楊 夢(mèng),王 鵬,袁 輝,劉曉青,周海健，徐曉倩,熊長(zhǎng)輝,黃星魁,謝 昀,潘歡弘

巴爾通體病是一種人獸共患病，其病原體是巴爾通體。巴爾通體是一群寄生于哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的革蘭陰性、營(yíng)養(yǎng)要求苛刻、兼性需氧桿菌,可引起貓抓病、戰(zhàn)壕熱、卡里翁氏病、心內(nèi)膜炎、視神經(jīng)炎菌血癥等疾病[1]。作為一類新發(fā)傳染病病原體，巴爾通體的自然宿主包括鼠、兔、貓、犬、蝙蝠、牛、鹿、麋鹿等。為了解江西省鼠類動(dòng)物中巴爾通體攜帶情況，本研究于2018-2019年采集鼠形動(dòng)物肝、脾組織進(jìn)行巴爾通體分離培養(yǎng)，并對(duì)獲得的巴爾通體菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序和基因多態(tài)性分析，為巴爾通體感染的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源 本研究2018-2019年利用鼠傳疾病監(jiān)測(cè)項(xiàng)目采集了130只鼠形動(dòng)物的肝、脾組織。其中銅鼓縣62只、廣信區(qū)26只、橫峰縣22只、南城縣12只、廣豐區(qū)8只。

1.2試劑及儀器 胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，DNA核酸提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；組織研磨器Tissuelyser購(gòu)自QIAGEN公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)NUAIRE公司，PCR擴(kuò)增儀、成像儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1樣本采集 用鼠籠或鼠夾捕獲鼠形動(dòng)物，所有的鼠形動(dòng)物依據(jù)外形(體長(zhǎng)、體型、毛色、耳長(zhǎng)、尾長(zhǎng))、頭骨、牙齒的特征進(jìn)行分類鑒定，然后無(wú)菌操作采集肝、脾臟器，置含有1 mL保存液的2.0 mL凍存管中，-80 ℃保存。

1.3.2菌株分離培養(yǎng)和鑒定 每份樣本無(wú)菌取約25 mg肝或脾組織，加入600 μL TSB后，用組織研磨器研碎，混勻，吸取 0.2 mL組織懸液接種于含 5%脫纖維羊血的TSA平板上，置于36 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后，挑取疑似菌落進(jìn)行鑒定，直至第20 d。

1.3.3屬水平特異性基因的PCR檢測(cè) 挑取適量菌落用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，方法參照說(shuō)明書(shū)步驟。屬水平特異性基因PCR擴(kuò)增目的基因?yàn)間ltA，引物序列、反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[2]。

1.3.4全基因組測(cè)序和序列分析 全基因組測(cè)序委托北京博鰲鷹飛生物科技有限公司完成。參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行序列處理和分析、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建[3]。本研究中完成測(cè)序的14株巴爾通體基因組序列已提交國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心，被接收錄入微生物組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，項(xiàng)目編號(hào)為NMDC10017684。另外從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov)下載已公布的30株巴爾通體的全基因組序列作為參考序列納入分析。

2 結(jié) 果

2.1攜帶巴爾通體的鼠形動(dòng)物構(gòu)成 本次所捕獲的有黑線姬鼠、黃毛鼠、社鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱等鼠形動(dòng)物。其中野鼠84只，以黑線姬鼠為主，占64.62%；家鼠46只，以褐家鼠為主，占35.38%。廣信區(qū)、橫峰縣、銅鼓縣以黑線姬鼠為主，南城縣均為褐家鼠。從130只鼠類動(dòng)物的組織樣本中分離巴爾通體14株，總攜帶率為10.77%。黃毛鼠攜帶率最高(2/6)，其次為黑線姬鼠(8/72)、褐家鼠(3/27)、臭鼬鼱(1/12)(表1)。

表1 江西省鼠形動(dòng)物中巴爾通體檢出率Tab.1 Bartonella infection in myomorphs in Jiangxi Province

2.2巴爾通體分離培養(yǎng)與PCR結(jié)果 130份組織樣本進(jìn)行巴爾通體分離培養(yǎng)，檢出14株疑似菌株。培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)3～5 d后可見(jiàn)灰白色，略透明，邊緣光滑或粗糙的圓形凸起菌落，革蘭染色鏡檢為陰性小桿菌。PCR結(jié)果：14株疑似菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，均獲得379 bp的擴(kuò)增條帶，判斷為gltA基因陽(yáng)性(圖1)。

1、18：DL1000 Marker；2-15：疑似菌株；16：陰性對(duì)照(去離子水)；17：陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性參考菌株提取的核酸)。圖1 疑似菌株P(guān)CR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of suspected strains

2.3全基因組分析 將本研究分離的14株巴爾通體進(jìn)行全基因組測(cè)序，將序列和公共數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的26個(gè)不同種的30株巴爾通體全基因組構(gòu)建聚類樹(shù)(圖2)?？傮w而言，相同的種在同一分支，本研究分離的14株巴爾通體分布在5個(gè)不同的分支，提示分為5種基因型。根據(jù)與30株參考菌株全基因組序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系，可以推測(cè)分支2的4株菌為Bartonellatribocorum，其余4個(gè)分支的10株巴爾通體沒(méi)有同26個(gè)種的菌株序列聚在一起。分支2包含的4株菌分離自3個(gè)縣的3種宿主，分支4包含的4株菌分離自2個(gè)縣的2種宿主，分支5包含的4株菌分離自3個(gè)縣的1種宿主。

圖2 14株本研究分離菌株與30株巴爾通體參考菌株全基因組序列基因多態(tài)性分析Fig.2 Analysis of gene polymorphisms of 14 Bartonella isolates obtained in this study and 30 reference strains of Bartonella on the basis of whole genome sequences

3 討 論

巴爾通體是一類古老又新鮮的人獸共患病病原體，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究均有從不同宿主分離巴爾通體的文獻(xiàn)報(bào)道。國(guó)外研究報(bào)道英國(guó)、美國(guó)東南部巴爾通體的鼠形動(dòng)物帶菌率較高，分別為 62.20%和 42.20%[4-5]。我國(guó)已在福建、黑龍江、內(nèi)蒙古、浙江、寧夏、廣西、海南、山東、廣東、上海、云南、河南、青海、山西等省分別在鼠、貓、犬、華南虎、蜱、蚤中分離或檢測(cè)出巴爾通體病原菌[2,6-13]。

在本次研究中，江西省首次從鼠類動(dòng)物中分離到巴爾通體病原體，獲得江西省鼠形動(dòng)物巴爾通體的攜帶率及基因序列，攜帶率低于廣東(19.47%)[14]、浙江(15.20%)[9]、福建(12.34%)[1]，高于廣西(2.3%)[11]、海南(9.2%)[12]，填補(bǔ)江西省巴爾通體攜帶的研究空白。本次捕獲的鼠種有黑線姬鼠、黃毛鼠、社鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱，陽(yáng)性檢出以野鼠(黑線姬鼠、黃毛鼠)為主，其次是褐家鼠、臭鼬鼱，提示攜帶巴爾通體的鼠形動(dòng)物呈多樣性。野鼠主要分布于農(nóng)田、山坡、丘陵灌木等生存環(huán)境，這些生存環(huán)境往往是人類生產(chǎn)生活的主要場(chǎng)所，有文獻(xiàn)報(bào)道野鼠的棲息地往往是巴爾通體的自然疫源地，使得人類感染的幾率大大增加，應(yīng)引起關(guān)注[15]。

本次基因組序列研究中，巴爾通體基因型分布在5個(gè)不同的分支，即提示有5種不同基因型的巴爾通體，表明江西鼠形動(dòng)物巴爾通體基因多樣性大，種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜；其中分支2的4株巴爾通體與特利波契巴爾通體(B.tribocorum)聚集成簇，分離自黑線姬鼠、黃毛鼠、褐家鼠3種鼠種，表明宿主動(dòng)物廣泛。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[16]報(bào)道這種基因型分布于我國(guó)云南、福建、海南、廣東、臺(tái)灣地區(qū)，與人類巴爾通體病有關(guān)，可引起貓抓病、菌血癥、心內(nèi)膜炎、發(fā)熱等[17]。其余4個(gè)分支的10株巴爾通體沒(méi)有同26個(gè)種的菌株序列聚在一起，提示與參考菌株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。目前已公布全基因組序列的巴爾通體有26個(gè)種，還需要測(cè)序獲得更多種的巴爾通體補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)，以建立全面的巴爾通體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，用于種的鑒定。同一分支的巴爾通體分離自不同的地區(qū)、不同的宿主，不存在地區(qū)或者宿主特異性，提示不同地區(qū)、不同宿主間存在菌株的交流和傳播。

基于江西省鼠形動(dòng)物巴爾通體的宿主、基因型的多樣性以及鼠形動(dòng)物宿主攜帶與致病相關(guān)的基因型，作為潛在病原體導(dǎo)致人類感染巴爾通體疾病的風(fēng)險(xiǎn)加大。同時(shí)隨著生態(tài)環(huán)境的不斷改變，快捷的交通，人類的頻繁活動(dòng)，鼠形動(dòng)物通過(guò)與其他動(dòng)物及人類的密切接觸可能把攜帶的巴爾通體傳播給其他宿主，并造成人類巴爾通體病的隱性感染，因此，為應(yīng)對(duì)不斷增長(zhǎng)的巴爾通體引起感染的疾病的流行，應(yīng)加強(qiáng)了解巴爾通體的流行特征、致病性、遺傳多樣性，加強(qiáng)鼠形動(dòng)物間巴爾通體的調(diào)查研究，并采取預(yù)防措施加以控制。

利益沖突：無(wú)