王燦燦，林海鷗，劉書宇，唐文偉，曾東強

（廣西大學農(nóng)學院植保系 南寧市 530005）

香附子Cyperus rotundusL.，為莎草科Cypera?ceae 莎草屬Cyperus植物，又名三菱草、莎草、回頭青等，原產(chǎn)于印度，國內(nèi)分布于陜西、甘肅、山西、河南、河北、山東、江蘇、浙江、江西、安徽、云南、貴州、四川、福建、廣東、廣西和臺灣等省區(qū)[1]。

香附子是玉米、甘蔗、蔬菜等農(nóng)作物田的惡性雜草，嚴重危害農(nóng)作物的生長，但其根莖是一種常見的中草藥，在民間常用于治療各種炎癥性疾病，有“婦科圣藥”、“氣中之血藥”之稱。香附子揮發(fā)油現(xiàn)已在我國實現(xiàn)商品化生產(chǎn)，主要采用β-環(huán)糊精對其進行包合，并制成相應的制劑，如膠囊劑等，用于治療各種臨床疾病[2]。前人對香附子化學成分已進行了系統(tǒng)的研究，基本明確其主要的化學成分類型有倍半萜、單萜、三萜、黃酮、糖苷、甾醇、生物堿及其他類化合物。目前，對于香附子根莖化學成分活性的研究主要集中在人體病原細菌及真菌，初步的研究結(jié)果表明，香附子中具有抑制植物病原真菌的活性成分。

本研究擬采用菌絲生長速率法，測定香附子根莖甲醇粗提物及其萃取物對常見植物病原真菌的抑菌活性，以期為進一步提取分離香附子根莖中抑菌活性成分、為尋找新型殺菌劑的先導化合物提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香附子根莖

采自廣西大學扶綏農(nóng)科基地甘蔗田。選取生長狀況良好的香附子根莖。

1.1.2 化學試劑

甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，分析純（天津富宇試劑公司和成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)）。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4 植物病原真菌

火龍果潰瘍病菌Neoscytalidium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearumSchwabe、苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporunf.sp.Momordicae、馬鈴薯立枯絲核菌Rhizoctonia solaniKühn、姜白絹病菌Sclerotium rolf?sii、甘蔗梢腐病菌Fusarium moniliformeSheldon、香蕉煤紋病菌Helminthosporium torulosum（Syd.）Ashby.、 甘 蔗 鳳 梨 病 菌Ceratocystis paradoxaMoreau、 甘 藍 黑 斑 病 菌Alternaria brassicicola（Schw）Wiltshire，以上植物病原真菌均來源于廣西大學農(nóng)學院植物病理研究室，菌種保存于4℃冰箱，試驗前重新接菌活化以備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 香附子根莖提取物制備

1.2.1.1 甲醇粗提物制備

將采集的香附子根莖用清水清洗干凈，在通風良好的地方晾干，放入恒溫鼓風干燥箱于50℃烘干后進行粉碎處理，過100 目篩，得到5 kg 粉末。將粉碎后的樣品置于3 L的錐形瓶中，用甲醇冷浸超聲（2 h/次）提取3 次（樣品：甲醇體積比1∶5）后過濾，將收集得到的濾液于55℃減壓濃縮至近干，得到1 200 g甲醇粗提物浸膏。

1.2.1.2 萃取物制備

將香附子根莖甲醇粗提物浸膏加適量的去離子水懸浮，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并萃取液，濃縮至膏狀，分別得到香附子根莖的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相濃縮物。

1.2.2 香附子根莖提取物抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法測定香附子根莖甲醇粗提物和各萃取物對9種植物病原真菌的抑制作用[9]。分別稱取定量（甲醇粗提物1 g，萃取物0.5 g）的待測提取物，加入一定量的甲醇（甲醇含量不超過2%），充分溶解，加入無菌水配成目標濃度的母液（甲醇粗提物為1 000 mg/mL，萃取物為500 mg/mL），取 1 mL 與 99 mL 的 PDA 培養(yǎng)基融合，充分混勻，倒入直徑7.5 cm 的培養(yǎng)皿中，得到供試含藥培養(yǎng)基，置于超凈工作臺中冷卻，用菌種打孔器從活化好的菌種培養(yǎng)基上打出直徑6 mm的菌餅，將菌餅倒放于培養(yǎng)基的中央，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理重復3次，以含有等量甲醇的處理為對照組。待對照組菌落直徑達到5 cm 以上時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按下述公式計算其抑菌率。

抑菌率（%）=（D1-D2）/(D1-6)×100

式中D1表示對照組菌落直徑，D2表示處理組菌落直徑（單位：cm）。

1.2.3 香附子根莖萃取物對病原真菌菌絲生長的毒力測定

選取各萃取物對供試植物病原真菌菌絲生長抑制率在70%以上的病原真菌采用菌絲生長速率法進行進行毒力測定。將待測萃取物用一定量的甲醇溶解，用無菌水稀釋成濃度為500 mg/mL 的母液，然后用倍半稀釋法制成一系列濃度梯度的母液。在超凈工作臺中，取1 mL 系列濃度梯度的母液與99 mL 已融化的PDA 培養(yǎng)基混合，分別配置成濃度為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 和0.312 5 mg/mL 等一系列的含藥培養(yǎng)基。其他操作步驟同1.2.2。計算香附子根莖各萃取物對病原真菌的EC50。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2019 和SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析。方差分析采用單因素分析（ANOVA）和Duncan’s新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 香附子根莖提取物對病原真菌抑菌活性的測定

香附子根莖甲醇粗提物對9種供試植物病原真菌的抑菌活性結(jié)果（見表1）表明：其對供試植物病原真菌均具有一定程度的菌絲生長抑制活性。在10 mg/mL濃度下對姜白絹病菌的抑制效果最為顯著，抑制率達到了100%；對禾谷鐮刀菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果次之，抑制率分別為81.84%、81.21%；馬鈴薯立枯絲核菌、甘蔗梢腐病菌和香蕉煤紋病菌的抑制作用最差，抑制率在43.79%~46.07%之間。

在5 mg/mL濃度下，石油醚萃取物對9供試植物病原真菌的抑制率均在50.00%以上，其中對禾谷鐮刀菌、姜白絹病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果最為顯著，抑制率在85%以上，對香蕉煤紋病菌的抑制效果最差，抑制率僅有50.00%；乙酸乙酯萃取物對禾谷鐮刀菌、苦瓜枯萎病菌、姜白絹病菌、甘蔗鳳梨病菌和甘藍黑斑病菌的抑制率均達到90%以上，對馬鈴薯立枯絲核菌和甘蔗梢腐病菌的抑制作用最差，抑制率在60%以下，正丁醇萃取物僅對火龍果潰瘍病菌、馬鈴薯立枯絲核菌、甘蔗梢腐病菌等3種病原菌具有抑菌活性，且抑制率僅在50%左右，水萃取物則對供試植物病原真菌均無抑制作用。生物活性測定結(jié)果說明，香附子根莖中具有抑菌活性成分可能主要分布于石油醚和乙酸乙酯萃取物中。

表1 香附子根莖提取物對9種植物病原真菌菌絲生長抑制活性

2.2 香附子根莖萃取物對植物病原菌菌絲生長的毒力

2.2.1 石油醚萃取物對植物病原真菌絲生長的毒力

香附子根莖石油醚萃取物對供試植物病原真菌菌絲生長的毒力測定，抑制效果見表2 和圖1。結(jié)果表明，石油醚萃取物對所測定5種菌的EC50均較低，其中火龍果潰瘍病菌和姜白絹病菌的抑制作用的EC50最低，分別為0.36 mg/mL和0.37 mg/mL，對禾谷鐮刀菌菌絲生長抑制效果次之，EC50分別為0.50 mg/mL；但與對照藥劑的EC50相比，仍有較大的差距。

表2 香附子石油醚萃取物對5種植物病原真菌的EC50值

2.2.2 乙酸乙酯萃取物對植物病原真菌絲生長的毒力測定

香附子根莖乙酸乙酯萃取物對供試病原真菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果表明（表3、圖2），乙酸乙酯萃取物對所測定6種病原真菌中，對火龍果潰瘍病菌、姜白絹病菌和甘蔗鳳梨病菌菌絲生長的EC50較低，分別為 0.42 mg/mL、0.52 mg/mL 和0.35 mg/mL，對甘藍黑斑病菌的抑制效果次之，其EC50為0.9 mg/mL，對禾谷鐮刀菌和苦瓜枯萎病菌菌絲生長的EC50均為1.16 mg/mL；但與對照藥劑的EC50相比，仍存在較大的差距，香附子根莖乙酸乙酯萃取物的EC50在0.35～1.16 mg/mL，而對照藥劑的EC50在0.03～1.90 μg/mL。

圖1 香附子石油醚萃取物在不同濃度下對5種病原真菌菌絲生長的抑制效果

圖2 香附子乙酸乙酯萃取物在不同濃度下對6種病原真菌菌絲生長的抑制效果

表3 香附子乙酸乙酯萃取物對6種植物病原真菌的EC50值

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對供試植物病原真菌的抑制均較好。香附子根莖的活性成分集中分布在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

本研究中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對鐮刀菌屬的3 種病原真菌（F.graminearum、F.oxysporum、F.moniliforme）的抑菌結(jié)果表明，2 種萃取物對禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和苦瓜枯萎病菌（F.oxysporum）抑制效果較好，對甘蔗梢腐病菌（F.moniliforme）的抑制效果次之，其中對禾谷鐮刀菌的抑制率均在80%以上，對苦瓜枯萎病菌的抑制率均在69%以上。Zahide ?zdemir等人的研究表明，香附子根莖乙酸乙酯提取物對Botrytis cinerea和Fusarium udum菌絲生長和孢子萌發(fā)有抑制作用[3-4]。且香附子根莖石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對鏈格孢菌屬的甘藍黑斑病菌的抑制率分別為為78.28%和100%。Singh A 等人的研究表明香附子根莖乙酸乙酯提取物對鏈格孢菌屬 （A.alternata、A.brassisicola、A.solani、A.chearanthi和A.brassisicola）的抑制效果較好[5]。同時，本研究結(jié)果顯示，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對姜白絹病菌（S.rolfsii）、火龍果潰瘍菌（N.dimidiatum）和甘蔗鳳梨病菌（N.dimidiatum）均有較好的抑制效果，其抑制率均在75%以上。

目前香附子中已鑒定結(jié)構(gòu)的有1,8-cineole、amentoflavone、 ginkgetin、 bilobetin 和 sciadopitysin、physcion 等多種類型的化合物[6-9]，通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，已在其他植物中分離并有相關(guān)活性的研究。研究表明，藍桉中的單萜類化合物1,8-cineole 對真菌黃曲霉Aspergillus flavusLink和寄生曲霉Aspergillus parasiticusSpeare 的均抑制作用[10]。紅豆杉和銀杏中分離的雙黃酮類化合物amentoflavone、ginkgetin、bilobetin 和 sciadopitysin 對交替交鏈格孢Alternaria alternata、鐮刀菌Fusarium culmorum、尖孢枝孢菌Cladosporium oxysporum均有一定的抑制作用；sciadopitysin 對鐮刀菌的抑制效果較好，其 ED50為 9 μM；bilobetin 對 3 種供試植物病原真菌有顯著的抗真菌活性，其ED50分別為14、11 和17μM，在100 μM 濃度下完全抑制了尖孢霉和鐮刀菌萌發(fā)管的生長[11]。此外，人工合成的蒽醌類化合物physcion 可顯著降低了番茄灰霉病的發(fā)病率，以9 g a.i./ha 的劑量施用physicon，可使發(fā)病率降低63.44%～69.79%，與殺菌劑乙胺嘧啶酯的抑制效果相當[12]。本研究結(jié)果顯示，香附子根莖石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物對多種植物病原真菌有很好的抑菌效果，值得進一步的研究。