王 景, 劉 晶, 魏旭靜, 杜亞飛, 房桂英, 李 林

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050000）

子宮內(nèi)膜癌是女性常見惡性腫瘤之一，近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢，具有病程發(fā)展迅速及平均生存時(shí)間短等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅女性健康。目前，對于子宮內(nèi)膜癌的治療，主要通過放療和化療等手段誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延長患者生存期的目的［1-3］。發(fā)掘有效抗癌的新活性成分，一直以來都是子宮內(nèi)膜癌研究的熱點(diǎn)，冬凌草甲素是中藥冬凌草的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用［4-5］。研究［6］表明：冬凌草甲素具有抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)由多基因、多因素介導(dǎo)的復(fù)雜過程［7］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA） 是一類調(diào)控型大分子RNA，在細(xì)胞發(fā)育、X 染色體沉默和調(diào)控轉(zhuǎn)錄等機(jī)體生命活動過程中發(fā)揮著重要作用。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)：lncRNA 在多種腫瘤中發(fā)生表達(dá)紊亂，如乳腺癌和食管癌等。其中， 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 （colon cancer associated transcriptor 1， CCAT1） 是近年來發(fā)現(xiàn)的在結(jié)腸癌組織中異常表達(dá)的lncRNA，其相對表達(dá)水平與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。目前國內(nèi)外關(guān)于lncRNA CCAT1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)的研究甚少。本研究通過觀察冬凌草甲素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)和癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，探討冬凌草甲素對子宮內(nèi)膜癌的作用及其機(jī)制，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。冬凌草甲素購于上海麥克林生化科技有限公司，二甲基亞砜（DMSO） 和DMEM 培養(yǎng)基購于美國Sigma 公司，胰蛋白酶和胎牛血清購于中國碧云天生物試劑公司，lncRNA CCAT1 由廣州銳博生物科技有限公司合成，RNA 提取試劑盒購于美國Mobio 公司，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒購于美國Invitrogen 公司。全自動凝膠成像系統(tǒng)購于英國Syngene 公司，Thermo ABI 2720 PCR 儀購于美國賽默飛世爾科技公司，Bio-Rad 550 酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10% 滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細(xì)胞，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 以0.25%胰蛋白酶消化傳代1 次。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的HEC-1B 細(xì)胞，配成3×105mL－1細(xì)胞懸液，100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。設(shè)對照組、陽性對照組，低、中和高劑量冬凌草甲素組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，陽性對照組加入2.5 mg·L－1的順鉑，低、中和高劑量冬凌草甲素組分別加入10、20 和40 μmol·L－1冬凌草甲素50 μL 孵育48 h，對照組只加入DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。48 h 后向每孔加入10 μL 新配制的5 g·L－1MTT，輕輕搖勻，孵育4 h，棄去上清，每孔再加入200 μL DMSO，低速振蕩30 min，使其完全溶解，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm 處各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組A 值/對照組A 值）× 100%，其中實(shí)驗(yàn)組包括低、中和高劑量冬凌草甲素組和陽性對照組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)生長期的HEC-1B 細(xì)胞，配成單細(xì)胞懸液，100 μL 接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，設(shè)對照組和低、中及高劑量冬凌草甲素組，陽性對照組加入2.5 mg·L－1順鉑，低、中和高劑量冬凌草甲素組分別加入20、40 和50 μmol·L－1冬凌草甲素50 μL 培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗，離心收集細(xì)胞，PBS 緩沖液清洗，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL－1，加入200 μL Binding Buffer 液，加入200 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI，搖勻，室溫下避光放置20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞劃痕愈合率取對數(shù)生長期的HEC-1B 細(xì)胞，配成3 × 105mL－1細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待80%細(xì)胞融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入含2%血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞單層貼壁長滿時(shí)，采用移液槍槍頭垂直劃痕，PBS 緩沖液沖洗。設(shè)對照組，陽性對照組，低、中和高劑量冬凌草甲素組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入2.5 mg·L－1的順鉑，低、中和高劑量冬凌草甲素組分別加入20、40 和50 μmol·L－1冬凌草甲素50 μL 培養(yǎng)24 h，對照組只加入DMEM 培養(yǎng)液。于倒置顯微鏡下觀察0 和24 h 時(shí)間點(diǎn)劃痕愈合程度，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率，以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。細(xì)胞劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度－24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度× 100%。

1.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力取對數(shù)生長期的HEC-1B 細(xì)胞，配成3×105mL－1細(xì)胞懸液，取100 μL 加入Transwell 上室，設(shè)對照組，陽性對照組，低，中和高劑量冬凌草甲素組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入2.5 mg·L－1的順鉑，低、中和高劑量冬凌草甲素組分別加入20、40 和50 μmol·L－1冬凌草甲素50 μL，對照組只加入DMEM 培養(yǎng)液。下室加入含F(xiàn)BS 的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，上室內(nèi)腫瘤細(xì)胞向下室聚集。24 h后，取出培養(yǎng)板，去上室內(nèi)的細(xì)胞，下室細(xì)胞用甲醇固定，采用0.1%結(jié)晶紫染色，沖洗封片，顯微鏡下對下室細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，記為穿膜細(xì)胞數(shù)，每組取5 個(gè)視野，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1表達(dá)水平設(shè)對照組，陽性對照組，低、中和高劑量冬凌草甲素組。陽性對照組加入2.5 mg·L－1順鉑，低、中和高劑量冬凌草甲素組分別加入20、40 和50 μ mol·L－1冬凌草甲素50μL培養(yǎng)細(xì)胞，取貼壁細(xì)胞，分別采用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì) 胞，于1 000 r·min－1離 心5 min，去上清液，PBS 緩沖液洗滌，離心，棄去上清液，加入細(xì)胞裂解液50 μL，混勻，按照試劑盒說明書提取總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA；以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。lncRNA CCAT1 引物序列：上游引物5'-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3'，下游引物5'-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3'。反應(yīng)條件：94 ℃、5 min 變性，35 個(gè) 循 環(huán)；94 ℃、1 min 變 性； 55 ℃、 1 min 退 火； 72℃、1 min 延 伸；72 ℃、7 min充分延伸；120 V、30 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA CCAT1 相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、劃痕愈合率、穿膜細(xì)胞數(shù)和lncRNA CCAT1 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HEC-1B 細(xì)胞增殖抑制率與低劑量冬凌草甲素組比較，中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞增殖抑制率明顯升高（P＜0.05）；與中劑量冬凌草甲素組比較，高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞增殖抑制率明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組HEC-1B 細(xì)胞凋亡率與對照組比較，陽性對照組和低、中及高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與低劑量冬凌草甲素組比較，中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與中劑量冬凌草甲素組比較，高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表1。

2.3 各組HEC-1B 細(xì)胞劃痕愈合率與對照組比較，陽性對照組和低、中及高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞劃痕愈合率均明顯降低（P＜0.05）；與低劑量冬凌草甲素組比較，中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低（P＜0.05）；與中劑量冬凌草甲素組比較，高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖1 和表2。

2.4 各組HEC-1B 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)與對照組比較，陽性對照組和低、中及高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與低劑量冬凌草甲素組比較，中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與中劑量冬凌草甲素組比較，高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖2 和表2。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率Tab. 1 Inhibitory rates of proliferation and apoptotic rates of cells in various groups (n=6,±s，η/%）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率Tab. 1 Inhibitory rates of proliferation and apoptotic rates of cells in various groups (n=6,±s，η/%）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with low dose of oridonin group；#P＜0.05 compared with medium dose of oridonin group.“—”：No data.

Group Apoptotic rate Control Positive control Oridonin(μmol·L－1)Low dose Medium dose High dose Inhibitory rate of proliferation—51.20±4.17 4.57±0.38 54.71±3.44*35.46±1.05*40.55±3.10*△44.82±2.31*△#18.41±2.17 32.01±3.56△45.24±3.82△#

圖1 各組HEC-1B 細(xì)胞遷移能力Fig.1 Migration abilities of HEC-1B cells in various groups

2.5 各組HEC-1B 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平與對照組比較，低、中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量冬凌草甲素組比較，中和高劑量冬凌草甲素組HEC-1B 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量冬凌草甲素組比較，高劑量冬凌草甲素組HEC-1B細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表3。

3 討 論

圖2 各組HEC-1B 細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫，×400）Fig.2 Invasion abilities of HEC-1B cells in various groups（Crystal violet,×400）

表2 各組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)Tab. 2 Scatch healing rates and number of transmembrane cells in various groups （n=3,±s）

表2 各組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)Tab. 2 Scatch healing rates and number of transmembrane cells in various groups （n=3,±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with low dose of oridonin group；#P＜0.05 compared with medium dose of oridonin group.

Group Control Positive control Oridonin(μmol·L－1)Low dose Medium dose High dose Scatch healing rate（η/%）84.3±7.7 34.8±5.3*Number of transmembrane cells(n)196±25 58±16*121±10*99±15*△74±11*△#66.4±7.1*51.6±6.1*△37.3±5.2*△#

lncRNA 是一種非編碼RNA轉(zhuǎn)錄因子，由200多個(gè)核苷酸組成，是一種重要的腫瘤調(diào)節(jié)因子［10］。lncRNA 的功能十分廣泛，對激活或抑制轉(zhuǎn)錄、修飾與沉默染色體等多個(gè)過程都具有調(diào)控作用。研究［11-12］表明： lncRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA 調(diào)控miRNAs 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如PVT1 和XIST 等，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用。lncRNA CCAT1在正常細(xì)胞損傷時(shí)表達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)可通過調(diào)節(jié)miRNAs 的下游作用靶點(diǎn)MYC 蛋白的激活促進(jìn)胃癌和肝癌等癌細(xì)胞增殖和遷移［13-16］。冬凌草甲素是香茶菜屬植物冬凌草的一種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎和抗菌等廣泛的藥理作用［17-19］。冬凌草甲素能夠通過誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)改變，調(diào)控腫瘤關(guān)鍵分子和相關(guān)信號通路，有效調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤作用［20-21］。

表3 各組HEC-1B 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of lncRNA CCAT1 in HEC-1B cells in various groups （n=3,±s）

表3 各組HEC-1B 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of lncRNA CCAT1 in HEC-1B cells in various groups （n=3,±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with low dose of oridonin group；#P＜0.05 compared with medium dose of oridonin group.

Group Control Positive control Oridonin(μmol·L－1)Low dose Medium dose High dose lncRNA CCAT1 1.13±0.24 0.96±0.15 0.66±0.13*0.47±0.08△*0.32±0.10*△#

本研究結(jié)果顯示：低、中和高劑量冬凌草甲素組細(xì)胞增殖抑制率明顯提高，細(xì)胞凋亡率明顯升高，劃痕愈合率明顯降低，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明不同劑量冬凌草甲素可抑制HEC-1B 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制其遷移和侵襲能力，具有劑量依賴性。采用不同劑量冬凌草甲素干預(yù)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細(xì)胞后，癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT1 表達(dá)水平明顯降低，說明冬凌草甲素能夠下調(diào)lncRNA CCAT1 表 達(dá) 水 平。lncRNA CCAT1 位 于染色體8q24.21 cMyc 基因增強(qiáng)子區(qū)域，cMyc 能夠通過與lncRNA CCAT1 啟動子區(qū)域的特定區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)lncRNA CCAT1 轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)增殖能力，同時(shí)還可抑制細(xì)胞凋亡［22］，因此本文作者推測，冬凌草甲素抑制HEC-1B 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能與介導(dǎo)lncRNA CCAT1 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，冬凌草甲素可通過抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CCAT1 表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，本研究為冬凌草甲素抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的研究提供了理論依據(jù)。