寧佳羽，包偉晶，周素娟，魏日富，朱忠壽

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是咽上皮細(xì)胞癌，好發(fā)于中國(guó)南部地區(qū)且有家族聚集傾向，提示遺傳易感性在鼻咽癌的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[1]。癌癥的發(fā)生發(fā)展隨著時(shí)間推移會(huì)發(fā)生累積表觀遺傳的變化，主要表現(xiàn)為癌基因的激活和（或）抑癌基因的抑制。調(diào)控性非編碼RNA（ncRNAs）按其功能可分為兩類：管家ncRNAs和監(jiān)管ncRNAs，其中大于200個(gè)核苷酸的稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（LncRNAs）[2]。研究表明LncRNA靶點(diǎn)與多種癌癥的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，如LncRNA MEG3可作為多種miRNAs的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）而發(fā)揮作用，通過下調(diào)MEG3的表達(dá)導(dǎo)致miRNAs的變化，從而影響目標(biāo)mRNAs的表達(dá)水平[3-4]。MEG3位于人類染色體14q32.3上，研究顯示MEG3可通過調(diào)節(jié)抑癌基因、抑制血管生成及控制miRNA而發(fā)揮抑癌作用[5]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)MEG3序列中有與miR-543互補(bǔ)的miRNA應(yīng)答元件（MRE），而miR-543與癌癥發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切已得到證實(shí)，其中Krüppel樣因子4（KLF4）作為miR-543的靶基因在其中發(fā)揮重要作用[6-7]。

近年來(lái)也不乏關(guān)于MEG3、miR-543在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中所起作用的研究[8-9]，但具體機(jī)制的闡述仍不夠清晰，本研究擬通過檢測(cè)MEG3與miR-543在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析MEG3、miR-543和KLF4與鼻咽癌的關(guān)系，以揭示他們?cè)诒茄拾┌l(fā)生發(fā)展過程中的具體作用，旨在為未來(lái)鼻咽癌的治療中將MEG3作為一個(gè)可能靶點(diǎn)提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

鼻咽癌細(xì)胞株（CNE-2、C666-1和TW03）和人正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

采用NucleoZOL（德國(guó)Machery Nagel GmbH公司）從細(xì)胞中分離總RNA、評(píng)估其完整性，ABI7500系統(tǒng)行qRT-PCR檢測(cè)MEG3、miR-543和KLF4的表達(dá)情況。引物序列如下：MEG3-F:5'-GGGAAGGGACCTCGAATGTG-3',MEG3-R:5'-CTGTCCCGTGGGAATAGGTG-3'；miR-543-F:5'-CGAAACATTCGCGGTGCA-3'；miR-543-R:5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'和miR-543-RT:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGACAAGAAG-3'。以GAPDH和U6為內(nèi)參對(duì)照，特異性引物如下：GAPDH-F:5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3',GAPDH-R:5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'；U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6-R:5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'和RT引物5'-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

si-MEG3、pcDNA-MEG3、miR-543模擬物、miR-543抑制劑、si-KLF4和pcDNA-KLF4購(gòu)自中國(guó)上?；蛑扑幑?。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞參照Lipofectamine2000試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并分成空白對(duì)照組（NC）、陰性轉(zhuǎn)染組和實(shí)驗(yàn)組。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞接種到96 孔板中，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96 h加入10%CCK8溶液（CK04Dojindo）100 μl，37℃孵育2 h，微板儀測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞培養(yǎng)過夜、80%～90%融合時(shí)轉(zhuǎn)染，在5%CO2環(huán)境中用胰蛋白酶消化、離心后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌，再與結(jié)合緩沖液混合后，在Annexin V-FITC和PI染色液室溫黑暗條件下孵育15 min。

1.6 雙熒光素酶測(cè)定法

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)miR-543靶基因。將MEG3-WT（5‘-GAGUAAUGGUAGUGAA UGUU-3’）和MEG3-MUT（5‘-GAGUAAUGGUAGUCAGAUCAU-3’）可能的結(jié)合序列克隆至pcDNA3.1載體上，與miR-543模擬或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞，36 h后雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega公司，美國(guó)）分析螢火蟲和雷尼拉信號(hào)。熒光素酶活性用微量平板閱讀器定量。

1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

用RIPA緩沖液分離總蛋白、10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質(zhì)定量分析采用Bradford法，用皮爾斯ECL試劑盒顯示PVDF膜上的靶蛋白條帶?？贵w稀釋如下：抗KLF（1:1000）、抗Bcl-2（1:1000）和抗bax（1:1000）；以抗β-肌動(dòng)蛋白（1:1000）作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，并用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析（ANOVA）確定各組數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人鼻咽癌細(xì)胞系中MEG3與miR-543的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69相比，CNE-2、C666-1和TW03中MEG3表達(dá)水平降低，miR-543表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.137,P＜0.001），見圖1。

2.2 鼻咽癌細(xì)胞中MEG3直接吸附轉(zhuǎn)染miR-543

圖1 qRT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞與正常鼻咽上皮細(xì)胞中MEG3(A)和miR-543(B)的表達(dá)Figure 1 Expression of MEG3(A) and miR-543(B) in NPC cells and normal nasopharyngeal epithelial cells determined by qRT-PCR

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示MEG3以miR-543為靶點(diǎn)，于是構(gòu)建了MEG3野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果表明：與NC組相比，miR-543模擬物明顯降低了MEG3野生型報(bào)告基因組的熒光素酶活性（F=18.824,P=0.001），而對(duì)MEG3突變型報(bào)告基因組中的熒光素酶活性沒有可檢測(cè)到的影響（F=1.337,P=0.310），見圖2，提示鼻咽癌細(xì)胞中MEG3以miR-543為調(diào)控靶點(diǎn)，且二者間存在負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系。

2.3 MEG3吸附轉(zhuǎn)染miR-543可提高KLF4的表達(dá)水平

圖2 MEG3野生型和突變型為載體在miR-543模擬物結(jié)合位點(diǎn)上共轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告分析Figure 2 Dual luciferase reporter analysis of MEG3 wild-and mutant-types as vectors co-transfected with nasopharyngeal carcinoma cells at miR-543 mimetic binding site

結(jié)果顯示，MEG3過表達(dá)可顯著降低miR-543的表達(dá)水平，而pcDNA-MEG3與miR-543的共轉(zhuǎn)染模擬質(zhì)粒可逆轉(zhuǎn)pcDNA-MEG3對(duì)miR-543表達(dá)的抑制作用，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4333.00,P＜0.001），見圖3A；MEG3過表達(dá)顯著促進(jìn)KLF4的表達(dá)，而與pcDNA-MEG3共轉(zhuǎn)染的miR-543模擬質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)pcDNA-MEG3對(duì)KLF4表達(dá)的促進(jìn)作用，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3739.947,P＜0.001），見圖3B；下調(diào)MEG3可顯著降低KLF4表達(dá)水平，而將miR-543抑制劑與si-MEG3共轉(zhuǎn)染可緩解si-MEG3對(duì)KLF4表達(dá)的抑制作用，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13056.846,P＜0.001），見圖3C。

2.4 MEG3通過調(diào)控KLF4的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖與凋亡

圖3 MEG3吸附轉(zhuǎn)染miR-543可提高KLF4的表達(dá)水平Figure 3 MEG3 could regulate KLF4 expression by absorptively transfecting miR-543

研究結(jié)果顯示si-MEG3促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、pcDNA-MEG3抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，但pcDNAKLF4共轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)si-MEG3對(duì)C666-1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，而與si-KLF4共轉(zhuǎn)染可解除pcDNAMEG3對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.886,P=0.007;F=5.778,P=0.024），見圖4A；si-MEG3抑制細(xì)胞凋亡，而si-MEG3和pcDNA-KLF4共轉(zhuǎn)染減輕了其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，與此同時(shí)pcDNA-MEG3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而pcDNA-MEG3和si-KLF4共轉(zhuǎn)染抑制了其對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=545.042,P＜0.01;F=1114.926,P＜0.001），見圖4B。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MEG3敲除后Bcl-2的表達(dá)增高、Bax的表達(dá)降低，而提高KLF4的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2191.592,P＜0.001;F=9548.143,P＜0.001），見圖4C；反之，MEG3過表達(dá)降低Bcl-2的表達(dá)、升高Bax的表達(dá)，但KLF4的表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，與NC組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.781,P＜0.05;F=15183,P＜0.001），見圖4D。

因此，MEG3可通過調(diào)控KLF4蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞C666-1的增殖與凋亡。

3 討論

鼻咽癌是發(fā)生在鼻咽部的上皮源性惡性腫瘤，在我國(guó)南部及東南亞地區(qū)高發(fā)，其病理類型多為低分化鱗癌（98%），惡性程度高，轉(zhuǎn)移早，晚期鼻咽癌即便經(jīng)積極治療但總體預(yù)后仍較差[10]。因此，尋求新的療法以改善鼻咽癌患者總體治療效果顯得尤為必要。

圖4 MEG3可通過影響KLF4的表達(dá)來(lái)調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖與凋亡Figure 4 MEG3 could regulate proliferation and apoptosis of NPC cells by affecting KLF4 expression

LncRNAs已被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明LncRNAs在細(xì)胞癌變過程中可作為癌基因或抑癌因子而存在[11]。而MEG3作為L(zhǎng)ncRNAs中的重要成員之一在多數(shù)正常組織中表達(dá)，但在許多惡性腫瘤中顯示表達(dá)下調(diào)甚至缺失，如在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、總體預(yù)后關(guān)系密切[12]；在乳腺癌動(dòng)物移植瘤模型中也觀察到MEG3可抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及瘤內(nèi)血管的生成[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌中MEG3的表達(dá)明顯下降，且下降程度與腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[14]。但MEG3在鼻咽癌中的作用及相關(guān)機(jī)制目前仍不清楚，故本研究旨在通過探討鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子生物基礎(chǔ)，尋找到可靠的新型生物標(biāo)志物，最終為臨床開展鼻咽癌分子靶向治療提供有益的思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)一些LncRNAs可通過與miRNAs直接結(jié)合來(lái)抑制其表達(dá)而充當(dāng)ceRNAs（即“miRNA海綿”）的作用[15]；而既往研究顯示在不同癌細(xì)胞中miR-543的作用存在差異，且KLF4作為miR-543的靶基因可通過參與細(xì)胞增殖并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作為腫瘤抑制因子及預(yù)后指標(biāo)而發(fā)揮作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)MEG3在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，并觀察到MEG3對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的多效性調(diào)節(jié)：MEG3過表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可通過靶向調(diào)節(jié)miR-543并作為KLF4的ceRNA而發(fā)揮腫瘤抑制作用。此外，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了KLF4為鼻咽癌細(xì)胞miR-543的靶基因，miR-543可通過下調(diào)KLF4表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以進(jìn)一步達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)KLF4在鼻咽癌細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑癌作用，提示KLF4可能是鼻咽癌預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)MEG3表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與miR-543的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而miR-543又可通過下調(diào)KLF4的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑癌作用，揭示了MEG3在鼻咽癌細(xì)胞可通過MEG3-miR-543-KLF4軸的反饋調(diào)節(jié)達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的，提示MEG3可能會(huì)成為鼻咽癌靶向治療的一種新型生物標(biāo)志物。但本研究?jī)H處于鼻咽癌的細(xì)胞層面上，MEG3-miR-543-KLF4反饋系統(tǒng)在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的確切機(jī)制及可能的臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。