陳學(xué)梅，黃志文，劉裕源，鄧儀昊，何紅云

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 腦卒中病理研究實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650500)

腦卒中俗稱中風(fēng)（cerebral stroke），又稱為腦血管意外，是一種突發(fā)且進(jìn)展迅速的腦缺血性或出血性疾病。中國(guó)面臨著世界上最大的中風(fēng)防治挑戰(zhàn)，中風(fēng)導(dǎo)致的死亡率位列第三，居惡性腫瘤和心臟病之后[1]，其中缺血性腦卒中占87%[2]，尋找有效治療方法迫在眉睫。缺血性腦卒中發(fā)生后，導(dǎo)致細(xì)胞所需的氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足，引起腦損傷，進(jìn)而破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而觸發(fā)一系列病理生理過(guò)程，包括血腦屏障破壞、炎癥、細(xì)胞凋亡和自噬等，導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果[3]。挽救半影區(qū)神經(jīng)元是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵，雖然在動(dòng)物模型中已經(jīng)鑒定出大量神經(jīng)保護(hù)劑，但是，迄今為止，沒(méi)有一種在臨床試驗(yàn)中被證明是有效的[4]。

組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases,HDACs）是一個(gè)酶家族，對(duì)組蛋白和非組蛋白中的賴氨酸殘基進(jìn)行去乙酰化，這些蛋白質(zhì)去乙?；瘯?huì)對(duì)其功能、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用產(chǎn)生顯著影響，從而調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)與細(xì)胞存活和炎癥等相關(guān)的多種信號(hào)通路[5]。由于HDACs在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布不同，因此在腦缺血的相關(guān)機(jī)制中表現(xiàn)出不同的作用。HDACs和HDAC抑制劑（histone deacetylase inhibitors, HDACi）調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的一系列過(guò)程，顯著減少梗死面積，并在體內(nèi)外發(fā)揮保護(hù)作用[6]。盡管現(xiàn)在已經(jīng)批準(zhǔn)了6種HDACi用于臨床治療，但它們都是很少或沒(méi)有HDACs同工型選擇性的泛抑制劑，具有明顯的副作用。首先，多數(shù)特異性HDACi不能透過(guò)血腦屏障；其次，非特異性HDACi與一些副作用有關(guān)，如體重減輕和中風(fēng)I/II期臨床研究中的心律失常[4]。因?yàn)镠DACi的使用尚未在缺血性卒中患者中提供令人滿意的結(jié)果，所以探究組蛋白去乙酰化酶在腦卒中中的病理機(jī)制對(duì)于研發(fā)靶點(diǎn)藥物具有重要的意義。

1 HDACs 的分類

HDACs根據(jù)序列、結(jié)構(gòu)和功能同源性分為四個(gè)類別和18種亞型。第Ⅰ類、第Ⅱ類和第Ⅳ類被認(rèn)為是“經(jīng)典”的高密度脂蛋白，其活性受到曲古菌素A（trichostatin A , TSA）的抑制，并具有鋅依賴的活性位點(diǎn)，第Ⅱ類又進(jìn)一步劃分為a型和b型。值得注意的是，Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDACs的表達(dá)已在鼠腦和人腦中得到報(bào)道，顯示出細(xì)胞和區(qū)域特異性模式[7]。第Ⅲ類是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）依賴的蛋白家族——沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶（sirtuins），不受TSA的影響。

2 HDACs 的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

第Ⅰ類HDACs在整體結(jié)構(gòu)上類似，都含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合位點(diǎn)和鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，除此催化結(jié)構(gòu)域還包括2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)對(duì)去乙?；阜磻?yīng)有一定作用。第Ⅰ類HDACs一種核蛋白，在機(jī)體各組織器官中廣泛表達(dá)，可在細(xì)胞核內(nèi)與共同轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合，使染色體組蛋白和非組蛋白去乙?；?，從而抑制轉(zhuǎn)錄[8]。

第Ⅱ類HDACs除了催化核心結(jié)構(gòu)域外，Ⅱa類還擁有獨(dú)特的、保守的N端延伸區(qū)域，其上包含多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)擁有一個(gè)位于N端的核定位信號(hào)區(qū)域和一個(gè)位于C端的核輸出信號(hào)區(qū)域，因此它們可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭。在催化活性部位靠近第一個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)的地方，第Ⅰ類HDACs和Ⅱb類HDACs擁有一個(gè)保守的酪氨酸殘基，其側(cè)鏈上的羥基能與氧化中間物相互作用并穩(wěn)定這種過(guò)渡狀態(tài)。第Ⅱ類HDACs的表達(dá)具有階段特異性，特定的細(xì)胞信號(hào)可將其激活，Ⅱ類成員活化后可在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)類似于Ⅰ類成員的方式與共同轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄[9]。

Sirtuins屬于第三類HDACs，是酵母蛋白Sir2的同源物。Sirtuins的活性需要 NAD+，這使得這些酶對(duì)代謝和氧化還原變化敏感除具有一個(gè)催化核心結(jié)構(gòu)域外，有的還具有N端和C端延伸區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域參與細(xì)胞定位、與其他蛋白相互作用、調(diào)節(jié)自身酶活性等[10]。Sirtuins使多種底物去乙酰化，如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞代謝酶和組蛋白，參與許多生物過(guò)程，包括新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、自噬及衰老[11]。

HDAC11是第Ⅳ類HDACs中唯一的成員，也是目前已發(fā)現(xiàn)的HDACs中最短的蛋白，幾乎只有核心的催化結(jié)構(gòu)域，即只有去乙?；富钚?。HDAC11可與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元復(fù)合物的多個(gè)成員相結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)mRNA剪接[12]。

3 HDACs 在缺血性腦卒中的作用及調(diào)控機(jī)制

3.1 Ⅰ類HDACs

I類HDACs包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。HDAC1、HDAC2和HDAC3主要存在于細(xì)胞核中，且HDAC1和HDAC2幾乎相同，通常出現(xiàn)在抑制復(fù)合體中，HDAC3存在于不同的復(fù)合物中，而HDAC8沒(méi)有復(fù)合物，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，并且與膜相關(guān)。

3.1.1 HDAC1

HDAC1作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與許多生物過(guò)程。HDAC1主要在神經(jīng)元中表達(dá)，但也在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。在神經(jīng)退行性病變轉(zhuǎn)基因模型中，HDAC1提供有效的保護(hù)，防止培養(yǎng)的神經(jīng)元和體內(nèi)缺血模型中的DNA損傷和神經(jīng)毒性。短暫大腦中動(dòng)脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）導(dǎo)致皮質(zhì)中mRNA水平逐漸下降，而HDAC1可有效保護(hù)DNA免受損傷[13]。此外，HDAC1過(guò)表達(dá)還可以通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞極化從而減小梗死體積[14]。有研究顯示， HDAC1的神經(jīng)毒性取決于其從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致軸突運(yùn)輸中斷和線粒體功能障礙。細(xì)胞質(zhì)HDAC1對(duì)軸突運(yùn)輸?shù)亩拘宰饔檬怯捎谒哂心軌蚺c運(yùn)動(dòng)蛋白和α-微管蛋白結(jié)合，破壞它們與貨運(yùn)蛋白形成復(fù)合物的能力[15]。

3.1.2 HDAC2

在缺血半影區(qū)，HDAC2局限于神經(jīng)元細(xì)胞核中，廣泛存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的核、細(xì)胞體和突起中。tMCAO導(dǎo)致皮質(zhì)HDAC水平逐漸降低或HDAC水平無(wú)變化[16]。而在氧-糖剝奪（oxygen-glucose deprivation, OGD）損傷后，在初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)HDAC2基因的強(qiáng)誘導(dǎo)[17]。野生型（wild type, WT）和HDAC2敲除小鼠能通過(guò)提高細(xì)胞存活率和減少神經(jīng)炎癥來(lái)促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，而過(guò)表達(dá)HDAC2則加重了中風(fēng)誘發(fā)的功能障礙[5,18]。

3.1.3 HDAC3

來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)模型的大量證據(jù)表明，HDAC3促進(jìn)神經(jīng)退行性病變，此外，它被認(rèn)為是HDACi產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的主要靶點(diǎn)[19]。在缺血、缺氧的皮質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)HDAC3顯著表達(dá)，并且siRNA特異性敲除HDAC3能增加皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，此外，siRNA敲除HDAC3模擬缺血再適應(yīng)的有益效果，其中鈣蛋白酶介導(dǎo)的HDAC3的C端斷裂在體內(nèi)外負(fù)責(zé)缺血預(yù)適應(yīng)[18,20]。HDAC3選擇性抑制劑RGFP966可以從細(xì)胞核中清除HDAC3，并在體內(nèi)和培養(yǎng)的神經(jīng)元中保護(hù)神經(jīng)元免受損失[21]。因此，無(wú)論是藥物抑制還是敲除HDAC3，對(duì)缺血性腦卒中都具有保護(hù)作用。

3.1.4 HDAC8

HDAC8主要存在于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中。在tMCAO后皮質(zhì)HDAC8基因水平降低或無(wú)變化，而在光血栓性卒中（photothrombotic stroke, PTS）7d、14d后腦組織神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中HDAC8活性升高[18]。相應(yīng)地，在初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元中，OGD導(dǎo)致HDAC8基因的瞬時(shí)誘導(dǎo)[17]。在氧化損傷后，HDAC8敲除的小鼠神經(jīng)元中細(xì)胞死亡增加[22]。

3.2 Ⅱ類HDACs

Ⅱ類HDACs包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它們可以分為兩個(gè)亞類，Ⅱa類（HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9）和Ⅱb類（HDAC6、HDAC10）。

3.2.1 Ⅱa類HDACs

Ⅱa類HDACs的兩種亞型HDAC4和HDAC5在結(jié)構(gòu)上相似，在大腦中大量表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。HDAC7在內(nèi)皮細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中富集。HDAC9在肌肉、心臟和大腦中高度富集化。

HDAC4：在缺血性卒中時(shí)觀察到調(diào)節(jié)異常的HDAC4，影響神經(jīng)元死亡、血管生成和神經(jīng)發(fā)生，在缺血性卒中和卒中后恢復(fù)的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，在缺血性中風(fēng)模型和OGD處理的神經(jīng)元中，HDAC4減少，而HDAC4的低表達(dá)可增加缺血性腦卒中的梗死體積，減少OGD處理的神經(jīng)元的細(xì)胞活力，且低水平的HDAC4與細(xì)胞增殖和血管生成以及血腦屏障完整性喪失相關(guān)[23]。另一方面，中風(fēng)誘導(dǎo)神經(jīng)元中HDAC4的核穿梭加重了神經(jīng)元死亡。相比之下，核HDAC4的增加與神經(jīng)元重塑密切相關(guān)，但與神經(jīng)元細(xì)胞死亡無(wú)關(guān)[24]，表明核HDAC4在促進(jìn)缺血性損傷后神經(jīng)元恢復(fù)中的中作用。此外，缺血增加了內(nèi)皮細(xì)胞中HDAC4的磷酸化，這是通過(guò)體內(nèi)和體外的缺氧誘導(dǎo)因子——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)促進(jìn)卒中后血管生成[25]。綜上可以看出，HDAC4不同的細(xì)胞定位可解釋其在不同條件下的神經(jīng)保護(hù)作用或神經(jīng)毒性作用。

HDAC5：在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中，HDAC5均勻分布在胞核和胞質(zhì)中[26]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，HDAC5參與神經(jīng)元分化。研究表明，HDAC5可抑制心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-A的抗凋亡作用，該因子在缺血和再灌注時(shí)調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡[27]。有趣的是，HDAC4和HDAC5在正常和缺血皮層的神經(jīng)元樹(shù)突中表達(dá)，表明在缺血損傷后，HDAC4和HDAC5促進(jìn)樹(shù)突生長(zhǎng)[24]。

HDAC7：HDAC7具有神經(jīng)保護(hù)作用，并非依靠其去乙?；富钚?，而是通過(guò)抑制c-jun，而c-jun是一種在神經(jīng)元死亡中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[28]。tMCAO后和OGD治療的初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元中HDAC7水平?jīng)]有顯著改變[17]。在后肢缺血模型中，HDAC7衍生的7-氨基酸肽(HDAC7的剪接形式)可以增加血管干細(xì)胞的遷移和分化，以增強(qiáng)血管生成和改善血管損傷[29]。在其它研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC7可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能和增生的調(diào)節(jié)有關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是腦損傷的一個(gè)適應(yīng)性過(guò)程[30]。

HDAC9：HDAC9在神經(jīng)元中發(fā)揮多種生理功能，例如，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和樹(shù)突的生長(zhǎng)及發(fā)育[31]。另一方面，已知HDAC9加重了中風(fēng)后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[32]。tMCAO后，皮質(zhì)HDAC9水平降低或升高，而在OGD處理的初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)顯著變化[33]。此外，與WT小鼠相比，HDAC9 敲除小鼠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，在tMCAO后產(chǎn)生了較小的梗死體積和神經(jīng)功能的改善[34,35]。

3.2.2 Ⅱb類HDACs

HDAC6、HDAC10是Ⅱb類HDAC的成員，結(jié)構(gòu)相似，但亞細(xì)胞定位和去乙酰靶標(biāo)不同。這表明，HDAC6和HDAC10可能具有不同的功能。但是兩者都被反復(fù)與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)降解和自噬聯(lián)系在一起。

HDAC6：HDAC6是一種主要的細(xì)胞質(zhì)酶，其細(xì)胞定位受核輸入和輸出信號(hào)的調(diào)節(jié)[36]。腦卒中后半影區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth associated protein-43,GAP-43）的高表達(dá)是軸突生成的早期信號(hào)，選擇性抑制HDAC6可增加GAP-43的表達(dá)，GAP-43在中風(fēng)后14天內(nèi)保持高表達(dá)，可能有助于神經(jīng)功能從PTS誘導(dǎo)的缺陷中恢復(fù)[37]。此外，有研究表明tubastatin A（HDAC抑制劑）誘導(dǎo)的HDAC6活性下降恢復(fù)了細(xì)胞的α-微管蛋白乙?；谀X卒中后早期恢復(fù)和減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可以保護(hù)膠質(zhì)細(xì)胞免受缺血性損傷，并促進(jìn)中風(fēng)后腦組織的恢復(fù)[38]。

HDAC10：HDAC10對(duì)溶酶體的穩(wěn)態(tài)很重要，但其去乙?；繕?biāo)和功能特征不佳[39]。研究表明，HDAC10促進(jìn)自噬[40][36]。最近的研究表明[41]，HDAC10在作用后使熱休克同源蛋白70kDa(heat shock cognate 70 kDa protein, HSC70)去乙?；?，HSC70在伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)中起重要作用，結(jié)合CMA底物并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體。HDAC10敲除激活了CMA并加速了CMA底物的降解速率。因此，抑制HDAC10的表達(dá)可能對(duì)治療神經(jīng)退行性疾病有效，其中CMA下調(diào)是主要的原因。

3.3 Ⅲ類HDACs

Sirtuins在哺乳動(dòng)物中有7種亞型，SIRT1-7。SIRT1和SIRT6主要位于細(xì)胞核中，SIRT2位于細(xì)胞質(zhì)中，SIRT3-5是線粒體蛋白，SIRT7位于核仁中。Sirtuins功能取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞內(nèi)定位、Sirtuins亞型對(duì)不同底物的特異性和酶翻譯后修飾的性質(zhì)。

SIRT1在許多關(guān)于缺血性卒中的研究中顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。在缺血性腦損傷方面，SIRT1活性降低可能會(huì)加重小鼠永久性的缺血性腦損傷。OGD后，SIRT1通過(guò)AMPK-PGC1途徑抑制SIRT3表達(dá)，導(dǎo)致線粒體活性氧生成，進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障通透性降低和細(xì)胞凋亡。血腦屏障破壞和隨之而來(lái)的腦水腫是導(dǎo)致缺血性卒中后神經(jīng)功能障礙和死亡的關(guān)鍵致病因素。此外，SIRT1通過(guò)誘導(dǎo)核因子κB下調(diào)和p53誘導(dǎo)的凋亡通路以及炎癥來(lái)保護(hù)腦缺血損傷[42]。許多結(jié)果表明SIRT2在神經(jīng)退行性疾病和其他病理狀況中起著有害的作用，但其在腦缺血的結(jié)果不太清楚[43]。SIRT3是唯一具有顯著去乙酰酶活性的線粒體蛋白，SIRT3可以調(diào)節(jié)代謝和退行性疾病，有助于防止肺動(dòng)脈高壓以及缺氧和缺血狀況[44]。SIRT3可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體神經(jīng)酰胺的合成來(lái)減少PTS小鼠模型的腦組織損傷。SIRT4在發(fā)育早期的大腦中高表達(dá)，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞中，SIRT4可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，從而引發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡[45]。SIRT5 通過(guò)降解緊密連接蛋白o(hù)ccludin 來(lái)增加血腦屏障通透性，從而介導(dǎo)缺血/再灌注誘導(dǎo)的腦損傷。SIRT5基因敲除和WT的小鼠在缺血/再灌注后，均減少了腦梗死面積，改善了神經(jīng)功能，減弱了卒中后的全身炎癥[46]。SIRT1和SIRT6被認(rèn)為是各種衰老相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)，即核Sirtuins的激活可以作為代謝和神經(jīng)退行性疾病的治療方法，但有研究表明SIRT1、SIRT2 和SIRT6不參與小鼠PTS后半影區(qū)細(xì)胞的凋亡[11]。在正常細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中，SIRT7是rRNA和蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)器，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。但是尚不清楚SIRT7在缺血性腦卒中中的作用。在Lv J等[47]的研究中，他們發(fā)現(xiàn)在OGD復(fù)氧治療后，神經(jīng)元中SIRT7的表達(dá)顯著增加，SIRT7的敲除加重了OGD誘導(dǎo)的損傷，增加了p53總蛋白和乙酰化蛋白的水平，此外，還增加了p53對(duì)凋亡的轉(zhuǎn)錄活性，激活了p53介導(dǎo)的促凋亡信號(hào)通路?？傊Y(jié)果表明SIRT7參與保護(hù)神經(jīng)元免受OGD復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的促凋亡信號(hào)通路。

3.4 Ⅳ類HDACs

HDAC11在腦、心臟、肌肉、腎臟和睪丸中表達(dá)豐富，但對(duì)其功能知之甚少。體內(nèi)tMCAO和體外OGD原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)后，未發(fā)現(xiàn)HDAC11水平的顯著變化[17]。相反，在tMCAO后，HDAC11 mRNA短暫增加，而蛋白質(zhì)顯著降低[21]。

4 總結(jié)

腦卒中發(fā)病率和致殘率高，其中缺血性腦卒中占腦卒中總發(fā)病率的一半以上，研究缺血性腦卒中的病理過(guò)程及尋找治療的靶點(diǎn)是挽救卒中病人治療的關(guān)鍵?；贖DACs在缺血性腦卒中病理過(guò)程中發(fā)揮的作用，靶向HDACs治療可能是一種有效的治療方式。但由于其發(fā)揮作用的機(jī)制復(fù)雜多變，因此，距離臨床上使用還有很大的挑戰(zhàn)。其次，HDACs在缺血性腦卒中的作用仍有許多未解之謎，因此探討HDACs在缺血性腦卒中病理機(jī)制中的調(diào)控機(jī)制，明確參與卒中的具體亞型，將是研發(fā)特異抑制劑治療卒中的有效途徑。