癥風(fēng)暴的發(fā)生，同時(shí)還具有抗血栓的作用，此前在臨床中710 名重癥肺炎患者，隨機(jī)對(duì)照顯示血必凈注射液聯(lián)合常規(guī)治療28 天病死率降低8.8%，縮短4 天的ICU 住院時(shí)間；同時(shí)32 家醫(yī)院參與的156 例重型、危重型新冠肺炎患者的研究顯示，在基礎(chǔ)治療加上血必凈注射液后效率較高[5,48]。在血必凈注射劑治療新冠肺炎的證據(jù)基礎(chǔ)和研究前瞻，共有10篇血必凈注射劑治療膿毒癥的隨機(jī)臨床對(duì)照的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，最新1 篇Meta 分析評(píng)價(jià)血必凈注射劑聯(lián)合常規(guī)治療膿毒癥的安全性與有效性，評(píng)論表明在1144名膿毒癥患者中，聯(lián)合血必凈注射劑可降低體溫、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、急性生理與慢性健康評(píng)分（APACHE Ⅱ）和28 天病死率[49]。在東南大學(xué)附屬醫(yī)院牽頭展開(kāi)血必凈注射劑治療膿毒癥療效的多中心盲法隨機(jī)對(duì)照臨床研究中的1810名膿血癥，與常規(guī)治療相比聯(lián)合血必凈注射劑可降低患者28 天病死率（P-value＜ 0.001）[50]。同時(shí)93 家二甲以上醫(yī)院開(kāi)展血必凈注射劑臨床安全性檢測(cè)，31913 名使用血必凈注射劑的患者的不良反應(yīng)率為0.30%（96 例），屬于偶然級(jí)別均為已記載不良反應(yīng)[51]。針對(duì)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院隔離病房的44例新冠感染患者，對(duì)照組為常規(guī)治療，觀察組為血必凈注射劑聯(lián)合常規(guī)治療，結(jié)果顯示血必凈注射劑治療普通型新冠感染肺炎可提高療效并且促進(jìn)肺部感染病灶吸收，同時(shí)安全性良好（不良反應(yīng)均為個(gè)例），但對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰率以及炎癥指標(biāo)改善不明顯[52]。另外血必凈注射劑臨床不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)損害、過(guò)敏性休克全身性損害和心血管系統(tǒng)損害。

從中醫(yī)藥角度分析新冠病毒感染，其病理特點(diǎn)是重濁黏膩、病程纏綿和病情多變，核心病因是濕毒郁閉，主要病位是肺和脾，其屬于寒濕疫的范疇，同時(shí)出現(xiàn)不同臟腑的損害，臨床上新冠感染與心、肝、腎和大腸器官存在關(guān)聯(lián)性，這與病毒通過(guò)ACE2 受體攻擊人體的心臟、食道、腎、膀胱和回腸等器官相吻合，同時(shí)符合新冠肺炎尸檢報(bào)告?！叭幦健敝委熜鹿诓《倔w現(xiàn)中醫(yī)分期及辨證治療觀點(diǎn)，從中醫(yī)角度上講初期寒濕侵犯肺衛(wèi)、中期疫毒內(nèi)陷蘊(yùn)肺、重癥期毒擾營(yíng)血，內(nèi)閉外脫以及恢復(fù)期邪去正虛，同時(shí)以治療觀點(diǎn)在不同時(shí)期的體現(xiàn)也不相同，初期以宣肺透表和健脾化濕為主、中期以以清熱解毒，化痰平喘為主，佐以通腑泄?jié)嶂贰⒅匕Y期以清營(yíng)解毒，涼血開(kāi)竅，化痰平喘為主，佐以益氣回陽(yáng)救急之品以及恢復(fù)期以扶正祛邪為主。而“三藥三方”中復(fù)方3、復(fù)方4 和復(fù)方5 用于輕癥初期，其以宣肺透表和健脾化濕為主，復(fù)方6 適用于重癥，其以清營(yíng)解毒，涼血開(kāi)竅，化痰平喘為主，佐以益氣回陽(yáng)救急之品，同時(shí)復(fù)方1 和復(fù)方2 為通用方，其治療需因人和時(shí)期而異，一般用于新冠肺炎輕癥、普通型和重癥患者，同時(shí)在危重患者可結(jié)合患者的實(shí)際情況使用，其總體表現(xiàn)祛濕的中醫(yī)核心治療觀點(diǎn)。

復(fù)方1 到復(fù)方5 均以肺經(jīng)為主，同時(shí)出現(xiàn)脾經(jīng)和肝經(jīng)，這符合中醫(yī)角度下新冠病情的病位點(diǎn)，合理地針對(duì)病因以及病機(jī)，而對(duì)于復(fù)方6不同與其他復(fù)方，其主要功能是緩減炎癥因子風(fēng)暴，主要適用于熱、毒、瘀內(nèi)蘊(yùn)的辨證，其歸經(jīng)則以肝經(jīng)和心經(jīng)為主，以脾經(jīng)為輔，重癥病人伴隨著高熱、喘憋、膿毒血癥、器官衰竭等邪氣入心、肝，故歸經(jīng)以肝經(jīng)和心經(jīng)為主。同樣地，復(fù)方1、復(fù)方2和復(fù)方6以溫性藥為主，而復(fù)方3、復(fù)方4和復(fù)方5則以寒性藥為主，以苦寒去內(nèi)熱，而新冠肺炎主要屬于“濕毒化熱”，并不是濕熱入侵而化熱，應(yīng)該在臨床上注重“濕”的變化，并不是過(guò)早和過(guò)多的清熱，這也反映復(fù)方不僅以寒性藥去熱，并且有以溫性藥為主的復(fù)方注重“濕”的變化，實(shí)現(xiàn)辨證論治的治療原則。而從藥味角度上講，復(fù)方均以苦味、辛味、甘味藥為主，以苦寒去內(nèi)熱，其發(fā)揮解毒化濕和輕熱平喘的功效。

“三藥三方”多重點(diǎn)作用于脾經(jīng)和肺經(jīng)，初期和中期復(fù)方重點(diǎn)作用于肺經(jīng)和胃經(jīng)，重癥期復(fù)方重點(diǎn)作用于肝經(jīng)和心經(jīng)，這符合解毒化濕、輕熱平喘的核心治療觀點(diǎn)。新型冠狀肺炎病位在肺，但隨著病情發(fā)展逐漸至脾、胃，從運(yùn)化水谷精微角度講，《內(nèi)經(jīng)》有言“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱。”水谷精微的正常功能在于脾的運(yùn)化和肺的行水相關(guān)，“三藥三方”整體重點(diǎn)作用于脾經(jīng)和肺經(jīng)在于維持水谷精微的正常功能，阻止病情的惡化，同時(shí)體現(xiàn)中醫(yī)“脾為后天之本”、“肺為相傅之宮，治節(jié)出焉。統(tǒng)輯之氣，無(wú)經(jīng)不達(dá)，無(wú)臟不轉(zhuǎn)，是乃肺之充，而肺乃氣之主也”防治思想。初期燥邪傷陰、表濕郁肺，中期疫毒陷肺、肺燥脾濕，故初期和中期以宣肺透表和健脾化濕為主，宣肺氣、通腑泄熱、啟脾胃，同時(shí)由于脾和胃相表里，初期和中期復(fù)方重點(diǎn)作用于肺經(jīng)和胃經(jīng)。重癥危重期內(nèi)閉外脫、疫毒蘊(yùn)肺，出現(xiàn)高燒、神志不清等邪氣入心，出現(xiàn)一系列典型的少陽(yáng)證表現(xiàn)，邪犯少陽(yáng)肝膽，樞機(jī)不利，經(jīng)氣不暢，故重癥危重期需回陽(yáng)救逆、啟閉固脫，即重癥期復(fù)方重點(diǎn)作用于肝經(jīng)和心經(jīng)。

在中醫(yī)治病求因、辨證論治、已病防變和正氣存內(nèi)的原則下，6種復(fù)方的性、味、歸經(jīng)均符合解毒化濕、輕熱平喘的核心治療觀點(diǎn)，在改善病癥的同時(shí)，縮短患者的退熱時(shí)間和痊愈時(shí)間，降低輕癥轉(zhuǎn)重比例，同時(shí)提高中性粒細(xì)胞等生理指標(biāo)，并且促進(jìn)康復(fù)減少后遺癥，去除余邪氣和扶助正氣，改善癥狀和提高免疫能力。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接對(duì)“三藥三方”的化學(xué)成分、核心靶點(diǎn)和性味歸經(jīng)進(jìn)行系統(tǒng)性、整體性分析，從多成分-多靶點(diǎn)-多通路的協(xié)同作用角度初步闡述復(fù)方的藥理機(jī)制，分析各自復(fù)方藥理作用的異同，從分子水平角度初步解釋“三藥三方”的藥理特證，從中醫(yī)辨證治療以及分期治療的觀點(diǎn)分析“三藥三方”的藥理作用特點(diǎn)的異同，解釋中醫(yī)藥在治療新冠的辨證治療、分期觀點(diǎn)，同時(shí)利用現(xiàn)代藥理分析方法，探究“三藥三方”治療新冠肺炎的分期治療和辨證治療中醫(yī)理念，其為COVID-19 的中醫(yī)藥治療提供了科學(xué)理論依據(jù)。同時(shí)介于對(duì)SARS-CoV-2 認(rèn)識(shí)的局限性，其感染機(jī)制和治療機(jī)制尚存不足，以及需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論分析觀點(diǎn)，同時(shí)對(duì)于復(fù)方調(diào)控功能中的主次關(guān)系也存在認(rèn)識(shí)性的不足。