嚴(yán)唯 林時(shí)輝 幸宇 徐昉

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，重慶 400016)

曲霉菌屬腐生真菌[1]，現(xiàn)已經(jīng)成為免疫功能低下患者致病性感染重要病原菌。全球因血液系統(tǒng)疾病、遺傳免疫缺陷或?qū)嶓w器官移植等相關(guān)免疫抑制所致的侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)已超過200 000例/年[1-2]。曲霉菌感染可以引起IA、過敏性哮喘(allergic asthma)、過敏性支氣管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)以及支氣管哮喘或囊性纖維化的并發(fā)癥等[3]。煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是IA最常見病原體，侵襲性煙曲霉病是造成重癥免疫受損患者死亡主要原因之一。煙曲霉可以通過過敏反應(yīng)、非侵入性定植到威脅生命的侵入性感染起的肺組織破壞。盡管近年來通過更好的診斷和治療方法IA患者的預(yù)后得到改善，但其發(fā)病率和死亡率仍然很高，尤其是在免疫缺陷的患者中[4]。煙曲霉經(jīng)吸入進(jìn)入宿主體內(nèi)后，其通過諸如干擾宿主免疫反應(yīng)、控制或逃避等復(fù)雜免疫逃逸機(jī)制，最終穿透組織屏障以實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)傳播。此時(shí)，宿主體內(nèi)保護(hù)性免疫與致病微生物免疫逃避間存在一種微妙的平衡。而這一平衡的傾斜方向取決于宿主對(duì)抗微生物、病原體對(duì)抗/抑制或逃避宿主免疫防御兩方面的能力。現(xiàn)總結(jié)近年來煙曲霉在肺部感染中的免疫逃逸和組織侵襲的相關(guān)研究，并探討其作用機(jī)制。

1 煙曲霉侵襲性感染的致病基礎(chǔ)

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的344種曲霉屬中有近20種對(duì)人類具致病作用[5]，煙曲霉是重要致病病原體[6]。煙曲霉菌落呈暗煙綠色絨狀或絮狀，廣泛分布于土壤、空氣等有機(jī)環(huán)境。煙曲霉致病性包括煙曲霉細(xì)胞壁成分和色素生成、參與免疫逃逸、營(yíng)養(yǎng)吸收的組分、通過改變代謝增加毒力信號(hào)分子的各類水解酶等，并借此可參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中各種分子及其結(jié)構(gòu)蛋白間的復(fù)雜相互作用[7]。煙曲霉細(xì)胞壁的主要由β-葡聚糖、幾丁質(zhì)、半乳糖胺半乳聚糖 (galactosaminogalactan，GAG)和α-葡聚糖組成[8]，與真菌發(fā)病機(jī)制和毒力密切相關(guān)[9]，也是重要的病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。分生孢子是煙曲霉通過空氣傳播的主要形態(tài)[10]，平均大小為2～3 μm，室內(nèi)外環(huán)境濃度范圍為1～102/m3，可高達(dá)108/m3[11]，較黃曲霉、黑曲霉等更能深層侵入肺泡。分生孢子細(xì)胞壁外層是由黑色素所構(gòu)成，可為煙曲霉提供抗紫外線輻射的保護(hù)，以維持細(xì)胞和孢子基因組穩(wěn)定性[12]。分生孢子可通過被宿主吸入下呼吸道、侵入呼吸道上皮細(xì)胞后的發(fā)育生長(zhǎng)發(fā)育成菌絲、菌絲侵襲血管等過程造成全身性感染[13]。中性粒細(xì)胞或吞噬細(xì)胞減少癥患者[14-15]，難以通過自身免疫反應(yīng)阻止吸入的煙曲霉孢子或菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致肺部煙曲霉感染甚至多系統(tǒng)感染[16]。煙曲霉的致病成分還包括其產(chǎn)生的多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如膠霉毒素(gliotoxin，GT)、煙曲霉素(fumagillin)、煙曲霉酸(helvolic acid)、煙曲霉毒素A(fumitremorgin A)和煙曲霉溶血素[15]等。研究表明，GT由NRPS催化的絲氨酸和苯丙氨酸氨基酸的縮合反應(yīng)產(chǎn)生，煙曲霉96%的毒力作用由其引起[17]，其可通過啟動(dòng)局部或普遍免疫抑制機(jī)制，促進(jìn)真菌生長(zhǎng)并在宿主組織內(nèi)定殖。煙曲霉素是煙曲霉在菌絲發(fā)育期間產(chǎn)生的另一重要毒素，其通過與蛋氨酸氨基肽酶2(MetAP-2)共價(jià)相互作用，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，抑制中性粒細(xì)胞功能和血管生成[18]。此外，煙曲霉還可以產(chǎn)生如過氧化氫酶、堿性蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等多種蛋白酶，促進(jìn)組織黏附和穿透作用，提高侵入宿主能力并抵御機(jī)體免疫反應(yīng)。可見，煙曲霉具有多種毒力結(jié)構(gòu)/成分，參與其在肺部感染中的侵襲。

2 肺部煙曲霉感染與免疫逃逸

病原微生物黏附宿主細(xì)胞同時(shí)也要適應(yīng)肺部環(huán)境壓力，并通過逃避免疫反應(yīng)而持續(xù)存在[19]。煙曲霉可逃避免疫系統(tǒng)識(shí)別，繞過宿主抗真菌防御機(jī)制，以提高自身生存機(jī)會(huì)[20]。其免疫逃逸機(jī)制涉及產(chǎn)生或獲取組織破壞酶、黏附與定植、適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境壓力、逃避補(bǔ)體監(jiān)視以及下調(diào)宿主炎癥反應(yīng)抑制作用等。

2.1 肺煙曲霉感染后的黏附、定植作用

分生孢子細(xì)胞表面覆蓋由RodA疏水蛋白所組成的小棒層，可通過建立剛性框架限制多肽鏈的移動(dòng)性[21]，使其具有疏水性和防水性，利于在空氣中擴(kuò)散。分生孢子進(jìn)入肺部后引起炎癥反應(yīng)使表皮受損，孢子表面層黏連蛋白受體與表皮下基底膜上層黏連蛋白結(jié)合，使煙曲霉更易定植[22]。煙曲霉表面的黏液細(xì)胞外基質(zhì)也有助分生孢子黏附于基質(zhì)[23]。同時(shí)，其細(xì)胞壁成分GAG亦是菌絲有效黏附宿主細(xì)胞表面并保護(hù)真菌細(xì)胞壁免受免疫識(shí)別所必需的重要成分[24]。此外，分泌絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等蛋白水解酶可降解宿主結(jié)構(gòu)屏障，促進(jìn)侵襲能力，增強(qiáng)煙曲霉毒性[25]。

2.2 煙曲霉對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境壓力的適應(yīng)

煙曲霉細(xì)胞壁成分會(huì)因其不同形態(tài)(休眠、膨脹或發(fā)芽)、所處不同外部生存環(huán)境(pH值、低氧等)而發(fā)生改變[26]。煙曲霉在感染進(jìn)程中已逐步形成抵抗溫度、pH值、水平衡、氧化損傷和抗真菌宿主分子等壓力的機(jī)制[27]。煙曲霉能在高達(dá)55℃下生長(zhǎng)，并可承受70℃環(huán)境溫度[28]，耐熱性相關(guān)基因thtA、afpmt1、crgA和ireA在煙曲霉耐熱機(jī)制中發(fā)揮作用。其中，afpmt1轉(zhuǎn)錄甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)48℃下的煙曲霉生長(zhǎng)；crgA可編碼核糖體生物發(fā)生蛋白；ireA則編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、網(wǎng)狀跨膜傳感器蛋白[7]。這些耐熱機(jī)制可作為體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)一部分而被激活，有助其在宿主體內(nèi)生存。研究表明，煙曲霉定植于肺部并持續(xù)生存的環(huán)境中氧氣濃度偏低，煙曲霉不僅可適應(yīng)這一低氧環(huán)境[29]，還可抑制血管生成而導(dǎo)致肺缺氧，進(jìn)一步阻止受損組織新血管形成[30]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)被認(rèn)為是抵抗煙曲霉重要宿主防御反應(yīng)，但煙曲霉侵入過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫酶[31]、超氧化物歧化酶[32]、抗氧化劑硫氧還蛋白[33]、谷胱甘肽[34]及其相關(guān)酶以抵抗ROS作用[35]。而煙曲霉對(duì)pH值變化則并不特別敏感，酸、堿性條件下均可生長(zhǎng)。

2.3 煙曲霉免疫逃逸中的營(yíng)養(yǎng)攝取

營(yíng)養(yǎng)可用性與可吸收性是真菌感染宿主細(xì)胞基本要求[36]。煙曲霉富含大量蛋白酶[37]，可以從蛋白質(zhì)降解中獲取碳，因而其生長(zhǎng)并不需任何特定碳源[38]。肺部主要的蛋白質(zhì)是膠原蛋白和彈性蛋白，蛋白酶可降解肺組織蛋白質(zhì)并提供碳、氮獲取所必需氨基酸[39-40]。煙曲霉含大量蛋白酶和肽酶，以及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，以確保從外源蛋白質(zhì)底物中釋放和吸收氨基酸，煙曲霉可以通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制來確保氮的攝取[41]。煙曲霉AreA型GATA因子可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，來響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平[42]。缺乏GATA因子的煙曲霉毒性也會(huì)比正常曲霉菌株低[43]。鐵是細(xì)胞生物學(xué)過程必需營(yíng)養(yǎng)素，在煙曲霉毒力維持、糖異生、蛋白磷酸酶活性、細(xì)胞壁完整性等中均發(fā)揮作用。而煙曲霉缺乏鐵排泄機(jī)制，因而需要控制鐵吸收、代謝以調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。煙曲霉不能直接利用血紅素、鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等鐵源，鐵載體介導(dǎo)的鐵吸收和高親和力還原鐵同化(reductive iron assimilation,RIA)是目前證實(shí)的兩種自身供鐵機(jī)制[44-45]。而鐵代謝受HapX(抑制鐵消耗途徑)和SreA(抑制鐵載體系統(tǒng))兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[46]。細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白和鐵載體對(duì)于煙曲霉毒力也至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)、外鐵載體不足都會(huì)使毒力部分減低[47]。若完全消除鐵載體生物合成會(huì)則可使小鼠模型侵襲性肺煙曲霉絕對(duì)無毒性[48]。鋅對(duì)真菌生長(zhǎng)也是必不可少的，煙曲霉必須使用鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(zinctransporters，ZNTs)進(jìn)行代謝[49]。更為重要的是，ZafA和ZrfC樣蛋白僅在真菌間分布，是特定真菌靶標(biāo)[50-51]。ZafA基因缺失會(huì)損害煙曲霉生長(zhǎng)和發(fā)芽功能[52]，鋅螯合化合物則會(huì)抑制其生長(zhǎng)[50-51]。此外，ZafA還可上調(diào)煙曲霉zrfC和aspf2表達(dá)，影響鐵攝取和麥角固醇生物合成、氧化應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)及次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等基因的表達(dá)[53]。

2.4 煙曲霉對(duì)宿主補(bǔ)體監(jiān)視的逃避

宿主對(duì)微生物的早期防御之一是補(bǔ)體激活，介導(dǎo)感染性病原體的吞噬。煙曲霉分生孢子定植肺部后會(huì)受到宿主補(bǔ)體系統(tǒng)攻擊。在補(bǔ)體激活時(shí)宿主細(xì)胞也會(huì)通過一系列調(diào)節(jié)劑來控制和防止補(bǔ)體對(duì)自身細(xì)胞的攻擊，利用這一方面，煙曲霉已進(jìn)化出控制宿主補(bǔ)體攻擊的逃逸策略[54]。其分生孢子色素1,8-二羥基萘(DHN)黑色素可防止C3結(jié)合[55-56]。煙曲霉色素合成關(guān)鍵基因——alb1失活使煙曲霉色素缺失，孢子與補(bǔ)體C3結(jié)合增強(qiáng)，易于被吞噬細(xì)胞所識(shí)別吞噬[56]。同時(shí)，真菌絲氨酸蛋白酶Alp1可裂解并降解人補(bǔ)體蛋白C3、C4和C5，使真菌從補(bǔ)體攻擊中逃脫[57]。煙曲霉進(jìn)入機(jī)體后亦可利用可溶性人血漿調(diào)節(jié)劑[包括因子H、H樣蛋白1(FHL-1)、C4b結(jié)合蛋白(C4BP)和纖溶酶原]來限制補(bǔ)體沉積[54]。其分生孢子表面表達(dá)的Aspf2既是鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白[58-59]又是纖溶酶原結(jié)合與補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑獲得表面蛋白，可與因子H、FHL-1和FHR1結(jié)合蛋白，并抑制人嗜中性粒細(xì)胞調(diào)理/吞噬作用，有助真菌免疫逃逸。Aspf2結(jié)合纖溶酶原使其轉(zhuǎn)化為活性纖溶酶，利用宿主活性蛋白酶纖溶酶破壞人肺上皮細(xì)胞，改變細(xì)胞代謝活性，并誘導(dǎo)細(xì)胞收縮，導(dǎo)致上皮下細(xì)胞外基質(zhì)暴露，增強(qiáng)真菌侵襲力[60]。Aspf2敲除則使煙曲霉更有效與C3b發(fā)生作用，并被吞噬[60]。

2.5 下調(diào)宿主炎癥反應(yīng)抑制抗煙曲霉作用

煙曲霉生物膜的調(diào)節(jié)作用 煙曲霉生物膜可保護(hù)真菌免受免疫反應(yīng)殺傷，并增強(qiáng)其對(duì)抗真菌物質(zhì)的抵抗力。煙曲霉分生孢子表面共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁上的疏水性RodA蛋白組成棒狀層，可避免被免疫系統(tǒng)識(shí)別并使其具有免疫惰性，從而抑制樹突狀細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞成熟/激活，并失去對(duì)Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活能力[61]。細(xì)胞壁GAG成分有利于曲霉菌感染發(fā)展[62]，極具侵略性，甚至在免疫能力正常小鼠中也能促進(jìn)其生長(zhǎng)。GAG可通過誘導(dǎo)白介素1受體拮抗劑(IL-1Ra)來抑制人或小鼠Th1和Th17細(xì)胞因子產(chǎn)生[24,63]，也能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和對(duì)中性粒細(xì)胞胞外捕獲物(neutrophil extracellular traps，NETs)的抗性能以減少中性粒細(xì)胞募集，增加侵襲性曲霉病易感性[63]。

煙曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用 煙曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物同樣具有極強(qiáng)免疫抑制作用，可協(xié)助真菌適應(yīng)不同環(huán)境條件，提高其物種競(jìng)爭(zhēng)力或抑制免疫反應(yīng)[64]。煙曲霉合成的DHN-黑色素[65]是其借以逃避免疫監(jiān)視的主要工具。黑色素可降低紫外線對(duì)煙曲霉的影響，維持基因組穩(wěn)定性[12]。其亦能減少細(xì)胞吞噬作用和降低殺滅微生物肽毒性[66-68]。同時(shí)，黑色素還可提高煙曲霉對(duì)ROS、抗真菌藥物和細(xì)胞裂解的抗性[7]。而DHN-黑色素則能阻斷吞噬溶酶體，并且誘導(dǎo)PI3K/Akt激酶直接磷酸化，使分生孢子可通過阻止胱天蛋白酶活化而抑制巨噬細(xì)胞凋亡途徑[69]。

次級(jí)代謝產(chǎn)物GT是一種免疫抑制性的真菌毒素[70]。GT可通過抑制肌酸激酶、NADPH氧化酶等以改變宿主防御系統(tǒng)。其能阻止NADPH氧化酶復(fù)合物組裝與活性，抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)[71]；其也可通過直接滅活蛋白硫醇來抑制巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞功能[71-72]，抑制對(duì)分生孢子的吞噬作用[73]，以促進(jìn)體內(nèi)真菌傳播。GT亦可通過抑制NF-κB信號(hào)途徑，破壞宿主促炎反應(yīng)[74]。GT還能作用于細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧損傷DNA，誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡。

煙曲霉素則可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，抑制了ROS生成[18]，且具有抗血管生成活性，能促進(jìn)真菌侵襲破壞肺上皮細(xì)胞[75]。其還有抑制中性粒細(xì)胞功能和誘導(dǎo)紅細(xì)胞死亡等作用[76]。煙曲霉酸則屬于一類天然類固醇抗生素，可以影響巨噬細(xì)胞功能，還會(huì)引起上皮細(xì)胞的纖毛化和破裂[77]。核糖毒素(ribotoxin)屬滅活核糖體的堿性蛋白，可通過催化滅活核糖體抑制蛋白質(zhì)合成。Aspf1是一種核糖毒素，與過敏性曲霉疾病有關(guān)[78]。

煙曲霉誘導(dǎo)Th2相關(guān)免疫損傷 Th2在煙曲霉感染期間似乎起非保護(hù)作用，尤其在與真菌分泌蛋白質(zhì)相互作用后更為明顯。在曲霉感染中Th2不僅抑制保護(hù)性免疫，且是引起過敏反應(yīng)的關(guān)鍵因素。Th2細(xì)胞通過抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子，抑制T細(xì)胞活化和IFN-γ表達(dá)并促進(jìn)Th2反應(yīng)，從而對(duì)曲霉病的保護(hù)性Th1反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響[79]。煙曲霉刺激支氣管上皮細(xì)胞后，還能激活蛋白酶受體(PAR-2)和PTPN11(SHP2)，這種磷酸酶亦可抑制IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)，使得CD4+T細(xì)胞偏向Th2細(xì)胞反應(yīng)[80]。動(dòng)物模型中已證實(shí)，過度的Th2反應(yīng)與曲霉病不良預(yù)后相關(guān)[81]。

綜上所述，煙曲霉的結(jié)構(gòu)與其致病因子復(fù)雜多樣，面對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)煙曲霉已開發(fā)出多種免疫逃逸策略以提高自身在宿主體內(nèi)的生存率。其在“惡劣”的環(huán)境中形成了補(bǔ)償機(jī)制和途徑來抵消不利于自身生存的環(huán)境因素，這種能力可以幫助真菌抵抗宿主的防御，造成宿主的肺組織破壞性感染。煙曲霉可以通過黏附/定植、適應(yīng)內(nèi)環(huán)境壓力、改變營(yíng)養(yǎng)攝取、逃避宿主補(bǔ)體監(jiān)視和下調(diào)宿主抗真菌反應(yīng)等方式來逃避宿主的炎癥反應(yīng)，這也使煙曲霉感染更具侵襲性、難治性。隨著免疫功能低下患者人數(shù)的增加，煙曲霉肺部感染數(shù)量也將會(huì)持續(xù)增長(zhǎng)。了解真菌病原體與宿主間復(fù)雜的免疫串?dāng)_將是研究真菌感染發(fā)生機(jī)制和治療標(biāo)靶的核心內(nèi)容，為從抗宿主免疫層面探討煙曲霉新的治療方法提供了更廣闊前景。