楊楠，林俊帆，劉張育，王慧，楊進(jìn)，黃明亞，馮志新，鮮義坤※

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610041；2.成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司，四川 成都 610100；3.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川 成都 611130；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；5.青神縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 青神 620460）

竹葉是大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）的三大竹類(lèi)食物之一。早在二十世紀(jì)七、八十年代，一些資深專(zhuān)家就開(kāi)始研究野生大熊貓選擇性采食的某些規(guī)律，結(jié)果表明，一年中的不同月份或季節(jié)大熊貓采食竹葉的數(shù)量存在明顯的差異[1,2]。有學(xué)者曾用多種竹子投喂過(guò)大熊貓，結(jié)果顯示，圈養(yǎng)大熊貓不取食毛竹等少數(shù)竹種的竹葉[3]。已有較多的文獻(xiàn)是從人居康養(yǎng)環(huán)境和食品藥用保健角度采用溶劑提取來(lái)分析竹葉的揮發(fā)性成分[4,5]。迄今為止尚未見(jiàn)到竹葉氣味與大熊貓采食之間是否存在一定關(guān)聯(lián)性的深入研究報(bào)道。本文通過(guò)5 種竹子（包括稈和葉）的圈養(yǎng)大熊貓自由選擇采食試驗(yàn)，樣品的專(zhuān)業(yè)人員嗅感品評(píng)，電子鼻測(cè)試以及頂空（HS）-固相微萃取（SPME）-氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用法測(cè)定揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）和香氣成分，以揭示大熊貓選擇竹葉采食的氣味機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試竹種與受試動(dòng)物

選擇毛竹（Phyllostachys edulis）、牛兒竹（Bambusa prominens）、硬頭黃竹（Bambusa rigida）、清甜竹（Dendrocalamus sapidus）和孝順竹（Bambusa multiplex）5 種竹子作為供試竹種，均屬人工飼養(yǎng)條件下不常喂給大熊貓的竹種。以四川省青神縣熊貓館的“蘇星”和“華榮”2 只大熊貓為試喂對(duì)象，2019 年4 月10 日和16 日（春季）及2020 年6 月10 日和7 月15 日（夏季）上午試喂并采樣，試喂時(shí)段用供試竹種替代苦竹（Pleioblastus amarus），其他相關(guān)信息同文獻(xiàn)[6]。

1.2 竹葉樣品的采集與制備

將砍回的竹子迅即進(jìn)行多點(diǎn)隨機(jī)采集竹葉樣品，混合，隨機(jī)抽取竹葉，用多次清洗無(wú)味的剪刀制成2～3 mm 3～5 mm 大小的葉片，再混合，隨機(jī)分成3 份，分別用于氣味專(zhuān)業(yè)人員嗅感品評(píng)、電子鼻測(cè)試和HSSPME-GC-MS 分析。樣品在裝有冰塊的保溫箱中運(yùn)輸，置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3 大熊貓的自由選擇采食試驗(yàn)

先將3～5 種竹稈及其附帶的枝葉（其他竹葉和竹稈另文發(fā)表[6]）放于外活動(dòng)圈或/和內(nèi)活動(dòng)圈的食臺(tái)上，分別做好標(biāo)識(shí)，然后從隔離圈中放出大熊貓，這樣大熊貓可自由地選擇某種竹子的稈或/和葉采食，用監(jiān)控設(shè)備或/和攝像機(jī)從多個(gè)角度記錄大熊貓的采食行為。通過(guò)錄像回放，仔細(xì)觀察大熊貓?jiān)诙鄠€(gè)竹種之間及竹葉與竹稈之間根據(jù)自己對(duì)食物風(fēng)味的偏好自由選擇的采食情況。

1.4 分析儀器

PEN 3 型電子鼻由德國(guó)Airsense 公司出品，內(nèi)置10 個(gè)不同的金屬氧化物傳感器，分別響應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)類(lèi)別是R1 為芳香類(lèi)，R2 為氮氧化物，R3 為氨類(lèi)，R4 為氫化物，R5 為短鏈烷烴，R6 為甲基類(lèi)，R7 為萜烯類(lèi)，R8 為醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)，R9 為有機(jī)硫化物，R10為長(zhǎng)鏈烷烴。其他儀器同文獻(xiàn)[7]。

1.5 嗅感品評(píng)與儀器分析方法

專(zhuān)業(yè)人員的嗅感品評(píng)和電子鼻測(cè)試除每種竹葉用樣2.0 g外，其他具體方法參照文獻(xiàn)[8]。氣味品評(píng)組由8 人（其中女性4 名）組成，平均年齡43 歲。每種竹葉的HS-SPME 用樣1.5 g，在70℃下頂空萃取1 h，此外其他HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用的具體方法參照文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種竹葉的大熊貓采食行為表現(xiàn)

根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)觀察和錄像回放，受試圈養(yǎng)大熊貓采食供試竹葉的主要行為流程為 嗅聞→摘葉→咬切→咀嚼→吞咽。大熊貓嗅聞竹葉后有2 種行為表現(xiàn)：①采食?？赡芤?yàn)橹袢~散發(fā)出的氣味韻調(diào)為大熊貓所熟悉并認(rèn)知安全，具有誘食性；②不采食?？赡芤?yàn)橹袢~散發(fā)出的氣味韻調(diào)為大熊貓不熟知或存在不安全的隱患，不具誘食性。由上可知，嗅聞竹葉的氣味韻調(diào)是大熊貓采食前的預(yù)判行為，決定是否繼續(xù)進(jìn)行下一步采食行為流程。本文重點(diǎn)關(guān)注供試竹葉氣味韻調(diào)的誘食性，即大熊貓嗅聞竹葉后是否采食，至于大熊貓采食竹葉數(shù)量的多少還與竹葉理化性狀的適口性好壞密切相關(guān)，在此不關(guān)注。觀察結(jié)果顯示，受試大熊貓對(duì)5 種供試竹葉均有或多或少的采食，但對(duì)毛竹葉和孝順竹葉存在個(gè)體和季節(jié)性差異，具體情況見(jiàn)表1。

表1 受試大熊貓對(duì)5 種供試竹葉的采食情況Table 1 About ingestion of experimental giant pandas to 5 kinds of tested bamboo leaves

由表1 可知，受試大熊貓?jiān)?019 年春季和2020年夏季的試喂時(shí)段嗅聞供試竹葉后均采食了牛兒竹葉、硬頭黃竹葉及清甜竹葉，但“蘇星”在2019 年春季的試喂時(shí)段沒(méi)有采食毛竹葉和孝順竹葉，而“華榮”卻采食；“華榮”在2020 年夏季的試喂時(shí)段沒(méi)有采食孝順竹葉，而“蘇星”卻采食；說(shuō)明毛竹葉和孝順竹葉在受試大熊貓之間可能存在嗅感滿(mǎn)意度的個(gè)體差異，而孝順竹葉對(duì)同一受試大熊貓來(lái)說(shuō)可能還存在季節(jié)性差異，也可能與受試大熊貓?jiān)囄箷r(shí)段的饑飽程度有關(guān)。圈養(yǎng)大熊貓采食竹葉呈現(xiàn)出的個(gè)體和季節(jié)性差異也見(jiàn)于其他報(bào)道與觀察，在陜西樓觀臺(tái)的圈養(yǎng)大熊貓9～10 月份不取食毛竹葉[3]，鮮義坤曾于2015～2017 年在峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園熊貓館工作期間觀察到大熊貓對(duì)斑苦竹（Pleioblastus maculatus）葉的采食也存在個(gè)體和季節(jié)性差異這一現(xiàn)象。野生大熊貓對(duì)野生竹種的竹葉采食同樣有選擇性，同樣存在個(gè)體和季節(jié)性差異[1,2]。

2.2 5 種竹葉的嗅感品評(píng)

相同重量的樣品通過(guò)專(zhuān)業(yè)人員的嗅感盲評(píng)，5 種供試竹葉的氣味強(qiáng)度不盡一致，有的相對(duì)較濃，如硬頭黃竹葉等；有的相對(duì)較淡，如毛竹葉等；但均比同種同重的竹稈樣品氣味濃郁。這5 種竹葉的氣味韻調(diào)總體上清新、飄逸、強(qiáng)度較高、透發(fā)性較好、愉悅度中上等，盡管相互間也存在細(xì)小的差異，仍均可歸于竹葉類(lèi)香氣。5 種供試竹葉的主要相似氣味韻調(diào)，見(jiàn)表2。

表2 5 種供試竹葉的主要相似氣味韻調(diào)Table 2 The main similar odors of 5 kinds of tested bamboo leaves

由表2 可知，5 種供試竹葉均有青香、葉香、草香、甜氣、新鮮感和嫩氣等多種氣味韻調(diào)。此外，這些氣味韻調(diào)在嗅感的相對(duì)強(qiáng)度方面并非相近，如青香相對(duì)其他氣味韻調(diào)而言明顯又突出；不同竹葉之間也有差異，如清甜竹葉的甜氣相對(duì)較強(qiáng)，其他竹葉相對(duì)較弱。有人從2019 年和2020 年的孝順竹葉樣品中分別嗅辨出微弱的沉悶感和木質(zhì)氣息、油氣及藥氣，也有人從2020年的硬頭黃竹葉和清甜竹葉樣品中均嗅辨出微弱的酸氣。結(jié)合受試大熊貓對(duì)5 種供試竹葉嗅聞后的采食行為表現(xiàn)可以得知，竹葉散發(fā)出的主要?dú)馕俄嵳{(diào)為青香、葉香、草香、甜氣、新鮮感和嫩氣，均是受試大熊貓認(rèn)同的食物氣味韻調(diào)，這些氣味韻調(diào)及其相對(duì)強(qiáng)度的組合體代表了這5 種供試竹葉的主要天然氣味韻調(diào)，能夠誘導(dǎo)受試大熊貓采食；換言之，對(duì)于受試大熊貓而言，這5 種竹葉氣味韻調(diào)的誘食性主要在于相對(duì)突出的青香、較弱的葉香、草香、甜氣、新鮮感和嫩氣。

2.3 5 種竹葉的電子鼻測(cè)試

電子鼻又稱(chēng)氣味掃描儀，是模擬哺乳動(dòng)物嗅覺(jué)的工作原理進(jìn)行感知、分析和識(shí)別樣品的氣味。為了客觀地探索5 種供試竹葉之間整體氣味信息的異同，又對(duì)這5 種竹葉樣品進(jìn)行了電子鼻測(cè)試。測(cè)試的實(shí)時(shí)響應(yīng)曲線呈先急劇升高，后逐漸趨于平穩(wěn)，以測(cè)試穩(wěn)定階段的響應(yīng)值表征樣品的整體氣味信息。5 種供試竹葉的典型電子鼻響應(yīng)值如圖1 所示。

圖1 電子鼻測(cè)試5 種供試竹葉的響應(yīng)值雷達(dá)圖Fig.1 The radar chart of the response value of 5 kinds of tested bamboo leaves by electronic nose testing

由圖1 可知，5 種供試竹葉在R2 傳感器上的差異最大，其響應(yīng)值大小依次為清甜竹葉＞孝順竹葉＞硬頭黃竹葉＞牛兒竹葉＞毛竹葉；其次為R7 傳感器，響應(yīng)值大小的順序同R2 傳感器；R6 和R8 2 個(gè)傳感器上的響應(yīng)值差異較??；而在R1、R3、R4、R5、R9 和R10 6 個(gè)傳感器上的響應(yīng)值無(wú)明顯差異。根據(jù)電子鼻10 個(gè)傳感器對(duì)揮發(fā)性成分的響應(yīng)類(lèi)型[8]可推測(cè)，不同竹葉間的整體氣味差異可能主要由氮氧化物和萜烯類(lèi)化合物的差異所引起，甲基類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)化合物雖有影響，但程度較小。

2.3.1 PCA 分析 采用主成分分析(PCA)[8]是對(duì)竹葉測(cè)試穩(wěn)定階段的氣味數(shù)據(jù)進(jìn)行降維統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 5 種供試竹葉的電子鼻PCA 分析Fig.2 The electronic nose PCA analysis of 5 kinds of tested bamboo leaves

由圖2 可知，5 種供試竹葉的PCA 分析中第1主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率高達(dá)99.49%，第2主成分（PC2）貢獻(xiàn)率僅為0.50%，這2 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.99%，說(shuō)明前2 個(gè)主成分所代表的信息能夠完整反映竹葉樣品的整體氣味信息，且不同竹葉的氣味差異主要體現(xiàn)在PC1 上。這5 種竹葉樣品所在區(qū)域沒(méi)有交叉重疊，彼此獨(dú)立成簇，相互間有一定的距離，表明它們的整體氣味信息存在一定的差異，能夠通過(guò)電子鼻PCA 法準(zhǔn)確區(qū)分。牛兒竹葉、硬頭黃竹葉和毛竹葉分布區(qū)域相對(duì)較為集中，預(yù)示這3 種竹葉的整體氣味信息差異相對(duì)較小。

2.3.2 LDA 分析 進(jìn)一步采用線性判別分析（LDA）[8]是對(duì)PCA 分析中未能很好區(qū)分的竹葉樣品進(jìn)行再識(shí)別，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 5 種供試竹葉的電子鼻LDA 分析Fig.3 The electronic nose LDA analysis of 5 kinds of tested bamboo leaves

由圖3 可知，LD1 和LD2 的貢獻(xiàn)率分別為88.19%和11.06%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)99.25%，能較好地反映竹葉樣品的整體氣味信息。5 個(gè)供試竹葉樣品所在區(qū)域均無(wú)任何重疊，表明采用LDA 分析能有效地區(qū)分這5種不同的竹葉。在PCA 中所在區(qū)域相距較近的牛兒竹葉、毛竹葉和硬頭黃竹葉在LDA 分析中所在區(qū)域距離更遠(yuǎn)，表明LDA 分析能將這3 種竹葉的氣味信息更加有效地區(qū)分開(kāi)。再次說(shuō)明這5 種竹葉的整體氣味信息存在一定的差異，利用電子鼻中的LDA 法也能予以準(zhǔn)確識(shí)別。

2.3.3 LA 分析 為了進(jìn)一步明確在電子鼻模式識(shí)別系統(tǒng)中各傳感器的貢獻(xiàn)大小，又對(duì)5 種供試竹葉進(jìn)行了載荷分析（LA）[8]，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 5 種供試竹葉的電子鼻LA 分析Fig.4 The electronic nose LA analysis of 5 kinds of tested bamboo leaves

由圖4 可知，R2 傳感器是對(duì)PC1 貢獻(xiàn)最大的傳感器，R7 傳感器是對(duì)PC2 貢獻(xiàn)最大的傳感器，R6 和R8 對(duì)PC2 有點(diǎn)貢獻(xiàn)，但對(duì)PC1 貢獻(xiàn)較少，其他傳感器均位于0 點(diǎn)附近，影響均很小。根據(jù)電子鼻不同的傳感器對(duì)不同類(lèi)別的揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)靈敏性[8]可知，5 種供試竹葉之間的氣味差異可能主要與萜烯類(lèi)、氮氧化物等揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和含量多少有關(guān)，其次與甲基類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)化合物有關(guān)。

綜上所述，電子鼻測(cè)試結(jié)果表明，5 種供試竹葉的整體氣味存在一定的差異，可通過(guò)PCA 分析和LDA分析予以很好地區(qū)分，這與上述專(zhuān)業(yè)人員的嗅感品評(píng)結(jié)果大體相符。另外，5 種供試竹葉的氣味差異可能與萜烯類(lèi)和氮氧化物等揮發(fā)性物質(zhì)的差異密切相關(guān)。因此，有必要用HS-SPME-GC-MS 法進(jìn)一步測(cè)定這5 種竹葉中的揮發(fā)性成分，特別是典型的香氣成分，以便深入剖析這5 種竹葉之間氣味異同的物質(zhì)原由。

2.4 5 種竹葉的VOCs 和香氣成分

因受試大熊貓?jiān)?019 年春季和2020 年夏季嗅聞5 種供試竹葉后均有所采食，竹葉散發(fā)出的VOCs和香氣成分的測(cè)定均用相同的HS-SPME 設(shè)備、同一臺(tái)GC-MS 儀器、同樣的方法，由同一人操作，故2 年的分析數(shù)據(jù)合并處理。這5 種竹葉散發(fā)出的VOCs 類(lèi)別及其成分種數(shù)和相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5 種供試竹葉的VOCs 類(lèi)別及其成分種數(shù)和相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)Table 3 The VOCs categories and statistics of their component numbers and relative contents from 5 kinds of tested bamboo leaves

由表3 可知，5 種供試竹葉在VOCs 類(lèi)別的成分種數(shù)和相對(duì)含量方面存在大小不一的差異，其中烯烴類(lèi)的相互差異最大，這與電子鼻測(cè)試結(jié)果（萜烯類(lèi)屬烯烴類(lèi)的一部分）基本相符，進(jìn)一步說(shuō)明這5 種竹葉的氣味韻調(diào)及其強(qiáng)度可能存在一定程度的異同。

竹葉的氣味雖與VOCs 有關(guān)，但起主要作用的成分是其中被國(guó)內(nèi)和國(guó)外公認(rèn)的呈香物質(zhì)。竹葉中的典型香氣成分是按照文獻(xiàn)[10]的判定標(biāo)準(zhǔn)從測(cè)出的VOCs中篩選出的食品級(jí)單體呈香物質(zhì)。5 種供試竹葉中的香氣成分見(jiàn)表4。

表4 5 種供試竹葉中的香氣成分Table 4 The aroma components from 5 kinds of tested bamboo leaves

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

由表4 可知，從5 種供試竹葉中分別測(cè)出了66～88種數(shù)量不等的香氣成分，總共測(cè)出了138 種香氣成分，其中共同的香氣成分有39 種，在這些共有的香氣成分中，根據(jù)單體呈香物質(zhì)氣味特征的文獻(xiàn)記載[19-24]，賦予供試竹葉青香氣味的香氣成分有己醛、2-己烯醛、2-戊基呋喃、3-辛酮、乙酸葉醇酯、順式-2-戊烯-1-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、反式-3-己烯-1-醇、3-己烯-1-醇、順式-3-己烯-1-醇、反式,反式-2,4-己二烯醛、反式-2-己烯-1-醇、反式-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、反式,反式-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、1-辛醇、-環(huán)檸檬醛、苯乙醛、順式-3-己烯酸葉醇酯、香葉基丙酮、苯乙醇和苯甲酸葉醇酯，計(jì)24 種，占共有香氣成分總數(shù)的61.54%；賦予供試竹葉葉香氣味的香氣成分有2-己烯醛、順式-3-己烯-1-醇，計(jì)2種，占共有香氣成分總數(shù)的5.13%；賦予供試竹葉草香氣味的香氣成分有己醛、2-己烯醛、反式-3-己烯-1-醇、3-己烯-1-醇、順式-3-己烯-1-醇、反式-2-己烯-1-醇和順式-3-己烯酸葉醇酯，計(jì)7 種，占共有香氣成分總數(shù)的17.95%；賦予供試竹葉甜氣的香氣成分有3-辛酮、辛醛、反式,反式-2,4-己二烯醛、芳樟醇、1-辛醇、苯乙醛、水楊酸甲酯、苯甲醇、苯乙醇、-紫羅蘭酮和辛酸，計(jì)11種，占共有香氣成分總數(shù)的28.21%；賦予供試竹葉壤香的香氣成分有2-戊基呋喃、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、苯乙醛和苯乙醇，計(jì)5 種，占共有香氣成分總數(shù)的12.82%；賦予供試竹葉新鮮感的香氣成分有2-己烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、芳樟醇、1-辛醇和香葉基丙酮，計(jì)5 種，占共有香氣成分總數(shù)的12.82%。供試竹葉的嫩氣可能與反式-2-己烯-1-醇和順式-3-己烯酸葉醇酯有關(guān)，供試竹葉的木質(zhì)氣息可能與己醛、芳樟醇、香葉基丙酮和 -紫羅蘭酮有關(guān)，供試竹葉的脂肪或油脂氣息可能與庚醛、2-己烯醛、辛醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、反式-2-辛烯醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛和癸酸有關(guān)，供試竹葉的藥氣可能與順式-3-己烯-1-醇等香氣成分有關(guān)；供試竹葉的酸氣主要與乙酸、己酸和辛酸等揮發(fā)性羧酸有關(guān)；沉悶感可能與芳烴類(lèi)化合物有關(guān)。以上說(shuō)明專(zhuān)業(yè)品評(píng)人員對(duì)5 種竹葉品出的主要?dú)馕俄嵳{(diào)是有成分支撐和物質(zhì)依據(jù)的。

竹葉散發(fā)出的某種氣味韻調(diào)是由竹葉的多種香氣成分經(jīng)協(xié)同增效或抵消減弱等相互作用后最終給人呈現(xiàn)出的某種嗅覺(jué)感受。共同的香氣成分是這5 種竹葉具有相同氣味韻調(diào)的物質(zhì)基礎(chǔ)；互不相同的香氣成分（見(jiàn)表4）或呈現(xiàn)在某種共同氣味韻調(diào)的強(qiáng)度上，或抵消減弱某種氣味韻調(diào)，或呈現(xiàn)在某種竹葉與眾不同的特殊氣味韻調(diào)上。5 種供試竹葉中香氣成分的分類(lèi)及其成分種數(shù)和相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 5 種供試竹葉中香氣成分的類(lèi)別及其成分種數(shù)和相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)Table 5 Categories and their component numbers and relative contents statistics of aroma components from 5 kinds of tested bamboo leaves

由表5 可知，從5 種供試竹葉中檢出的香氣成分類(lèi)別數(shù)有8～9 個(gè)不等，其中除清甜竹葉有8 個(gè)類(lèi)別外，其他4 種竹葉均有9 個(gè)類(lèi)別。香氣成分種數(shù)最多和相對(duì)含量最高的類(lèi)別在毛竹葉、牛兒竹葉、硬頭黃竹葉和孝順竹葉中均為醛類(lèi)，其醛類(lèi)香氣成分種數(shù)在香氣成分總數(shù)中的占比分別為27.27%、22.73%、26.74%和24.05%；在清甜竹葉中則為醇類(lèi)，占比為26.51%；說(shuō)明不同竹葉的最主要香氣成分類(lèi)別不盡相同。醛類(lèi)是毛竹葉、牛兒竹葉、硬頭黃竹葉和孝順竹葉中香氣及其強(qiáng)度的最主要貢獻(xiàn)者，其次是醇類(lèi)；醇類(lèi)則是清甜竹葉中香氣及其強(qiáng)度的最主要貢獻(xiàn)者，其次是醛類(lèi)。總之，醛類(lèi)和醇類(lèi)是這5 種竹葉中香氣及其強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)類(lèi)別。在供試竹葉所有香氣成分的相對(duì)含量合計(jì)方面，毛竹葉最低，僅為65.49%，預(yù)示氣味強(qiáng)度可能最低，這與專(zhuān)業(yè)人員的品評(píng)結(jié)果一致。5 種供試竹葉中相對(duì)含量排前5 位的香氣成分見(jiàn)表6。

表6 5 種供試竹葉中相對(duì)含量前5 位的香氣成分Table 6 The aroma components with top 5 relative contents from 5 kinds of bamboo leaves

從表6 可知，在相對(duì)含量前5 位的香氣成分中若按香氣成分種數(shù)計(jì)，最主要的香氣成分類(lèi)別在硬頭黃竹葉為醛類(lèi)（2 個(gè)），在毛竹葉和牛兒竹葉為醛類(lèi)和醇類(lèi)（并列，各2個(gè)），在清甜竹葉和孝順竹葉為醇類(lèi)（3個(gè)）；若按相對(duì)含量小計(jì)，最高的香氣成分類(lèi)別在毛竹葉和清甜竹葉均為醇類(lèi)，分別為23.16%和37.22%，而在牛兒竹葉、硬頭黃竹葉和孝順竹葉則均為醛類(lèi)，分別為26.93%、35.70 %和29.68%；以上佐證了醛類(lèi)和醇類(lèi)香氣成分是這5 種竹葉中香氣及其強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)類(lèi)別。根據(jù)單體呈香物質(zhì)氣味特征的文獻(xiàn)記載[19-22,25]可知，含有青香氣息的香氣成分有反式-2-己烯醛（葉醛）、2-己烯醛、反式-3-己烯醛、-羅勒烯、3-己烯-1-醇、順式-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇等7 種，每種竹葉中含量最高的單一香氣成分均含有青香氣息，毛竹葉、牛兒竹葉、硬頭黃竹葉、清甜竹葉和孝順竹葉在相對(duì)含量前5 位的香氣成分中含有青香氣息的相對(duì)含量累計(jì)分別為41.83%、55.17%、44.50%、53.87%和50.67%，由此可知，含有青香氣息的香氣成分在5 種供試竹葉中相對(duì)含量均較高，說(shuō)明這5 種竹葉中的青香要比其他氣味強(qiáng)而且突出，這也與專(zhuān)業(yè)人員的品評(píng)結(jié)果一致。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)大熊貓喜歡的食物香氣韻調(diào)

圈養(yǎng)大熊貓母獸的常乳中有新鮮竹葉樣青香，并略帶甜氣[26]，說(shuō)明大熊貓從小就通過(guò)吸食母乳開(kāi)始接觸和感受新鮮竹葉樣青香和甜氣。隨著嗅覺(jué)功能的發(fā)育完善，新鮮竹葉樣青香和甜氣逐漸被大熊貓幼仔所熟悉并認(rèn)知為安全的食物氣味。根據(jù)作者以往的多次觀察，喂給大熊貓竹枝上的竹葉如果在室外活動(dòng)圈的食臺(tái)上放置時(shí)間較長(zhǎng)，特別是在氣溫較高的夏季，容易失水變干甚至卷曲，散失了竹葉的部分青香，也降低了竹葉的新鮮度，對(duì)大熊貓來(lái)說(shuō)就失去了竹葉氣味韻調(diào)的誘食性，也不再被大熊貓選擇食用。通過(guò)專(zhuān)業(yè)人員對(duì)放置較久的竹葉樣品的嗅感品評(píng)，其青香變淡，新鮮感變差，呈干葉或干草氣味，這可能是大熊貓不采食干竹葉的理由。圈養(yǎng)大熊貓喜食的蘋(píng)果有新鮮感，青香飄

溢，甜氣明顯[10]；胡蘿卜有新鮮感而且甜氣和青香相對(duì)突出[10]；新鮮玉米秸稈的甜氣濃郁，青香顯著[9]；蒸熟的窩窩頭甜香如蜜、濃郁[7]；試喂的佛肚竹稈、毛竹稈、牛兒竹稈、硬頭黃竹稈、清甜竹稈和孝順竹稈均有較明顯的青香、輕微的甜氣和新鮮感[6]。綜上所述，再結(jié)合表1 和表2 的結(jié)果，可以得知，來(lái)自竹葉的青香、甜氣和新鮮感是大熊貓喜歡的食物香氣韻調(diào)。作者還認(rèn)為在食物供給相對(duì)充足的圈養(yǎng)條件下竹葉的氣味韻調(diào)為大熊貓是否選擇采食的首要因素，也是評(píng)價(jià)喂給圈養(yǎng)大熊貓竹葉品質(zhì)的一個(gè)重要的非營(yíng)養(yǎng)性指標(biāo)。

3.2 圈養(yǎng)大熊貓對(duì)竹葉選擇性采食的氣味機(jī)理探討

本文所用的5 種供試竹葉不是大熊貓?jiān)谌斯わ曫B(yǎng)條件下普遍常喂的竹葉，試喂時(shí)間并非野生大熊貓選食竹葉的主要時(shí)期，在同時(shí)提供多種食物（3～5 種竹子包括稈和葉）的前提下，受試大熊貓憑借自己的嗅覺(jué)感知而自由地選擇某個(gè)竹種的莖稈或葉采食，這樣更能說(shuō)明供試竹葉的氣味韻調(diào)的誘食魅力。大熊貓的視覺(jué)較差，嗅覺(jué)發(fā)達(dá)，而嗅覺(jué)的感受對(duì)象是通過(guò)空氣擴(kuò)散的氣味，無(wú)論野生的大熊貓還是圈養(yǎng)的大熊貓主要依靠靈敏的嗅覺(jué)來(lái)尋覓食物[27-29]，采食前都要經(jīng)過(guò)嗅聞的識(shí)別過(guò)程，夜間尤為如此，這可能是大熊貓通過(guò)長(zhǎng)期地自然選擇與自身進(jìn)化而形成的食物安全防線和養(yǎng)成的攝食行為習(xí)慣。5 種供試竹葉氣味的共同屬性之一是飄逸、強(qiáng)度較高和透發(fā)性較好，說(shuō)明這5 種竹葉的氣味容易在空氣中擴(kuò)散，利于大熊貓感知；共同屬性之二是愉悅度中上等，有突出的青香、輕微的甜氣和新鮮感，這些氣味韻調(diào)為大熊貓所熟悉且認(rèn)知安全，是大熊貓喜歡的食物香氣韻調(diào)，能激發(fā)大熊貓的采食欲望，所以大熊貓嗅聞后才采食，這可能是大熊貓自冰川時(shí)代以來(lái)在不斷適應(yīng)已變化的自然環(huán)境過(guò)程中長(zhǎng)期積累并代代相傳的生存智慧之一。有沉悶感和藥氣等多種微弱雜味的孝順竹葉未被受試大熊貓一致認(rèn)可，出現(xiàn)了采食的個(gè)體和季節(jié)性差異，一方面說(shuō)明大熊貓的嗅覺(jué)很靈敏，另一方面說(shuō)明部分大熊貓個(gè)體對(duì)氣味感知的耐受性較強(qiáng)?？傊?，5 種供試竹葉的氣味韻調(diào)及其強(qiáng)度雖然不盡相同，但均有突出的青香、輕微的甜氣及新鮮感等氣味韻調(diào)，加之圈養(yǎng)大熊貓?jiān)谛崧勥@5 種竹葉之后均有不同數(shù)量的采食，因此這5 種竹葉散發(fā)出的突出的青香、輕微的甜氣及新鮮感是誘導(dǎo)圈養(yǎng)大熊貓采食的主要?dú)馕俄嵳{(diào)。

3.3 實(shí)際應(yīng)用建議

上述研究結(jié)果不僅在圈養(yǎng)大熊貓選擇竹葉采食的氣味機(jī)理方面具有一定的理論意義，而且在飼養(yǎng)實(shí)際中也頗具應(yīng)用價(jià)值，建議如下：

3.3.1 可在大熊貓飼養(yǎng)單位附近區(qū)域人工栽培硬頭黃竹等大熊貓喜食的竹種，既可作為圈養(yǎng)大熊貓的應(yīng)急食物來(lái)源，又可作為觀賞用竹和美化環(huán)境。

3.3.2 喂給大熊貓竹葉時(shí)最好用現(xiàn)砍的鮮嫩竹枝，且少喂勤添。若不能現(xiàn)砍現(xiàn)喂時(shí)，大熊貓飼養(yǎng)單位應(yīng)有竹枝竹葉低溫保鮮保濕的設(shè)備設(shè)施，因?yàn)橹袢~一旦散失水分，會(huì)造成青香、新鮮感等氣味韻調(diào)流失，對(duì)大熊貓來(lái)說(shuō)就缺乏誘食作用。若現(xiàn)砍現(xiàn)喂或低溫保鮮保濕，可保持竹葉氣味韻調(diào)的誘食性，能提高大熊貓對(duì)竹葉的食用率，也降低大熊貓的飼料成本。

3.3.3 在研制亞成體和成體大熊貓竹類(lèi)食物誘食劑時(shí)，應(yīng)遵照我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)和《食品用香料通則》(GB 29938—2013)的規(guī)定。表4 中除乙醇（可作溶劑）、3-戊酮、反式-2-丁烯醛、2-丁烯醛、3-戊醇、2-乙基噻吩、3-乙基噻吩、6-甲基-2-庚酮、順式-3-己烯酸甲酯、反式-3-己烯-1-醇乙酸酯、順式-2-戊烯-1-醇、3,3,5-三甲基環(huán)己酮、3-己烯-1-醇、2-十四烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、3,5-辛二烯-2-酮、亞芐基二甲基醚、甲酸辛酯、六氫假性紫羅蘭酮、戊酸苯甲酯、反式-3-己烯酸、2-己烯酸、2,4-二甲基苯酚、雪松醇、植酮和水楊酸葉醇酯26 種香氣成分物質(zhì)在我國(guó)不能添加使用外，其他單體呈香物質(zhì)均可依法依規(guī)并酌情酌量考慮應(yīng)用。

4 結(jié)論

圈養(yǎng)大熊貓的自由選擇采食試驗(yàn)結(jié)果表明，受試大熊貓?jiān)谛崧? 種供試竹葉（毛竹葉、牛兒竹葉、硬頭黃竹葉、清甜竹葉及孝順竹葉）之后均有不同數(shù)量的采食，但采食毛竹葉存在個(gè)體差異，采食孝順竹葉存在個(gè)體和季節(jié)性差異。嗅感品評(píng)結(jié)果表明，這5 種竹葉的氣味韻調(diào)總體上清新、飄移、強(qiáng)度較高、透發(fā)性較好、愉悅度中上等，均有多種氣味韻調(diào)，相同之處在于均有青香、葉香、草香、甜氣、新鮮感和嫩氣等氣味韻調(diào)，不同之處在于這些氣味韻調(diào)的相對(duì)強(qiáng)度大小或有木質(zhì)氣息等其他微弱的氣味。電子鼻測(cè)試的結(jié)果證明了這5 種竹葉間氣味韻調(diào)的差異性，可通過(guò)PCA 分析和LDA分析予以有效的區(qū)分。經(jīng)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)的香氣成分?jǐn)?shù)量毛竹葉66 種、牛兒竹葉88種、硬頭黃竹葉86 種、清甜竹葉83 種和孝順竹葉79種，醛類(lèi)和醇類(lèi)香氣成分是這5 種竹葉中香氣及其強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)類(lèi)別，證實(shí)了這5 種竹葉中多種氣味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。竹葉中突出的青香、輕微的甜氣和新鮮感是誘導(dǎo)圈養(yǎng)大熊貓選擇這5 種竹葉采食的主要?dú)馕俄嵳{(diào)。

致謝：峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站的李策宏工程師到供試竹種栽種處查看后核定竹種名稱(chēng)，陳緒玲工程師輔助竹種核名，青神縣熊貓館的楊平同志參加了供試竹種的大熊貓飼喂試驗(yàn)，西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的包清彬教授和成都大帝漢克生物科技有限公司的李松柏高級(jí)工程師、孔凌高級(jí)工程師、鄧虹工程師、趙仁仟同志參加了嗅感品評(píng)以及喻麟董事長(zhǎng)和李小兵總經(jīng)理給予了支持，江南大學(xué)食品學(xué)院的向琴博士生參加了電子鼻測(cè)試，中國(guó)科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心的胡靜副研究員在揮發(fā)性成分分析與推定方面提供了幫助，在此一并深表謝意！