張寶寶，余天飛，艾加敏，王 華，柳曉東，姜影影，鄧振山

(延安大學 生命科學學院，陜西 延安 716000)

石油是一種粘稠狀、深褐色的液體[1]，其成分復雜，主要成分為烴類、非烴類化合物以及少量的有機金屬化合物[2]。石油在開采加工的眾多環(huán)節(jié)中，難免會泄露到土壤中，影響植物生長及微生物群落結構，對生態(tài)環(huán)境造成嚴重破壞。石油具有高粘度、高黏著力的特性，并且具有疏水性，因此會與土壤粘連在一起，阻塞土?？椎?，影響土壤的透水、透氣能力，并且石油還會侵蝕土壤，導致土層物理性質(zhì)改變，使土壤鹽堿化、板結概率增大[3]。對石油污染土壤中生長的植物研究發(fā)現(xiàn)，石油會附著在植物根系表面，形成黏膜，降低植物的根系呼吸、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和養(yǎng)分吸收，當石油濃度較大時，會造成植物根系腐爛，嚴重的還會導致植物死亡[4]。石油污染會引起土壤中的有機碳含量明顯增加，影響土壤中的微生物生長和繁殖，導致微生物群落結構失調(diào)，對土壤中的微環(huán)境產(chǎn)生一定的破壞[5]。

目前處理石油污染的方法主要有物理、化學、生物修復法。物理法因其成本較高、處理不徹底等問題，目前未能普及應用；化學法往往會造成二次污染，修復效果不理想[6]。生物法是近些年興起修復方法，主要有協(xié)同修復法、微生物降解法，其修復效果明顯，對環(huán)境干擾較小，已成為處理石油污染主要修復的方法。

細菌、真菌、放線菌和藻類等各種類群中都發(fā)現(xiàn)具有石油降解能力的生物[7]。目前國內(nèi)外研究報道能夠降解石油微生物主要有：假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)放線菌屬(Actinomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、鐮刀菌屬(Fusarium)和小球藻(Chlorellavulgaris)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無色桿菌屬(Achromatobacteria)[8]。

微生物降解石油主要在水-油界面進行，表面活性劑可以將石油乳化為更小的顆粒，從而可以擴大石油與微生物的接觸面積，提高石油降解效率[9]。生物表面活性劑是一種微生物在生長過程中產(chǎn)生的一種雙親性化合物，具有降低油脂表面張力、乳化油脂，增強微生物表面的疏水性等作用[10]，通過卷曲、增溶和洗脫三大作用，能夠擴大石油與土壤微生物的接觸面積，提高菌株對石油的降解效率，并且生物表面活性劑可降解、綠色環(huán)保[11]。因此篩選出既能產(chǎn)生表面活性劑又能降解石油的微生物，是當前微生物修復法關注的熱點[12]。

陜北地區(qū)位于黃土高原中心區(qū)域，生態(tài)環(huán)境十分脆弱，同時陜北地區(qū)也是國家重要能源化工基地，石油資源豐富，但同時石油污染嚴重，因此處理陜北地區(qū)石油污染需要采取一種高效、綠色環(huán)保的修復手段?；诖?，本研究對3株石油降解菌進行鑒定，研究其降解特性，進一步豐富石油降解菌菌種資源，為微生物修復石油污染應用于實際生產(chǎn)提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原油、菌株及試劑

實驗所用原油采自陜西寶塔區(qū)青化砭鎮(zhèn)(36°78′45″，109°57′63″，暖溫帶大陸季風性氣候)。

試驗菌株由延安大學生命科學學院提供，由微生物實驗室-80℃冷凍甘油管保存，試驗菌株為3株，分別編號為HZ-01、HZ-02、HZ-03。

C2Cl4購自南京化學股份有限公司，Na2SO4、NaOH、NaCl均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

(1)PYG培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏0.2 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.5，121℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基需另加入15.0 g-20.0 g瓊脂。

(2)無機鹽培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，NH4Cl 0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.02 g，KCl 0.1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

(3)石油培養(yǎng)基：在無機培養(yǎng)基中加入1%(v/w)的原油，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

AL204電子天平(梅特勒·托利多儀器有限公司)、T-960PCR儀(力康生物科技有限公司)、島津UV-1780紫外可見分光光度計(東莞瑞高電子科技有限公司)、Oil-480紅外分光測油儀(北京華夏科創(chuàng)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

將-80℃甘油管冷凍保藏的菌株，接種到PYG固體養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落，接種到PYG培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，重復以上步驟3次，可得到純菌落，將得到純菌株，4℃保藏試管斜面中，作為種子菌種，供后續(xù)試驗使用。

1.2.2 菌懸液制備

將種子菌種接種到PYG液體培養(yǎng)基中，160 r/min，30℃培養(yǎng)48 h，吸取OD600 1.5的發(fā)酵液10 mL，然后將發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min，離心5 min，重復3次，用生理鹽水反復沖洗3次，收集菌體，再用無菌水混合，吹打至懸浮液，可制得所需菌劑。

1.2.3 菌株的鑒定

(1)16S rDNA分子生物學鑒定

采用菌落PCR對3株菌進行16S rDNA分子生物學鑒定，將3株菌分別接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落置于規(guī)格為1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH，1%SDS)，PCR儀95℃反應5 min，當溫度達到16℃時取出，加入無菌水至100 μL，顛倒混勻，吹打成懸浮液，擴增菌株16S rDNA序列時，吸取2 μL為模板；擴增16S rDNA序列引物為：

P15′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′

P65′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTGTTACGACTTCACCC-3′

PCR反應體系(2×EsMasterMix(Dye)25 μL，P12 μL，P62 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL)和反應條件(預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火54 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；終延伸72 ℃，3 min；循環(huán)數(shù)：30)均參照康為世紀公司所生產(chǎn)的2×EsMasterMix(Dye)所提供的體系和條件擴增，部分條件稍有改動。

PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，90 V水平電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照檢查擴增結果。擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序，測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，用軟件MEGA-X構建發(fā)育進化樹，測序數(shù)據(jù)上傳至GeneBank，申請菌株序列登錄號。

(2)菌株的生理生化實驗

參考文獻方法[13]對3株菌株進行生理生化試驗，選取革蘭氏染色、接觸酶、明膠液化、甲基紅試驗、V.P試驗等。

1.2.4 菌株的生長曲線繪制

將菌劑接種到PYG液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取4 mL菌懸液，用紫外分光光度計測定在波長為600 nm處吸光度，一直持續(xù)至50 h，每次重復3次，以生長時間為橫坐標，以平均吸收值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.2.5 菌株產(chǎn)表面活性劑檢測

柴油-蘇丹Ⅲ混合液制備：用電子天平準確秤取蘇丹Ⅲ0.05 g，并溶于100 mL柴油中，濾紙過濾，除去雜質(zhì)，并于121℃滅菌25 min，供后期使用。將菌懸液分別接種到PYG液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，使用菌離心管分裝，10000 r/min離心5 min，去除沉淀，保存上清液，重復離心3次。取9 cm滅菌培養(yǎng)皿，加入15 mL去離子水，滴入200 μL柴油-蘇丹Ⅲ混合液，使其形成油膜，覆蓋在去離子水表面，待油膜穩(wěn)定后，用微量移液器吸取2 μL發(fā)酵上清液滴入油膜中心，測量排油圈直徑，以未接種培養(yǎng)基為空白對照[14]。

1.2.6 菌株抗逆性試驗

(1)菌株pH試驗

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的pH值，起始pH值分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，鹽度為2.0%，分裝至250 mL三角瓶，每個瓶中加入1 mL菌劑，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，以未接菌劑液體PYG液體培養(yǎng)基為空白對照，然后使用紫外可見分光光度計測定吸收值，每個梯度重復3次。

(2)菌株鹽度試驗

用NaCl調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的鹽度，起始鹽度分別為：0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%，pH為7.0，分裝至250 mL三角瓶中，每個瓶中加入1 mL菌劑，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，以未接菌劑PYG液體培養(yǎng)基為空白對照，然后使用紫外可見分光光度計測定吸收值，每個梯度重復3次。

1.2.7 石油降解率的測定

在石油培養(yǎng)基中分別加入OD600=1.0的菌懸液，30℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，隔5 d測量1次石油濃度，每個樣品重復3次，以未加菌劑為空白對照。采用Oil-480型測油儀測量石油降解率，每個樣品用10 mL C2Cl4萃取3次，合并萃取液，將萃取液用烘干48 h Na2SO4吸收多余水分，然后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用C2Cl4定容至50 mL，測定其濃度。

1.2.8 室內(nèi)模擬修復

從延安大學文匯山采0.5 m處泥土，過100目篩子，分裝到20 cm×40 cm的塑料盒中，每個塑料盒中分別裝2.0 kg泥土，稱取20.0 g原油用100 mL石油醚溶解稀釋，將稀釋液與泥土充分攪拌，使其混勻，通風櫥內(nèi)風干，使石油醚完全揮發(fā)，模擬石油污染的土壤。每個樣品中加入發(fā)酵液，每隔5 d測1次石油濃度，每次測量每個樣品取5樣點，每個樣點取10.0 g土壤，將5個樣點樣品泥土充分混勻，測量樣品中的石油濃度。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

菌株的16S rDNA序列擴增結果在紫外凝膠系統(tǒng)拍照結果(圖1A)所示，結果顯示，3株菌株16S rDNA PCR序列擴增產(chǎn)物的大小均為1500 bp左右，測序結果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，進行BLAST比對，HZ-01與Bacilluscereus(KX242264.1)同源性為99.79%，HZ-02和HZ-03與Bacillushalotolerans(MF988692.1)同源性分別為99.86%和99.72%，使用MEGA軟件中N-J方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1B和C)。

圖1 菌株16S rDNA鑒定結果

菌株生理生化試驗結果(表1)，3株菌株經(jīng)革蘭氏染色，3株菌均為革蘭氏陽性菌，明膠液化、淀粉水解、接觸酶3株菌均為陽性。V.P和M.R試驗HZ-01和HZ-02均為陰性，HZ-03為陽性；3株菌均能利用葡萄糖產(chǎn)酸，其中HZ-03還能利用乳糖。

結合菌株的生理生化特性，初步確定HZ-01屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，HZ-02、HZ-03屬于嗜鹽芽孢桿菌(Bacillushalotolerans)，根據(jù)結果構建3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。將其上傳至GenBank申請序列登錄號，分別為HZ-01：MT328556，HZ-02：MT328557，HZ-03：MT328558。

表1 石油降解菌生理生化指標

2.2 菌株產(chǎn)表面活性劑結果

表面活性劑能夠?qū)⒃腿榛癁樾☆w粒，改變油滴表面張力，可以提高微生物降解石油效率。因此通過測定排油圈的大小，間接反映菌株產(chǎn)表面活性劑的能力，如圖2所示。試驗表明，HZ-01產(chǎn)表面活性劑能力最強，三者排油圈直徑分別為：HZ-01為5.68 cm，HZ-02為4.50 cm，HZ-03為3.12 cm。

圖2 3株菌排油圈

2.3 菌株的生長曲線

通過搖瓶試驗培養(yǎng)繪制了3株石油降解菌的生長曲線(圖3)，在相同培養(yǎng)條件下，HZ-01菌株相對于HZ-02菌株和HZ-03菌株生長較好，并且3株菌株均在4-36 h生長速度較快時，在40 h時達到到達生長穩(wěn)定期。

圖3 石油降解菌生長曲線

2.4 菌株抗逆性測試試驗

2.4.1 菌株的pH試驗結果

高酸堿的環(huán)境可以抑制微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，成為限制微生物的主要環(huán)境因素，合適的pH是菌株正常生長的條件之一。菌株的pH試驗如圖4所示，結果表明，HZ-01最適生長pH為8.0，HZ-02和HZ-03最適生長pH為7.0。3株菌的耐受范圍均為pH 4.0-pH 10.0，耐受范圍廣，可以適應陜北地區(qū)大部分地區(qū)。

圖4 菌株的pH試驗結果

2.4.2 菌株的鹽度試驗

圖5 菌株的鹽度試驗結果

合適的鹽度是菌株正常生長的條件之一，3株菌株耐鹽度試鹽如圖5所示。3株菌株均能對高鹽度有較好的耐受性，HZ-02和HZ-03最適鹽度為2.0%，HZ-02可耐受鹽度為6.0%，HZ-03可耐受鹽度為5.0%，HZ-01可耐受鹽度為3.0%。細菌內(nèi)部是一個半封閉的生理環(huán)境，內(nèi)部環(huán)境需要與外界進行物質(zhì)交換，高鹽度可以導致滲透壓的改變，而滲透壓的改變會直接影響到菌株的生長，甚至會導致菌株的死亡。

2.5 石油降解效率

不同菌株降解石油能力各有差異，3株石油降解菌的降解效率如圖6所示，在石油初始濃度為10000 mg/L的條件下，經(jīng)過30 d的處理，添加HZ-01、HZ-02和HZ-03的原油培養(yǎng)基中石油濃度(c)分別為2782.5 mg/L、5767.0 mg/L和3045.9 mg/L，石油降解率為72.18%、42.33%和69.54%。在修復的0-5 d內(nèi)，微生物處于適應期，降解效效果不明顯；在5-20 d中，微生物適應了培養(yǎng)基環(huán)境，菌體生長旺盛，代謝效率高，石油降解效果明顯，培養(yǎng)基已由清亮變得渾濁，原油大部分被乳化；20 d后，受營養(yǎng)底物含量和次生代謝產(chǎn)物的限制，菌體生長速率減慢，代謝活動受到相應的抑制，石油降解率趨于平緩。

圖6 菌株石油降解效率測定結果

2.6 室內(nèi)模擬修復

室內(nèi)模擬修復結果如圖7所示，在初始石油濃度為10000 mg/kg模擬石油污染土壤，分別添加HZ-01、HZ-02和HZ-03，經(jīng)過30 d的室內(nèi)模擬修復，樣品中的石油濃度分別為3717.8 mg/kg、5047.9 mg/kg和4168.8 mg/kg，石油降解率為62.82%、49.52%和58.31%。與石油培養(yǎng)基測定石油降解率相比，土壤的微環(huán)境復雜，石油降解菌營養(yǎng)物質(zhì)的獲取依賴外源添加，室內(nèi)模擬修復中各菌株的降解石油能力均有所下降。

3 討論與結論

目前，微生物在環(huán)境修復中已有很多應用，在處理石油污染方面有了很多的研究。石油降解菌株的篩選是石油污染微生物修復的基礎與前提，受到人們廣泛關注。本研究中從石油污染的土壤中分離的3株石油降解菌，HZ-01可耐受鹽度為3%，HZ-02和HZ-03可耐受鹽度分別為5%和6%，H-02和HZ-03具有很好的耐鹽性，3株菌pH耐受范圍為pH 4.0-pH 10.0，HZ-01、HZ-02和HZ-03可適應陜北石油開采大多數(shù)區(qū)域。

采用柴油-蘇丹Ⅲ測量排油圈直徑，相比于用石蠟油測量，柴油黏度較小，形成的油膜穩(wěn)定，靈敏度高；HZ-01、HZ-02和HZ-03排油圈直徑分別為5.68 cm、4.50 cm和3.12 cm，石油降解率分別為72.18%、42.33%和69.54%。與李曉娜等[15]從石油污染的土壤中分離出能產(chǎn)表面活性劑的石油降解菌XB(Bacillussp.)，其排油圈直徑為3.6 cm，石油降解率為72.30%相比，HZ-01與XB降解性能基本持平，但在產(chǎn)表面活性劑方面，HZ-01優(yōu)于XB；本研究中采用Oil-480型紅外測油儀直接測出石油濃度，除了直接使用紅外測油儀法，大多數(shù)研究者都采用紫外法、重量法、色譜法等方法，不同的方法在應用時也各有利弊，在選擇時，應根據(jù)自己試驗的目的，選擇出適合自己的方法[15]，使用紅外測油儀，高效、易操作，并且誤差較小[16]。受土壤微環(huán)境和營養(yǎng)底物的影響，與采用石油培養(yǎng)基測定菌株降解效率相比，室內(nèi)模擬修復中的各菌株的石油降解效率均有所下降。

然而，本研究僅對菌株表面活性劑進行初步研究，后期還應對表面活性劑化學組成進行定性和定量分析，以及菌株是否存在一些功能基因。如：單加氧酶、雙加氧酶基因[17]進行鑒定；還需要對菌株進行油藏環(huán)境模擬實驗，以評定其在真實環(huán)境中的降解效果。