姜雄，李夏夏，王應(yīng)蘭，張景寧，謝承衛(wèi)

(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

磷是植物生長所必須的營養(yǎng)元素之一，磷元素能夠促進植物各種代謝正常及生長發(fā)育[1-2]。我國土壤整體表現(xiàn)為缺磷，因為土壤里絕大部分磷都是難溶性磷，不能直接被植物吸收利用[3]，所以提高土壤中有效磷的含量對農(nóng)林業(yè)具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在一些能夠?qū)⑼寥乐须y溶性無機磷分解為可溶性磷的微生物，該類細菌被稱為解磷菌，利用解磷菌活化土壤難溶性無機磷因具有高效、環(huán)保且與土壤具有親和性等特點[4]，在相關(guān)領(lǐng)域越來越受重視。

解磷菌的篩選方法有沙培法和難溶性無機磷液體培養(yǎng)法2種[5]。液體培養(yǎng)法以磷酸鈣為磷源，篩選出高效的解磷細菌。該法篩選得到的解磷菌株，對不同的磷源，其解磷能力和解磷效果具有明顯的差異，郭淵等[6]篩選得到一株腸膜明串菌株，將腸膜明串菌株對5 種不同磷源(磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、植酸鈣、卵磷脂)進行解磷研究，研究發(fā)現(xiàn)腸膜明串菌株對上述5 種難溶性磷源都具有分解能力，但是對不同磷源的分解能力差異較大，其中對磷酸三鈣的分解能力最強，遠遠強于對其他磷源的分解。沙培法是將目標礦物作為唯一磷源，將初篩得到的菌株直接對目標礦物進行解離，測量解離前后的有效磷的含量從而篩選出高效的解磷細菌。通過沙培法篩選得到的解磷菌株對目標礦物更具有針對性和高效性，并且能夠避免采用單純液體培養(yǎng)方法，丟失部分解磷菌的問題。

煤矸石是一種采煤過程中產(chǎn)生的固體廢棄物，占原煤的15 %～20 %，全國的煤矸石堆存量有數(shù)十億噸之多，且目前煤矸石的綜合利用率不高[7]。煤礦的大量開采，產(chǎn)生的大量煤矸石長期堆放不僅占用土地面積，而且造成環(huán)境污染[8-9]。

煤矸石中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中含有SiO2、P2O5、Al2O3、Fe2O3、CaO、MgO、Na2O、K2O 等，另外還有少量的稀有元素，比如 Ni、B、Be 等[10-12]，這些成分能夠滿足植物生長需要。而煤矸石中磷多以難溶性無機磷的形式存在，不能直接被植物所利用，利用解磷微生物將其轉(zhuǎn)換為可溶性磷，則能將煤矸石作為一種微生物肥料為植物提供所需的磷素，為煤矸石的資源化利用提供一個新的可能[13-15]。

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株與對照菌株

實驗菌株(GJ-6)從貴州省銅仁地區(qū)萬山某礦區(qū)采樣，通過沙培法篩選、純化、培養(yǎng)得到。對照菌株使用巨大芽孢桿菌。

1.1.2 煤矸石樣品

煤矸石樣品來自于貴州省某煤礦集團三個不同礦區(qū)。其成分如表1所示。

表1 3種煤矸石的化學(xué)成分及含量

1.1.3 培養(yǎng)基

難溶性無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸鈣10 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0～7.2。

難溶性無機磷固體培養(yǎng)基：在難溶性無機磷液體培養(yǎng)基里面加入15～20 g瓊脂。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏1 g，酵母粉2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 解磷菌的篩選，純化與保存

使用難溶性無機磷培養(yǎng)基進行解磷菌的初篩，將初篩得到的菌株制備成菌懸液，以煤矸石作為唯一磷源，吸取2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌懸液20 mL于裝有10 g煤矸石的無菌培養(yǎng)皿中，將菌液與煤矸石混勻，放入35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。進行3組對照實驗，按照文獻[16]測定解離前后中煤矸石中有效磷的含量變化，與巨大芽孢桿菌作對比，將解磷效果較好的菌株4 ℃斜面保藏備用。

1.2.2 解磷菌的鑒定

將純化保種后的菌株在LB固體培養(yǎng)基上，于35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，待長出單菌落后，觀察細菌菌落的特征，包括形狀、大小、顏色、干濕性、透明度、隆起程度等，并對純化后的菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析

用16S rRNA(2F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′)通用引物進行PCR擴增，擴增條件如表2所示。

表2 PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

將PCR擴增得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳實驗，觀察凝膠成像結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物送往上海立菲特生物技術(shù)有限公司測序，對測定結(jié)果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 解磷菌的解離煤矸石能力測定

① 將篩選得到的解磷菌株，與通過液體培養(yǎng)法篩選得到的解磷細菌進行對比，對煤矸石進行解離實驗。將供試菌株同時接種于LB固體培養(yǎng)基中，用無菌水洗下制備成2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌懸液，分別吸取20 mL菌懸液于裝有煤矸石的無菌培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將解離完成的煤矸石樣品烘干，按照文獻[16]測量其中的有效磷含量。

② 將篩選得到的解磷菌株，與巨大芽孢桿菌進行對比，對煤矸石進行解離單因素實驗和正交實驗，獲得最佳的解離條件。將GJ-6和巨大芽孢桿菌同時接種于LB固體培養(yǎng)基中，用無菌水洗下制備成2.75×109～1.34×1010cfu/mL的菌懸液，分別吸取60 mL的GZ-125菌懸液和70 mL的巨大芽孢桿菌懸液于裝有煤矸石的無菌培養(yǎng)皿中，分別將pH調(diào)節(jié)至6和7，然后放入35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)7 d和6 d。將解離完成的煤矸石樣品烘干，按照文獻[16]方法分別測定其中的有效磷的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 解磷菌的篩選

初篩即挑選出能夠在難溶性無機磷培養(yǎng)基上生長，且長勢好的菌株進行分離純化，得到具有一定解磷能力的菌株。將初篩得到的菌株，使用沙培法將煤矸石作為目標礦物進行解離，并以巨大芽孢桿菌做參照，測定解離后樣品的有效磷含量，初步篩選出15株具有較好的解離細菌，并將其編號為GJ-1～GJ-15(圖1)。由圖1可知，15株解磷菌株解磷效果均優(yōu)于巨大芽孢桿菌，且GJ-6解磷效果最佳。

圖1 細菌篩選結(jié)果

2.2 GJ-6的菌落及菌體形態(tài)

GJ-6在LB固體培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)如圖2(a)所示，菌落形態(tài)不透明，形狀邊緣規(guī)則，表面濕潤，有凸起，呈乳白色，有光澤，菌落大小約2 mm。如圖2(b)所示，GJ-6經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性(G—)桿菌。

2.3 PCR及瓊脂糖電泳實驗

將GJ-6號菌進行PCR擴增反應(yīng)，其擴增后的產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳觀察(圖3)。如圖3所示，左邊亮帶為2 000 bp DNA分子質(zhì)量標準，右邊的亮帶為GJ-6，由圖3可知，GJ-6號菌的基因組DNA擴增結(jié)果為1 401左右的16S rRNA基因特異性片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

(a) 菌落形態(tài)

圖3 GJ-6 菌株 16S rRNA PCR 擴增結(jié)果

2.4 進化樹構(gòu)建與分析

將GJ-6菌株瓊脂糖電泳實驗結(jié)果進行膠回收，送往測序公司進行測序。對測序結(jié)果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖4所示。由圖4可知，GJ-6菌株與節(jié)桿菌屬在同一分支上，同源性達99 %，結(jié)合顯微形態(tài)確定GJ-6菌株為節(jié)桿菌。

圖4 GJ-6 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 解磷菌解磷煤矸石的結(jié)果

2.5.1 GJ-6菌株解離3種煤矸石結(jié)果

GJ-6號菌對3種煤矸石的解離效果都優(yōu)于商業(yè)巨大芽孢桿菌，且處理煤矸石3的效果優(yōu)于其他2種煤矸石，結(jié)果如圖5所示。因此以煤矸石3為目標礦物，對GJ-6的解磷能力進行進一步研究。

圖5 GJ-6解離3種煤矸石結(jié)果

2.5.2 GJ-6與液體培養(yǎng)法篩選細菌解離煤矸石結(jié)果

將沙培法篩選得到的解磷細菌GJ-6與實驗室部分通過液體搖瓶培養(yǎng)篩選得到的6株解磷細菌進行解離3號煤矸石的對比實驗。實驗結(jié)果顯示沙培法篩選的GJ-6菌株對煤矸石的解離效果均優(yōu)于其他液體搖瓶培養(yǎng)篩選的菌株，結(jié)果如圖6所示。

圖6 GJ-6與液體搖瓶培養(yǎng)篩選菌株解離煤矸石結(jié)果

2.5.3 GJ-6菌株解離煤矸石正交結(jié)果

將GJ-6和巨大芽孢桿菌2種菌分別對煤矸石3進行解離實驗，主要對體系 pH、接菌量、解離時間、煤矸石粒度進行單因素實驗。根據(jù)單因素結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，菌株對礦物粒度不敏感，因此使用采樣、縮分和制樣，并粉碎至0.25 mm的煤矸石3作為解離對象對兩株菌株分別設(shè)計L4(2)3正交實驗(表4)。從表3和表4可知，巨大芽孢桿菌的最佳解離條件下，煤矸石的有效磷含量為93.71，是原樣空白的13.5倍；GJ-6菌株的最佳解離條件下，煤矸石的有效磷含量為124.24，是原樣空白的17.9倍。結(jié)果如表4所示。

表3 巨大芽孢桿菌的正交實驗及其結(jié)果

表4 GJ-6的正交實驗及其實驗結(jié)果

3 結(jié)論

目前解磷細菌解離礦物的研究較少，由于解磷菌不同，其對礦物的解離能力也各不相同。沙培法篩選得到的解磷細菌，相較于傳統(tǒng)液體培養(yǎng)法篩選得到的解離細菌更具有針對性，能夠更好地解離對應(yīng)的目標礦物。同時，采用沙培法可以篩選得到一些傳統(tǒng)方法可能漏掉的解磷細菌，增加了篩選的成功率。

本文對采用沙培法篩選得到的GJ-6菌株，進行解磷能力的研究，發(fā)現(xiàn)GJ-6菌株解離煤矸石后，有效磷含量高于采用通過傳統(tǒng)液體培養(yǎng)法篩選得到的解磷菌株。以煤矸石作為目標礦物，采用沙培法篩選得到的解離菌株GJ-6，具有較好的解磷能力，與巨大芽孢桿菌相比，能夠更好地解離煤矸石中的難溶性無機磷。

針對不同區(qū)域的煤矸石，篩選開發(fā)專用的微生物細菌，使煤矸石的資源化利用變成可能，變廢為寶，解決了煤矸石的危害。通過煤矸石微生物復(fù)合肥的形式能將解磷微生物引入土壤，能有效地緩解土壤缺磷的狀況，同時緩解使用傳統(tǒng)化學(xué)肥料帶來的一系列土壤問題，優(yōu)化土壤結(jié)構(gòu)，從而起到改良土壤的作用。