■杜寶龍 王 璇 唐德富* 年 芳，2 邢露梅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070)

我國(guó)是世界上主要的玉米種植國(guó)之一，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)，2018 年中國(guó)玉米產(chǎn)量達(dá)2.71 億噸，位居世界第二[1]。雖然我國(guó)玉米產(chǎn)量相對(duì)豐富，但是有相當(dāng)一部分玉米原料被用于生產(chǎn)生物燃料和工業(yè)制品，導(dǎo)致畜牧養(yǎng)殖用玉米需求相對(duì)緊張[2-3]。每年10 月份大量新產(chǎn)玉米上市，許多飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)為了降低生產(chǎn)成本往往會(huì)增加新產(chǎn)玉米在飼料配方中的添加比例或完全利用新產(chǎn)玉米替代舊玉米，而在生產(chǎn)中已發(fā)現(xiàn)使用新產(chǎn)玉米后，肉仔雞會(huì)產(chǎn)生一系列營(yíng)養(yǎng)、病理問(wèn)題，如腹瀉、飼料轉(zhuǎn)換率下降、死淘率升高、糞便中可見(jiàn)完整的玉米顆粒等，生產(chǎn)上把這種現(xiàn)象稱為“過(guò)料綜合征”或“腸毒綜合征”[4]。早期研究也發(fā)現(xiàn)，新產(chǎn)玉米熟化不完全，缺乏后熟期，因此其自身抗性淀粉含量較高。抗性淀粉黏度大，在小腸中不易消化，在大腸中易被微生物利用產(chǎn)生毒素，動(dòng)物攝食過(guò)多時(shí)，會(huì)引起消化不良甚至腹瀉[5]。此外肉仔雞腸道中分布大量微生物，與宿主共同構(gòu)成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，互利共生，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、分布、代謝以及機(jī)體免疫，并影響動(dòng)物生長(zhǎng)和健康[6-7]。有研究表明飼糧中不同類型碳水化合物會(huì)影響宿主腸道微生物的數(shù)量和相對(duì)菌群的變化[8-10]。然而國(guó)內(nèi)外關(guān)于飼喂新產(chǎn)玉米飼糧對(duì)肉仔雞腸道微生物區(qū)系影響的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此本試驗(yàn)通過(guò)評(píng)估日糧添加不同比例新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能和腸道微生物區(qū)系的影響，以期從腸道微生物區(qū)系的角度解析新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞腸道存在的潛在影響，為新產(chǎn)玉米在肉仔雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用玉米為甘肅當(dāng)?shù)攸S色品系玉米，收獲之后晾曬12 d，使得水分低于14%，即得到新產(chǎn)玉米樣品（水分含量為12.89%，風(fēng)干基礎(chǔ)）。舊玉米（水分含量為12.03%，風(fēng)干基礎(chǔ)）與新玉米品系和產(chǎn)地均相同，置于儲(chǔ)藏室保存約14個(gè)月，儲(chǔ)藏室保持通風(fēng)干燥，并且每隔半年用磷化氫殺蟲一次。試驗(yàn)用科寶肉雞購(gòu)自寶雞大成禽業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧組成

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取288 只1 日齡健康科寶肉雞仔公雛，隨機(jī)分為4組，每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12 只雞，分別飼喂對(duì)照組（占飼糧總量60%的舊玉米）、處理Ⅰ組（占飼糧總量40%舊玉米+占飼糧總量20%新玉米）、處理Ⅱ組（占飼糧總量20%舊玉米+占飼糧總量40%新玉米）、處理Ⅲ組（占飼糧總量60%新玉米）4種日糧。試驗(yàn)期為42 d，分前期（1～21 d）和后期（22～42 d）兩階段進(jìn)行。

基礎(chǔ)飼糧配方參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)中肉雞營(yíng)養(yǎng)成分推薦值配制，計(jì)算配方時(shí)，飼料原料中粗蛋白、鈣、磷的含量使用實(shí)測(cè)值，其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)參考中國(guó)飼料數(shù)據(jù)庫(kù)2017年中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表。試驗(yàn)飼糧配方組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧配方組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞舍為封閉式三層籠養(yǎng)舍，各籠上下溫度變化為±2 ℃，各處理各重復(fù)之間充分考慮位置效應(yīng)安排。溫度控制采用水暖控溫，在飼喂前期溫度由35 ℃逐漸遞減為24 ℃，后期溫度恒定控制在24 ℃。飼養(yǎng)期間自由飲水，自由采食，每天23 h 連續(xù)光照。免疫程序嚴(yán)格按照科寶肉仔雞免疫管理手冊(cè)執(zhí)行。

1.4 生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)期準(zhǔn)確記錄各重復(fù)組雞只采食量以及拋撒料重量，觀察雞只死亡情況，記錄死淘數(shù)量。分別于0、21、42 日齡以重復(fù)為單位稱量體重，肉仔雞稱重前禁食12 h，自由飲水，以重復(fù)為單位稱量體重。計(jì)算各處理組平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）。

1.5 腸道食糜樣品采集與微生物測(cè)序

試驗(yàn)雞42 日齡時(shí)，分別從對(duì)照組和處理Ⅲ組各挑選體重與平均體重接近的6 只公雞（每個(gè)重復(fù)1 只雞）屠宰，剝離其回腸和盲腸，采取腸道內(nèi)容物2 mL于凍存管中，液氮速凍，-80 ℃保存。高通量測(cè)序選擇細(xì)菌16S V3～V4區(qū)，測(cè)序工作由北京諾和致源科技有限公司完成。

1.5.1 微生物DNA提取和PCR擴(kuò)增

樣本基因組DNA 采用十二烷基磺酸鈉（SDS）法提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 濃度和純度。取適量DNA 樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。然后以稀釋后的DNA 為模板，帶有barcode的特異引物341-F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAGG-3’)和806-R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物。

1.5.2 PCR產(chǎn)物混樣純化與文庫(kù)構(gòu)建

利用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度等量混勻，繼續(xù)使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶進(jìn)行割膠回收。使用建庫(kù)試劑盒（TruSeq? DNA PCRFree Sample Preparation Kit）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建文庫(kù)經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量，合格后使用HiSeq2500 PE250上機(jī)測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理，肉仔雞生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0 單因素方差分析模塊，差異顯著時(shí)使用Duncan's法進(jìn)行多重比較。微生物測(cè)序原始數(shù)據(jù)使用FLASH（V1.2.7）對(duì)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到原始Tag 序列，然后參照Qiime（V1.7.0）的Tags質(zhì)量控制流程和Gold database數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得有效Tag 序列。利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）對(duì)有效Tag 序列聚類，默認(rèn)以97%的相似性將序列聚類為OTUs（Operational Taxonomic Units），用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，獲得科水平和屬水平的分類信息。利用Qiime 軟件（Version 1.7.0）計(jì)算α多樣性指數(shù)，β多樣性Unifrac距離，并使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，PCoA 圖。腸道微生物兩組之間α多樣性、菌群豐度分析采用SPSS 21.0 軟件T 檢驗(yàn)?zāi)K完成。顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 飼糧添加新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響(見(jiàn)表2)

表2 飼糧添加新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可以看出，隨著飼糧中新產(chǎn)玉米添加比例增加，肉仔雞平均日增重呈下降趨勢(shì)，而料重比呈增加趨勢(shì)，且處理Ⅲ組前期、后期肉仔雞平均日增重均顯著低于對(duì)照組及處理Ⅰ組（P＜0.05），而料重比前期、后期顯著高于對(duì)照組及處理Ⅰ組（P＜0.05）。各處理組間采食量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 肉仔雞回腸、盲腸微生物16S rRNA 測(cè)序質(zhì)量分析和α多樣性估計(jì)

從24 個(gè)肉仔雞回腸、盲腸微生物樣本中總共獲得了有效Tag 序列1432 008 條。對(duì)樣本測(cè)序結(jié)果按照序列距離聚類之后，平均每個(gè)樣本得到758 個(gè)OTUs?；啬c和盲腸稀釋曲線結(jié)果顯示，隨著每個(gè)處理組測(cè)序數(shù)量的增加，OUT 數(shù)目已漸趨于飽和（曲線趨于平緩），說(shuō)明測(cè)序深度足以覆蓋到樣本中的所有物種（見(jiàn)圖1）。另外，回腸、盲腸所有樣品的覆蓋率都達(dá)到了0.99，表明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好（表3、表4）?；啬cα多樣性指數(shù)顯示，對(duì)照組和處理組間Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Chao1指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表3）。盲腸α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示處理組Simpson 指數(shù)顯著高于對(duì)照組，表明處理組物種多樣性較對(duì)照組豐富（P＜0.05）（見(jiàn)表4）。

圖1 回腸、盲腸微生物16S rRNA基因測(cè)序稀釋曲線

表3 新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞回腸α多樣性指數(shù)的影響

表4 新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞盲腸α多樣性指數(shù)的影響

2.3 新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞回腸和盲腸微生物的影響

通過(guò)對(duì)肉仔雞回腸和盲腸微生物門水平序列分類鑒定總共發(fā)現(xiàn)了44個(gè)菌門。其中對(duì)照組與處理組回腸中的優(yōu)勢(shì)菌門分為Firmicutes（96.48%、77.46%）和Proteobacteria（3.55%、8.95%）（圖2a），盲腸的優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes（68.08%、88.56%）和Proteobacteria（29.14%、7.21%）（圖3a）。在屬水平上，肉仔雞回腸和盲腸總共鑒定出了531 個(gè)菌屬。對(duì)照組與處理組回腸優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus（1.83%、58.19%），Rom?boutsia（19.61% 、2.16%）和Candidatus_Arthromitus（1.73%、4.41%）（圖2b），盲腸優(yōu)勢(shì)菌屬為Escherichia-Shigella（2.66%、2.87%），F(xiàn)aecalibacterium（4.94%、12.52%）和Lachnoclostridium（6.08%、7.91%）（圖3b）。

圖2 回腸物種豐度分布柱狀圖門水平（a）屬水平（b）

圖3 盲腸物種豐度分布柱狀圖門水平（a）屬水平（b）

2.4 細(xì)菌群落組成差異

回腸門水平上微生物相對(duì)豐度結(jié)果見(jiàn)表5。表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，處理組顯著降低了Firmicutes的相對(duì)豐度（P＜0.05），顯著增加了Proteobacteria 和Acti?nobacteria的相對(duì)豐度（P＜0.05）。在屬水平上，處理組顯著增加了Lactobacillus 的相對(duì)豐度，顯著降低Fae?calibacterium 的相對(duì)豐度（P＜0.05）。而在盲腸門水平上（表6），F(xiàn)irmicutes 和Proteobacteria 的相對(duì)豐度與回腸相對(duì)豐度呈相反的趨勢(shì)，處理組Firmicutes 的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，Proteobacteria 相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在屬水平上（表6），處理組盲腸Lactobacillus、Faecalibacterium相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Romboutsi 相對(duì)豐度顯著卻低于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，使用加權(quán)的Unifrac 矩陣距離的β多樣性分析結(jié)果通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，處理組和對(duì)照組間群落組成差異較大（P＜0.05）（圖4）。

表6 新產(chǎn)玉米對(duì)盲腸微生物門、屬相對(duì)豐度的影響

圖4 回腸和盲腸微生物主坐標(biāo)軸分析（PCoA）回腸微生物PCoA（a）盲腸微生物PCoA（b）

3 討論

3.1 飼糧添加新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

玉米由于其粗蛋白和粗纖維含量較低，同時(shí)適口性好、消化率高，常被用作為肉仔雞養(yǎng)殖中最主要的能量飼料，通常在畜禽飼料配方中占比高達(dá)50%～70%。因此玉米品質(zhì)的好壞將會(huì)直接對(duì)肉仔雞生產(chǎn)產(chǎn)生較大的影響。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)添加60%新產(chǎn)玉米顯著降低了前期和后期肉仔雞平均日增重，提高了料重比，這與前人研究結(jié)果類似[11]。新產(chǎn)玉米當(dāng)中存在較多的抗性淀粉，在儲(chǔ)存一段時(shí)間之后，玉米當(dāng)中的抗性淀粉含量會(huì)降低，隨著新產(chǎn)玉米添加比例的上升，飼糧當(dāng)中所含抗性淀粉含量同時(shí)也會(huì)上升[12]，因此導(dǎo)致肉仔雞平均日增重下降、料重比增加的原因可能是新產(chǎn)玉米熟化不完全所致。Yin[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加新產(chǎn)玉米會(huì)顯著降低肉仔雞的料重比。在本試驗(yàn)中，肉仔雞料重比隨著添加比例的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，且試驗(yàn)Ⅰ組新產(chǎn)玉米添加組顯著高于處理Ⅲ組，這說(shuō)明新產(chǎn)玉米添加比例越高，生產(chǎn)水平越差。肉仔雞是“為能而食”動(dòng)物，通常是通過(guò)增加飼料采食量或攝入量來(lái)滿足機(jī)體對(duì)能量的需求，本試驗(yàn)中也觀察到此現(xiàn)象，但各組間采食量差異不顯著，同時(shí)也說(shuō)明肉仔雞通過(guò)增加采食量來(lái)改善生長(zhǎng)性能的調(diào)節(jié)能力有限。因此在新產(chǎn)玉米使用過(guò)程中，應(yīng)該合理控制好添加量，以抵御新產(chǎn)玉米帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。

3.2 飼糧添加新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞回腸、盲腸微生物區(qū)系的影響

認(rèn)識(shí)新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞腸道微生物群落的影響，對(duì)于解析新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能和腸道健康造成負(fù)面影響的機(jī)制，合理利用新產(chǎn)玉米、提高養(yǎng)殖收益具有重要意義。田亞?wèn)|等[14]研究結(jié)果表明，肉仔雞腸道微生物多樣性及細(xì)菌群落會(huì)受到飼喂飼料來(lái)源的影響，其中玉米飼糧組較大米飼糧組微生物多樣性低，優(yōu)勢(shì)菌群高。本試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)處理組顯著增加了肉仔雞盲腸Simpson 指數(shù)，且其盲腸和回腸Shannon指數(shù)、Chao1 指數(shù)也均呈現(xiàn)出高于對(duì)照組的趨勢(shì)，這說(shuō)明新產(chǎn)玉米使得肉仔雞腸道微生物結(jié)構(gòu)更加趨于多樣化。通常情況下，微生物越趨于多樣化越有益于機(jī)體健康，也被認(rèn)為是腸道微生物群落成熟的標(biāo)志[15-16]。但是多樣化的微生物區(qū)系并不一定對(duì)機(jī)體健康有利[17]，有研究結(jié)果表明，高度多樣化的微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)機(jī)體發(fā)育產(chǎn)生不良影響[18-19]。

本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果基本一致[20-21]，F(xiàn)irmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria是處理組和對(duì)照組回腸和盲腸的優(yōu)勢(shì)菌門。Proteobacteria常被當(dāng)做腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)和疾病診斷的潛在標(biāo)志菌[22]。而Actinobacteria是導(dǎo)致過(guò)度肥胖、炎癥性腸炎（IBD）和腸易激綜合征（IBS）等疾病腸道中的主要優(yōu)勢(shì)菌[23]。Firmicutes 的代謝產(chǎn)物主要是短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸的主要功能是參與膽固醇的合成，降低腸胃pH 值，抑制病原菌的生長(zhǎng)[24]。另外有研究表明腸道中Firmicutes的豐度減少，Proteobacteria 的豐度增加，會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生不良影響[25]。在本試驗(yàn)中，處理組回腸Firmicutes豐度顯著低于對(duì)照組，Proteobacteria 高于對(duì)照組，表明新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞回腸產(chǎn)生了不良影響，這與之前研究結(jié)果一致[2]。而處理組盲腸Firmicutes 豐度顯著高于對(duì)照組，Proteobacteria 顯著低于對(duì)照組，這與前人研究結(jié)果不一致，推測(cè)可能原因與盲腸中某些特定的菌群影響有關(guān)，但是具體原因還有待開(kāi)展進(jìn)一步研究。有研究結(jié)果表明，盲腸某些特定菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)其他菌種有拮抗或促進(jìn)作用的物質(zhì)，例如細(xì)菌素和有機(jī)酸等[26-27]。Lactobacillus 是人們普遍認(rèn)為的益生菌，它能通過(guò)激活細(xì)胞分裂蛋白激酶（MAPK）,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞抗炎癥反應(yīng)，往往Lactobacillus 的數(shù)量與抗炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[28]。關(guān)于Faecalibacterium的研究比較多，通常被認(rèn)為與其慢性腸炎、IBS和節(jié)段性腸炎的發(fā)生相關(guān)[29]。有研究結(jié)果表明，在腸激綜合征患者體內(nèi)，F(xiàn)aecalibacterium 的表達(dá)水平較低，而在節(jié)段性腸炎患者體內(nèi)Faecalibacterium 的表達(dá)水平較高[30]。也有研究結(jié)果顯示肉仔雞腸毒綜合征的原因之一是由于腸道菌群失調(diào)所致[31]。在本試驗(yàn)中處理組改善了回腸Lactobacillus的豐度，降低了Faecalibac?terium的相對(duì)豐度；增加了盲腸Lactobacillus和Faecal?ibacterium 的相對(duì)豐度，表明新產(chǎn)玉米在一定程度上對(duì)肉雞回腸和盲腸均有損害作用，并且會(huì)導(dǎo)致肉雞腸毒綜合征或其他腸道疾病的發(fā)生，同時(shí)處理組中Lac?tobacillus豐度升高，也側(cè)面說(shuō)明新產(chǎn)玉米可能與腸上皮炎癥反應(yīng)加劇有關(guān)。Romboutsia與人類健康息息相關(guān)，Mangifesta[33]比較了結(jié)直腸癌患者與健康人腸道微生物數(shù)量之后，發(fā)現(xiàn)Romboutsia 在健康腸道中含量較高，而在結(jié)直腸癌患者組織內(nèi)豐度顯著降低[32]。另外Romboutsia 還可以利用其他微生物釋放的宿主源糖，表明Romboutsia 依賴于黏液降解微生物。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)玉米降低了Romboutsia 的豐度，在一定程度上說(shuō)明，新產(chǎn)玉米對(duì)肉仔雞盲腸微生物區(qū)系也有負(fù)面影響，主要與微生物釋放的宿主源糖對(duì)Romboutsia 的影響密切相關(guān)。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，隨著飼糧中新產(chǎn)玉米添加比例的提高，肉仔雞生長(zhǎng)性能有下降趨勢(shì)，含60%新產(chǎn)玉米飼糧肉仔雞體增重顯著降低，料重比顯著提高，且回腸中Proteobacteria、Actinobacteria 和Lactobacillus 顯著增加，盲腸中Firmicute、Lactobacillus和Faecalibacte?rium菌豐度顯著增加，并且對(duì)腸道微生物區(qū)系產(chǎn)生了不良影響。